mag-1基因与肿瘤细胞转移的相关性研究

目的:探讨mag-1基因与肿瘤细胞转移的关系.方法:检测mag-1在人肺巨细胞癌高低转移细胞株PLA801D与PLA801C、肺癌高低转移细胞株A549与H1299及乳腺癌高低转移细胞株MCF-7与MDA-MB-231中mag-1的表达水平;检测构建的mag-1正反义真核表达载体转染细胞后mag-1表达水平的变化;将mag-1正义表达载体分别转染低转移细胞株PLA801C及MCF-7并筛选出稳定克隆;研究mag-1过表达对细胞形态、增殖、迁移、黏附及侵袭等生物学行为的影响.结果:高转移细胞株PLA801D中mag-1的mRNA及蛋白表达水平均显著高于低转移细胞株PLA801C中mag-1的表达水平,乳腺癌高低转移细胞株中mag-1的蛋白表达水平也有明显的差异;过表达mag-1细胞的形态及增殖能力没有发生改变,而细胞的黏附、迁移及侵袭能力增强.结论:mag-1可能促进肿瘤细胞的转移.     

siRNA对骨肉瘤细胞细胞周期及survivin表达的影响

目的 构建人survivin特异性siRNA,探讨其对骨肉瘤细胞MG63细胞周期及survivin表达的影响.方法 构建survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系,以Western blot法检测survivin蛋白表达变化,透射电镜、Hoechst染色检测细胞凋亡情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体PsiS,获得了稳定转染的细胞系.与正常MG63细胞、阴性对照细胞相比,MG63/PsiS细胞中survivin蛋白表达减少,部分细胞核致密浓染或碎块状浓染,凋亡率增加了7倍,而G2/M期细胞减少近50%.结论 特异性siRNA能够明显抑制survivin基因在MG63细胞中的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.     

Schlafen2基因在细胞中的表达及其生物学特性研究

目的:建立Schlafen2(Slfn2)基因稳定表达的细胞系以进一步研究其生物学功能.方法:构建pEGFP- Slfn2真核表达载体;瞬时转染pEGFP- Slfn2载体及其对照载体于NIH/3T3细胞,观察细胞中Slfn2基因的表达及分布;稳定转染pEGFP-Slfn2及其对照空载体于NIH/3T3细胞,G418筛选获得抵制的细胞株,用Northern印迹进一步鉴定Slfn2在各细胞株中的表达情况;利用细胞生长曲线和Transwell细胞侵袭实验检测Slfn2对细胞增殖及迁移能力的影响.结果:本研究获得了稳定表达Slfn2的细胞株,该基因表达的蛋白在细胞核及细胞浆均有分布;稳定表达该基因的细胞株的增殖及迁移能力均显著降低.结论:Slfn2基因可能是一个潜在的肿瘤抑制基因.     

EOLA1基因小干扰RNA载体构建及其干扰效应检测

目的 构建人类新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)特异性的小干扰RNA表达载体,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白(GFP)-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2／EOLA1,并转染人ECV304细胞株,G418压力筛选获得稳定表达株;针对靶基因EOLA1,设计靶点特异性的寡核苷酸,插入pSlincer3．1／H1质粒。转染重组质粒到稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,通过观察转染细胞绿色荧光的强弱和Westem blot实验检测靶基因的抑制情况。结果 获得了稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的细胞株,构建的小RNA干扰质粒siEOLA1能够抑制靶基因EOLA1的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

稳定转染小鼠IL-17全长基因的乳腺癌细胞株的建立及基因转染对4T1细胞的影响

目的建立稳定转染小鼠IL-17基因全长的小鼠乳腺癌4T1细胞株,并进行鉴定。方法脂质体法将携带小鼠IL-17基因全长的真核表达载体pcDNA3．1转染小鼠乳腺癌细胞4T1,经G418筛选出稳定表达IL-17的细胞株;镜下观察细胞形态,RT-PCR法、Western印迹和激光共聚焦法检测目的基因和蛋白的表达;收集转染和未转染IL．17的4T1细胞的培养上清,分别与巨噬细胞RAW264．7共培养,ELISA法检测RAw264．7细胞培养上清中IL-6水平;MTS法检测细胞的增殖情况,流式细胞技术检测细胞周期、凋亡以及细胞表面MHCI、MHC11、淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）等分子表达。结果获得1株稳定表达IL-17的4T1细胞,而且其培养上清可刺激小鼠巨噬细胞RAW264．7产生IL-6,证明该细胞可表达功能性IL-17。结论成功建立了稳定转染IL-17基因的小鼠乳腺癌细胞株。     

Syk表达对乳腺肿瘤细胞侵袭迁移作用的影响

目的:探讨脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)在人乳腺癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响.方法:RT-PCR法、免疫荧光法检测不同侵袭能力乳腺癌细胞株--MCF-7(低侵袭性)和MDA-MB-231(高侵袭性) Syk mRNA及蛋白的表达;采用脂质体介导的方法,将Syk基因导入Syk(-)乳腺癌细胞株,利用Transwell小室法检测Syk基因对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响.结果:Syk mRNA及蛋白在MCF-7细胞中呈中等程度表达,在MDA-MB-231中表达缺失;转染Syk基因的MDA-MB-231细胞与转染空载体及未转染MDA-MB-231细胞相比,侵袭及迁移实验中的穿膜细胞数(总迁移细胞数/5HPF)均明显减少(P＜0.05).结论:Syk表达可降低乳腺肿瘤细胞体外侵袭迁移能力.     

吲哚胺2,3-双加氧酶基因转染未成熟树突细胞对卵蛋白致敏小鼠模型CD4+T细胞的影响

目的以pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染未成熟树突细胞,观察吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)基因对CD4 T细胞的影响。方法体外扩增小鼠骨髓来源的未成熟树突细胞,采用光镜、扫描电镜、透射电镜、流式细胞技术鉴定后,采用DOTAP脂质体转染法进行转染,倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。同时建立卵蛋白致敏小鼠模型,分离并纯化脾脏CD4 T细胞,用3H-TdR掺入法进行混合淋巴细胞反应实验,观察IDO转染未成熟树突细胞对卵蛋白致敏小鼠模型脾脏CD4 T细胞增殖的影响,并用TUNEL法检测CD4 T细胞凋亡情况。结果IDO基因转染未成熟树突细胞能抑制卵蛋白致敏小鼠模型CD4 T细胞增殖,pEG-FP-N1-IDO质粒转染组CD4 T细胞减少,与pEGFP-N1空质粒转染组和对照组比较差异显著(P<0.05);IDO基因转染未成熟树突细胞可诱导CD4 T细胞凋亡,pEGFP-N1-IDO质粒转染组CD4 T细胞凋亡率为15.3%±2.6%,明显高于对照组和pEGFP-N1空质粒转染组和对照组(P<0.01)。结论IDO基因表达的上调可能是诱导哮喘免疫耐受的机制之一。     

慢病毒介导的siRNA靶向CD47基因对人喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡的影响

目的 探究慢病毒载体介导siRNA抑制CD47基因表达后对人喉癌细胞株Hep-2体外增殖凋亡的影响.方法 构建慢病毒载体,将靶向CD47基因的siRNA慢病毒转染至Hep-2细胞;用荧光显微镜行细胞形态学变化观察;RT-PCR检测细胞CD47 mRNA表达的变化;Western blotting检测CD47蛋白表达的变化情况;MTT法检测细胞的增殖凋亡情况.结果 CD47-siRNA慢病毒转染Hep-2细胞后,形态学观察显示CD47-siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖,细胞变形明显,体积变小,可见细胞坏死及凋亡.RT-PCR和Western blotting检测显示,CD47的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),使CD47 mRNA表达减少76％～82％,CD47蛋白表达减少77％;慢病毒转染细胞在48h后MTT检测细胞凋亡率明显提高(P＜0.01).结论 慢病毒介导的siRNA干扰CD47基因表达后,明显抑制了喉癌Hep-2细胞CD47的表达并且诱导了Hep-2凋亡.     

骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达

目的 构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法 从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2一EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-23180中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果 成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论 真核表达载体CRFS2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。     

shRNA抑制GC-C基因表达对人胃癌SGC-7901细胞生物学功能的影响

目的 研究靶向鸟苷酸环化酶C(GC-C)的短发夹RNA(shRNA)对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学功能的影响.方法 构建针对人GC-C基因的shRNA真核表达载体,将其转染人人胃癌SGC-7901细胞,采用半定量RT-PCR和Westem blotting法检测细胞中GC-C在mRNA和蛋白水平的变化.以CCK-8法、流式细胞术和原位末端标记法检测转染GC-CshRNA真核表达载体的SGC-7901细胞增殖、凋亡及细胞周期等生物学指标的变化.结果 经DNA测序鉴定,所得到的表达载体插入片段序列与GenBank中的序列一致.shRNA-GC-C真核表达载体转染能有效抑制GC-C基因的表达,以shRNA-GC-CⅢ序列的抑制效果最佳.转染GC-C shRNA真核表达载体后SGC-7901细胞的增殖能力受到抑制(P<0.05);细胞形态发生改变,细胞体积缩小,核固缩,染色质浓缩聚集于核膜;流式细胞术检测显示G7峰前出现亚二倍体峰,转染48、72h后凋亡率分别为5.47%和5.63%(P<0.05).结论 靶向GC-C基因的shRNA可有效抑制人胃癌SGC-7901细胞生长,并促进细胞凋亡,该作用与下调靶基因GC-C的表达有关;GC-C可能是胃癌治疗的一个潜在靶点.     

泛素代谢系统相关基因FBG2在胃癌细胞系中功能意义的研究

目的初步探讨泛素代谢系统相关基因FBG2对于胃癌细胞生长、增殖、凋亡等生物学特性及成瘤、浸润转移能力等恶性表型的影响。方法将FBG2基因插入载体pcDNA3．1构建pc-FBG2真核表达载体。以脂质体介导转染MKN45胃癌细胞并以G418压力筛选法筛出稳定表达的克隆,对稳定表达株进行鉴定,然后使用流式细胞仪、生长曲线法、平板克隆形成实验法、细胞迁徙实验法等分析稳定表达株相关生物学特性与恶性表型的变化,每种检测实验均设立pc-FBG2稳定转染细胞组、pcDNA3．1稳定转染细胞组和空白MKN45细胞组。结果与转染pcDNA3．1空载体及空白MKN45胃癌细胞相比,转染pc-FBG2载体的稳定表达细胞株生长有所加快,开始计数后第4、5、6、7天平均细胞计数显著增高（P〈0．05）,细胞周期检测显示pc-FBG2转染组G2／M期比例显著高于其他两组（P〈0．05）,而S期比例显著低于其他两组（P〈0．05）。细胞凋亡检测显示pc-FBG2转染组凋亡比例与其他两组相比无显著差异（P〉0．05）,平板克隆形成实验结果显示pc-FBG2转染组平均克隆形成率显著高于其他两组（P〈0．05）,细胞迁徙实验结果显示pc-FBG2转染组穿膜率与其他两组相比无显著差异（P〉0．05）。结论FBG2基因在一定程度上可促进细胞生长及有丝分裂,对维持细胞恶性表型具有一定意义,但对细胞凋亡及浸润转移能力可能影响较小。     

RNA干扰抑制pyk2表达对大肠癌细胞凋亡和增殖的影响

 目的 探讨富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2(proline-rich tyrosin kinase-2,pyk2)对Lovo大肠癌细胞凋亡和增殖的影响.方法 利用两组构建有pyk2 shRNA(短发夹RNA,会在细胞内顺序反应而产生siRNAs)的质粒载体瞬时转染Lovo细胞系,设立空白对照组和阴性对照组,应用PCR 和western blot方法检测转染组和对照组细胞中pyk2 mRNA与蛋白表达水平的变化,通过细胞计数法来绘制细胞生长曲线,利用流式细胞技术(FCM)检测转染组与对照组细胞在凋亡和细胞周期S期分布的差异.结果 转染pyk2shRNA质粒的Lovo细胞凋亡水平明显低于对照组,S期细胞数显著增多,细胞绝对数增加,生长更加活跃.结论 pyk2能够升高Lovo大肠癌细胞的凋亡水平,降低其增殖水平.     

共转染沉默5-LOX/COX-2基因对胃癌细胞SGC-7901生长的影响

目的 观察沉默环氧合酶2(COX-2)基因和5-脂氧合酶(5-LOX)基因对胃癌细胞SGC-7901生长的影响.方法 分别构建5-LOX/COX-2基因的靶向短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,共同转染胃癌细胞SGC-7901.将细胞分为空白对照组、空质粒组、单独转染组(P-sh5-LOX或P-shCOX-2)及共同转染组(P-sh5-LOX+P-shCOX-2).分别采用RT-PCR及Western blotting检测COX-2/5-LOX的mRNA及蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 与空白对照组及空质粒组比较,5-LOX和COX-2基因单独转染组及共同转染组的mRNA和蛋白表达量均受到显著抑制(P＜0.05).P-sh5-LOX组(27.38％±0.64％)、P-shCOX-2组(29.05％±0.61％)及共同转染组(50.23％±1.73％)细胞增殖抑制率均显著高于空质粒组(3.78％±0.39％,P＜0.05),共同转染组细胞增殖抑制率显著高于单独转染组(p＜0.05).P-sh5-LOX组、P-shCOX-2组及共同转染组的细胞凋亡率(分别为15.31％±1.53％、16.69％±1.28％、27.27％±1.18％)均显著高于空质粒组(0.99％±0.46％,P＜0.05),且共同转染组显著高于单独转染组(P＜0.05).结论 同时沉默胃癌细胞SGC-7901的5-LOX及COX-2基因,可显著抑制胃癌细胞增殖,促进其凋亡,其效果优于单独沉默其中一个基因.     

LON基因下调对人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖以及药物敏感性的影响

目的：应用RNAi的方法抑制丝氨酸蛋白酶LON表达，研究该丝氨酸蛋白酶的表达与肿瘤增殖以及药物敏感性之间的关系。方法：以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，通过RNAi下调LON基因表达，采用RT—PCR法、MTT增殖实验、流式细胞术等技术进行检测。结果：在瞬时转染与稳定转染细胞株中，RT—PCR结果证实LON基因的表达明显下调；MTT增殖实验结果显示，LON基因的下调可导致细胞的增殖能力降低，并且能够增加对化疗药顺铂的药物敏感性。流式细胞仪检测显示LON基因的下调对细胞周期没有显著影响。结论：通过RNAi下调LON基因能够抑制肿瘤细胞的增殖并且与顺铂有协同作用，其抑制作用未造成细胞周期的改变。     

p53调控信号转导子和转录激活子3对肺癌细胞增殖及凋亡的影响

 目的 探讨p53调控信号转导子和转录激活子3(STAT3)对肺癌细胞增殖及凋亡的影响。方法 细胞分组为空白对照组、阴性对照组、p53 小干扰RNA(siRNA)组、p53 siRNA+STAT3 siRNA组,采用western blot法检测组织中p53和STAT3蛋白表达水平;采用Transwell法检测转染后体外迁移能力和侵袭能力;采用流式细胞术膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶(AV-PI)双染法检测转染后凋亡情况。结果 肺癌组织中p53表达水平明显下调,而STAT3表达阳性率增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。转染p53的siRNA能显著上调肺癌细胞中STAT3的表达水平;p53 siRNA组和p53 siRNA+STAT3 siRNA组A549细胞凋亡率(17.91%±0.67%,22.51%±0.56%)、细胞的迁移速度[(55.16±6.50)μm/h,(63.30±5.98)μm/h]、穿膜细胞数(58.23±7.12,68.23±7.14),与空白对照组和阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 p53在肺癌中呈现低表达,p53能负向调控STAT3的表达,从而抑制其增殖和凋亡能力。     

酪氨酸代谢物对肺癌细胞增殖、周期及化疗药物敏感性的影响

目的 探讨4种酪氨酸代谢物对肺癌细胞增殖、周期及化疗药物敏感性的影响.方法 不同浓度的酪氨酸代谢物——酪氨酸、4-羟苯丙酮酸(HPPA)、尿黑酸(HGA)、延胡索酸(FA)分别处理A549细胞,通过高内涵实时监测肺癌细胞的增殖,流式细胞仪检测肺癌细胞周期的变化及对化疗药物的敏感性,Western印迹检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达.结果 4种酪氨酸代谢物对A549细胞的增殖及周期均无影响.HGA可降低吉非替尼(Gefitinib)诱导的A549细胞凋亡,抑制Bax表达,同时上调Bcl-2的表达水平;FA则可增加其诱导的A549细胞凋亡,促进Bax表达,同时下调Bcl-2的表达水平.酪氨酸和HPPA对Gefitinib诱导的细胞凋亡均无明显影响.结论HGA与FA可调节肺癌细胞化疗药物的敏感性,揭示了酪氨酸代谢通路对肺癌细胞的调控作用,为肿瘤代谢异常的研究奠定了基础.     

全反式维甲酸对乳腺癌MCF-7细胞周期和增殖活性的影响及restin基因表达的初步研究

目的:检测全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)在乳腺癌MCF-7细胞周期、增殖、分化和凋亡过程中的作用,以及对。restin基因表达的影响,从而为研究其功能提供线索。方法:用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期的变化;MTT 法检测细胞增殖活性;RT-PCR检测restin基因表达。结果:在ATRA诱导下,细胞出现G1期阻滞和生长抑制,增殖活性下降,restin基因开始表达,并呈增长趋势。结论:在ATRA诱导MCF-7细胞分化、凋亡过程中,ATRA能使MCF-7细胞 G1期阻滞,并能抑制MCF-7细胞生长,促使其凋亡,restin基因参与细胞周期的调控,特别是细胞凋亡。     

低频超声联合顺铂对卵巢癌细胞影响研究

目的探讨低频超声联合顺铂对人卵巢癌A2780细胞增殖和凋亡的影响。方法培养人卵巢癌A2780细胞,将其随机分为对照组、低频超声组、顺铂组和联合组。低频超声组给予超声840 k Hz,0.75 W/cm23 min辐照;顺铂组给予顺铂5 n M,培养48 h;联合组给予低频超声+顺铂处理。应用CCK-8检测各组细胞的增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡以及细胞周期。结果与单独应用低频超声或顺铂比较,低频超声联合顺铂抑制人卵巢癌A2780细胞增殖的能力更强,更明显地诱导癌细胞的凋亡以及细胞周期S期阻滞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论低频超声联合顺铂可抑制人卵巢癌细胞的增殖,诱导癌细胞的凋亡以及细胞周期S期的阻滞作用。     

乳腺癌缺失基因1对肝癌生物学行为的影响

目的探讨乳腺癌缺失基因1（deleted in breast cancer 1,DBC1）对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-DBC1的正义表达载体,转染肝癌细胞SMMC-7721,MTT法检测DBC1对肝癌细胞SMMC-7721生长增殖的影响,采用流式细胞术（FCM）检测DBC1对肝癌细胞SMMC-7721的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果与转染空载体的SMMC-7721细胞相比,pcDNA3.1-DBC1正义表达载体转染上调DBC1的表达,可显著抑制肝癌细胞（SMMC-7721）增殖,升高G1期细胞比例（51.0%vs 64.9%,P=0.002）,降低S期细胞比例（29.7%vs 14.0%,P〈0.001）,诱导细胞凋亡（8.8%vs 24.6%,P〈0.001）。结论 DBC1通过抑制肿瘤细胞增殖,阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡,抑制肝癌的发生和发展。     

LINC01296/miR-1255b-5p促进非小细胞肺癌进展的研究

目的 探究下调LINC01296的表达对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）进展的影响,以及LINC01296调控miR-1255b-5p在NSCLC发生发展中的分子机制。方法 培养6种NSCLC细胞系;实时荧光定量聚合酶链反应法检测LINC01296在NSCLC细胞系以及在48例患者样本中表达水平的高低;细胞计数试剂盒-8法检测稳转细胞株的细胞增殖情况;克隆形成实验检测细胞的生长以及增殖状况;划痕实验检测细胞的迁移情况;FITC-Annexin-V法检测细胞凋亡;动物实验,包括裸鼠尾静脉和皮下瘤注射,观察癌细胞的转移以及成瘤情况;双荧光素酶报告基因实验验证LINC01296与miR-1255b-5p之间存在靶向结合关系。 结果 LINC01296在NSCLC中高表达;LINC01296基因敲低抑制NSCLC细胞生长、迁移;LINC01296敲低抑制体内瘤体的生长和转移;LINC01296与miR-1255b-5p的之间存在海绵吸附作用;LINC01296与miR-1255b-5p的表达呈负相关。结论 LINC01296作为NSCLC的促癌分子,通过抑制miR-1255b-5p的表达水平,促进了NSCLC的发展。