密码子优化的中国HIV-1流行亚型gp120共识序列核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的:构建能表达密码子优化的中国HIV-1流行亚型AE、Bc和B'gp120共识序列的核酸疫苗,并研究其免疫原性.方法:根据HIV-1的分子流行病学资料和包膜糖蛋白的氨基酸序列分析,设计了针对中国流行的AE,BC和B'(ThB)亚型的gp120共识序列.按哺乳动物细胞偏好的密码子对AE.BC和ThB 3个亚型的gp120共识序列分别进行密码子优化,合成优化基因.将密码子优化的gp120基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891,构建重组质粒核酸疫苗.将重组质粒转染293T细胞,并以重组质粒疫苗免疫新西兰兔.应用蛋白质免疫印迹法检测转染细胞中gp120蛋白的表达.ELISA方法检测免疫后兔血清中gp120特异性抗体的产生.结果:3个密码子优化的gp120核酸疫苗,均能正确表达gp120.这些gp120核酸疫苗免疫家兔后,能产生HIV-1包膜糖蛋白特异性的抗体.结论:成功构建3个密码子优化的、表达HIV-1中国流行亚型AE,BC和ThB的共识序列的gp120核酸疫苗,能诱导HIV-1包膜蛋白特异的免疫反应.     

新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗在中国猕猴体内免疫原性初步研究

目的:观察乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗在中国猕猴体内的体液和细胞免疫应答。方法:实验用中国猕猴实验组、对照组各2只,分别在第0、8、16、24、48周肌肉注射法接种核酸疫苗(pSW3891/MHBs)或对照载体(pSW3891)。ELISA法检测中国猕猴血清抗-HBs,CFSE-PI染色FCM(流式细胞术)法测定中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应。结果:实验组中国猕猴血清抗-HBs滴度在72周达到最高峰,最高滴度分别为1∶6400和1∶12800,对照组抗-HBs滴度始终保持在1∶50。实验组中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应明显增强,细胞分裂指数分别为18.64和14.70,而对照组细胞分裂指数分别为1.62和2.61。结论:建立了CFSE-PI染色流式细胞仪检测法来检测中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg抗原特异性增殖反应,方法创新,实用可靠。新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗pSW3891/MHBs在中国猕猴体内能产生良好的特异性体液和细胞免疫应答。     

乙肝表面抗原核酸疫苗的构建及其与宿主染色体整合的可能性分析

目的：构建乙肝表面抗原DNA疫苗，并探讨其在实验动物体内整合到宿主细胞基因组上的可能性。方法：采用PCR法扩增乙肝病毒的S基因片段后装入pVAX载体，并以此为修选疫苗免疫（BALB/c）小鼠，在不同时间、不同部位取其组织抽提基因组DNA，用PCR检测DNA整合情况。结果：构建了乙肝核酸疫苗pVAX-HBsAg。免疫接种该疫苗第3周时在小鼠肌肉、肝脏、脾脏、胸腺均有不同量的游离质粒存在；第6周除在股四头肌可检测到外，其余组织中均为阴性；第12、18周时检测所有组织中均为阴性。结论：构建的pVAX-HBsAg DNA疫苗在小鼠体内无染色体整合。     

结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。     

严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性研究

目的:构建SFTSV的核蛋白核酸疫苗并探讨其免疫原性?方法:采用PCR方法扩增SFTSV核蛋白基因,并用引物引入限制性内切酶酶切位点,克隆入载体pJW4303?经酶切和测序鉴定正确的质粒,用PEI瞬时转染HEK293T细胞,用免疫印迹法鉴定核蛋白的表达?同时以质粒pJW4303作为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,酶联免疫法验证其免疫原性?结果:成功构建质粒pJW4303-N,经Western blot证实SFTSV核蛋白能够在HEK293T细胞中表达?ELISA检测免疫后小鼠血清特异性IgG抗体及其亚型发现,IgG抗体及其亚型较免疫前明显升高,亚型中以IgG2a升高为主?结论:SFTSV核蛋白核酸疫苗pJW4303-N具有良好的免疫原性,为进一步研究SFTSV核蛋白奠定了基础?     

乙型肝炎前S疫苗在大学生中二年的免疫原性和安全性评价

将大学生２４４名血清感染指标均阴性者随机分为３组，分别接种三步灭活和加热灭活疫苗，并设对照组，进行二年的免疫效果的对比观察。结果两疫苗水平一致。首免后７个月（全程免疫后），前者抗－ＨＢｓ阳转率为８９．７％，几何平均滴度５４９．６９ｍＩＵ／ｍｌ。后者不同批号抗－ＨＢｓ阳转率各为１００％和９３．３％，１４μｇ组显著高于前者同剂量组外，１、２年均无差异。几何平均滴度各为５６６．０５和６０１．０７ｍＩＵ／     

乙型肝炎疫苗对HBsAg携带儿童的免疫影响

乙型肝炎疫苗对ＨＢｓＡｇ携带儿童的免疫影响金禹锡，李东奎榆树川发电厂职工医院关键词乙型肝炎表面抗原，疫苗，乙型肝炎中图法分类号Ｒ５１２．３４目前关于乙型肝炎疫苗对ＨＢｓＡｇ阳性者的作用和意义仍有不同意见。为了进一步了解乙型肝炎疫苗对ＨＢｓＡｇ携带者能...     

重组乙型肝炎疫苗抗乙型肝炎病毒的免疫原性及保护效应

20世纪80年代就已开始使用的乙型肝炎疫苗[Engerix-B(○R),简称Hep-B(Eng)]是基因工程酵母产物.剂型为含有10或20μg HBsAg 0.5或1.0 mL的悬浮液,其标准接种时间表为0,6,12个月.本文重点叙述了Hep-B(Eng)对不同人群的免疫原性及保护效应.对于各年龄段的健康人群,Hep-B(Eng)具有极佳的保护效应,它可以与其他疫苗同时接种,并不影响自身及其他疫苗的免疫原性.对高危人群,Hep-B(Eng)也具有很好的保护效应.接种其他乙型肝炎疫苗效果不满意者,接种Hep-B(Eng)会有一定的帮助.Hep-B(Eng)具有较好的耐受性,最常见的副作用为注射部位过敏、皮疹等.Hep-B(Eng)的免疫保护期可长达10年.     

HBsAg核酸疫苗诱导H-2b小鼠体液免疫应答的初步研究

目的：观察adw和adr亚型HBV PreS2 S核酸疫苗单一或联合HBcAg核酸疫苗诱导的小鼠体液免疫反应。方法：C57BL／6小鼠23只随机分为4组;pJW4303组（P组）,pJW4303/S2 S(adw亚型）组（W组）、pJW43/3S2 S(adr亚型）组（R组）,pJW4303/S2 S(adr) pJW4303/HBc组（R＋C组）。免疫方法为每只小鼠每次肌注相应质粒DNA100μg(100μl)。免疫程序为0、2、4周。于第3次免疫后4周W组、R组、R＋C组小鼠血清全部检出抗－HBs,抗体含量随免疫次数增多而增加,抗－HBs浓度最高达22329IU／L,与P组（对照质粒组）相比差异有显著性（P＜0．01）,但各核酸疫苗组之间差异无显著性（P＞0．5）。抗－HBs浓度最高达22329IU／L,与P组（对照质粒组）相比差异有显著性（P＜0．01）,但各核酸疫苗组之间差异无显著性（P＞0．5）。而抗－HBc在第一次免疫后2周即在R＋C组全部出现,抗－HBs和抗－HBc在P组始终未检出。结论：adw和adr亚型HBV PreS2 S核酸疫苗和HBc核酸疫苗能诱导H－2^b小鼠产生较强的体液免疫反应,联合HBc核酸疫苗有助于抗－HBs的早期产生。     

乙型肝炎疫苗接种对新生儿乙型肝炎表面抗原检测结果的影响

目的分析探讨乙型肝炎疫苗接种对新生儿血清乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)检测结果的影响。方法用化学发光法和酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测接种乙型肝炎疫苗后新生儿血清中的HBs Ag,有反应于2周后重抽标本复查。结果 2周后重抽复查,HBs Ag均<0.03 U/m L。结论乙型肝炎疫苗的接种可使少数新生儿HBs Ag呈弱反应性结果,而非乙型肝炎病毒感染。     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白去糖基化对体液免疫应答的影响

目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)中去糖基化对体液免疫应答的影响.方法:在MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/adr)基础上,通过PCR扩增基因修饰法,使MHBs上编码第4、59、146位氨基酸密码子基因由AAT/AAC突变为CAG,从而使AAT/AAC编码的天冬酰胺Asn(N)突变为CAG编码的谷氨酰胺Gln(Q),使得N-糖基化位点NXS、NXT突变为QXS、QXT.构建3株去糖基化核酸疫苗(dG1,去除Asn4处糖基化位点,位于preS2上;dG23,去除Asn59、Asn146处糖基化位点,均位于HBs上;dG123,去除Asn4、Asn59及Asn146位糖基化位点).脂质体法转染293T细胞,Western blot检测,观察它们在293T细胞中瞬时表达的差异;肌肉注射法免疫BALB/c小鼠,观察MHBs去糖基化对小鼠体液免疫应答的影响.结果:adr、dG23转染293T细胞后,在细胞内及上清液中均检测到HBsAg;dG1、dG123转染293T细胞后,在细胞内检测到HBsAg,但是上清液中未测到.adr、dG1及dG23免疫BALB/c小鼠后均产生抗-HBs抗体,最高滴度均达到1∶102 400;dG123几乎无抗体反应(＜1∶200).结论:Asn4去糖基化导致MHBs向细胞外的分泌障碍,但是对小鼠抗-HBs的产生无影响.Asn59、Asn146两处同时去糖基化对MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生影响轻微.Asn4、Asn59及Asn 146三处同时去糖基化明显影响MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生.     

IL-12对乙型肝炎DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的影响

目的　观察编码鼠 IL - 12的真核表达载体对 HBVDNA疫苗诱导 BAL B/ c小鼠免疫应答的影响 .方法　肌肉注射 DNA疫苗 ,EL ISA法检测小鼠血清抗 HBs,4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL杀伤活性 .结果　免疫 8wk后 ,单纯注射 p CR3.1- S及共注射 IL - 12真核表达载体的小鼠血清 45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1及 1.6 7± 0 .15 .CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %及 (73.3± 8.8) % ,两组均有明显差异 (P<0 .0 1) ,脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 CTL 细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) % ,(75 . 6±9.1) % ,抗 CD8+单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) % ,(16 .9± 2 .3) % .结论　 IL - 12的真核表达载体能够提高小鼠对 DNA疫苗的免疫应答 ,CTL细胞杀伤活性主要由 CD8+执行 .基因疫苗可能用于预防及治疗 HBV感染     

乙肝表面抗原与慢性乙肝的功能性治愈

 治愈乙肝(功能性治愈乙肝)已成为国内外有关学者研究的重要目标。功能性治愈乙肝的指标为:持久的HBsAg消失(伴有或不伴有血清抗HBs阳性),血清HBV DNA阴性,cccDNA处于非活动转录状态,停止治疗后疾病没有复发。本文在简述HBsAg的已知与未知的基础上,阐述了免疫治疗乙肝的现状,重点介绍了本室研发HBsAg-HBIG治疗性疫苗的实验与临床研究。根据核苷类抗病毒药物可清除HBV DNA,中和性HBsAg抗体的被动免疫作用,已证实HBsAg HBIG有较强的主动免疫作用,提出了清除HBsAg的“三明治”方案:第一层用抗病毒药物,第二层被动免疫用抗HBs抗体,当血清HBsAg未能测及后,第三层注射HBsAg-HBIG复合物作主动免疫,目标为诱生患者对HBsAg产生持久的免疫,从而使cccDNA处于非活动状态,可能会达到功能性治愈。     

HBsAg免疫刺激复合物型疫苗制备

目的制备中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞表达的重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的免疫刺激复合物型(ISCOM s)疫苗。方法采用离心法和透析法制备了HBsAg的免疫刺激复合物。结果电镜下观察ISCOM s直径为30~40 nm左右的蜂窝状结构。十二烷基磺酸钠电泳(SDS-PAGE)分析表明,离心法和透析法制备的颗粒的HBsAg蛋白均由P23、GP27和GP30组成。B radfords法测定离心法和透析法制备的ISCOM s的蛋白回收率分别为31.50%和41.15%。结论HBsAg免疫刺激复合物型的成功制备为ISCOM s型乙型肝炎疫苗的研制打下了基础。     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒.方法 以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBV pADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1(-),并行酶切鉴定和基因测序.结果 构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的 基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致.结论 成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗.     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）强制泛素（Ub）化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1（-）,并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。     

新生儿重组酵母乙肝疫苗接种免疫的研究

目的：探讨重组酵母乙肝疫苗新生儿接种后抗体应答持续时间，强化复种的必要性。方法：常规对新生儿0d(出生后当天)、1月、6月接种重组酵母乙肝疫苗后检测抗体应答情况，再随机分两组，一组为强化组，一组为常规组，并随访其5年的抗体应答情况。结果：新生儿常规接种法，于12个月后有一明显抗体应答下降期(0d、1月、6月、12月)，强化组乙肝表面抗体形成率高，持续时间均高于常规接种法。结论：新生儿乙肝疫苗0d、1月、6月、12月接种法有较好的远期保护效果，对现有的0d、1月、6月新生儿乙肝疫苗常规接种法，有强化接种的必要。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

时间分辨免疫荧光分析检测乙型肝炎病毒表面抗原

目的 时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)是当前标记免疫分析研究应用领域的热点之一,具有高灵敏性和高特异性,用于生物分子的超微量检测.本研究者在建立一种灵敏度高、特异性强、操作简便的检测方法.方法 以Eu-DTTA{N1-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠}为示踪物,建立了用TRFIA检测乙型肝炎血清学标志物乙型肝炎病毒表面抗原的方法.结果 所建立的标准曲线分析范围分别为0.2～300 ng/ml,分析灵敏度为0.05 ng/ml,检测参考标准品的批内变异系数均小于10%,与免疫放射测定同时定量检测多份血清样本,相关系数高达95%.结论 TRFIA分析范围宽,灵敏度高,操作简便,具有优越的定量检测能力,价格适中,十分适合临床推广应用.