靶向卵巢癌HIF-1α基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是生物体内普遍存在于RNA水平上调节基因表达的方式,具有很强的转录后基因沉默作用,已广泛用于抗肿瘤的研究中。缺氧诱导因子-1α表达与肿瘤的耐药可能有密切关系,卵巢癌细胞中亦有HIF-1α蛋白的高表达,因此抑制卵巢癌细胞中HIF-1α基因的表达可能逆转肿瘤耐药。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的构建含有乙型肝炎病毒(HBV)X基因的真核表达载体,并对其表达进行鉴定。方法用聚合酶链反应(PCR)方法扩增X基因序列,对pcDNA6(+)载体及X基因PCR产物双酶切并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HBV X基因真核表达载体pcDNA6(+)-HBx。以多聚乙烯酰胺(PEI)法将其转染到HepG2细胞,Western Blot鉴定目的蛋白。结果 pcDNA6-HBx酶切后,琼脂糖电泳可见到HBx基因片段,经序列测定其含有完整的X基因片段;Western Blot结果显示pcDNA6(+)-HBx能在HepG2细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA6(+)-HBx,并能在HepG2细胞中表达X蛋白,为进一步研究HBV X基因与慢性乙型肝炎及肝癌的关系提供便利条件。     

MMP-26基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建基质金属蛋白酶-26（MMP-26）小干扰RNA（siRNA）表达质粒,以研究其对人肿瘤细胞MMP-26基因表达的沉默效果,探索肿瘤基因治疗的新途径.方法 根据MMP-26基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pSUPERIOR.puro中,构建重组质粒,同时设计构建分别针对GFP和β-actin的干扰质粒作为阴性对照和阳性对照,并进行酶切鉴定和测序分析.结果 酶切及测序证实重组质粒构建成功.结论 利用RNA干扰（RNAi）技术可成功构建siRNA表达载体.     

人表皮生长因子基因真核表达载体的构建及其基因转染

目的：构建人表皮生长因子基因真核表达载体，并将其导入细胞中表达表皮生长因子重组蛋白。 方法：经HindⅢ、BarnHI酶切PGEM-TEasy-hEGF，将人表皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体pcDNA3．1中。在脂质体的包裹下将pcDNA3．I-hEGF导入角膜组织细胞中，分别从DNA、RNA、蛋白质3个水平上检测人表皮生长因子基因表达情况。 结果：经T7／SP6和hEGF内套引物进行PCR扩增及酶切鉴定重组体，分别得到310bp和162bp两条基因片段，将162bp条带经纯化后用AVa皿限制性内切酶切鉴定，可分别得到89bp和72bp两条片段；将人表皮生长因子基因序列与Genbank上公布的序列相比，碱基同源性达98．2％，氨基酸完全相同；PCR，RT．PCR在转染后21d之内，在DNA、RNA水平上可检测到人表皮生长因子基因；免疫组织化学检恻法在转染后第3天可检测到人表皮生长因子蛋白表达，2周之后，人表皮生长因子蛋白表达结果转为阴性。 结论：pcDNA3．1-hEGF重组质粒与LipofectamineTM2000以适当比例混合形成的微囊可携带人表皮生长因子基因进入细胞内并表达功能蛋白。     

重组外源性人热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定

背景:热休克蛋白70的肿瘤免疫作用近年来受到国内外学者的广泛关注,然而目前常用的诱导内源性热休克蛋白70表达的方法,如热应激、缺血预处理等均存在一些弊端.目的:拟构建携带并正确表达外源性人热休克蛋白70基因的重组真核表达载体.方法:外源性热休克蛋白70基因连接入真核表达载体pDC315-EGFP中,转化大肠杆菌感受态细胞,重组真核表达载体外源基因测序及PCR检测鉴定阳性克隆后转染人胚肾293细胞,荧光显微镜及western blot鉴定外源基因在细胞中的表达.结果与结论;经PCR和测序证实外源性人热休克蛋白70基因正确重组入真核表达载体pDC315-EGFP,转染293细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,Western blot检测到热休克蛋白70在293细胞中有效表达.     

人表皮生长因子基因真核表达载体的构建及其基因转染

目的:构建人表皮生长因子基因真核表达载体,并将其导入细胞中表达表皮生长因子重组蛋白。方法:经HindⅢ、BamHI酶切PGEM-TEasy-hEGF,将人表皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1中。在脂质体的包裹下将pcDNA3.1-hEGF导入角膜组织细胞中,分别从DNA、RNA、蛋白质3个水平上检测人表皮生长因子基因表达情况。结果:经T7/SP6和hEGF内套引物进行PCR扩增及酶切鉴定重组体,分别得到310bp和162bp两条基因片段,将162bp条带经纯化后用AVaⅢ限制性内切酶切鉴定,可分别得到89bp和72bp两条片段;将人表皮生长因子基因序列与Genbank上公布的序列相比,碱基同源性达98.2%,氨基酸完全相同;PCR,RT-PCR在转染后21d之内,在DNA、RNA水平上可检测到人表皮生长因子基因;免疫组织化学检测法在转染后第3天可检测到人表皮生长因子蛋白表达,2周之后,人表皮生长因子蛋白表达结果转为阴性。结论:pcDNA3.1-hEGF重组质粒与LipofectamineTM2000以适当比例混合形成的微囊可携带人表皮生长因子基因进入细胞内并表达功能蛋白。     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建bcr／abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr／abl mRNA和P210蛋白的影响。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列,按照Tusch 1设计原则,选择设计双链小干扰RNA（siRNA）,再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅱ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT—PCR分析bcr／abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果：构建bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117使bcr／abl mRNA的相对水平下降50％,使P210蛋白下降47％。结论：bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr／abl的表达。     

人β—神经生长因子基因重组真核表达载体的构建

目的　构建 β 神经生长因子 (β NGF)基因重组真核表达载体 ,为 β NGF基因治疗和临床实验诊断研究打下良好的基础。方法　将质粒PGEM β NGF进行酶切获得 β NGF基因片段 ,用T4连接酶将其插入真核表达载体PcDNA3;以T7、P2为引物进行PCR ,论证插入片段的方向 ;经测序和酶切对插入片段进行分析和进一步鉴定。结果　PCR产物琼脂糖电泳结果显示 :在预期位置有阳性条带 ;序列分析和酶切结果证实插入片段序列正确。结论　β NGF基因重组真核表达载体PcDNA3 β NGF构建成功 ,为进一步开展 β NGF基因治疗神经系统疾病和临床实验诊断奠定了基础。     

凋亡抑制基因Survivin与膀胱癌

Survivin属于凋亡抑制蛋白家族之一，在人类肿瘤中都有不同程度的表达，其中以膀胱移行细胞癌为著，有抑制细胞凋亡和参与细胞周期的调节作用，对膀胱肿瘤的发生发展起重要作用。他们的高表达也许能为临床诊断和将来靶向治疗提供潜在价值，本文就其生物学特点及在膀胱癌中的研究现状作一概述。     

人β-神经生长因子和神经生长因子基因重组真核表达载体的构建

目的:入神经生长因子包括β-神经生长因子、神经生长因子这两种活性形式,拟分别构建这两种活性形式的基因重组真核表达载体,为进一步的转基因实验作好前期准备。方法:实验于2001～2004年在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①对象:健康志愿者5人,均对本实验知情同意。流产胎儿由青岛大学医学院妇产科提供,产妇均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:根据人β-神经生长因子与神经生长因子的全长基因序列设计合成特异性引物。抽取正常人外周血1.5 mL,提取基因组DNA后克隆出人β-神经生长因子基因片段。取胎儿海马部位脑组织100 mg,采用RT-PCR技术从胎儿脑组织中克隆出人神经生长因子基因片段。分别将纯化的β-神经生长因子产物与神经生长因子产物连接于真核表达载体pcDNA_4上,构建重组真核表达载体。转入JM109大肠杆菌中,扩增后小剂量质粒提取,酶切鉴定及计算机自动测序。结果:β-神经生长因子和神经生长因子的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示,在预期位置均有阳性条带。酶切鉴定结果及计算机自动测序均证实插入片段为目的基因片断。结论:实验分别从人外周血和胎脑海马组织中成功克隆获得β-神经生长因子与神经生长因子,并顺利构建这两种活性形式的重组真核表达载体pcDNA_4-β-NGF与pcDNA_4-NGF,为进一步将神经生长因子基因转入真核细胞并比较二者表达效率作好准备工作。     

存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达

本研究旨在构建含有人存活蛋白(survivin)基因的重组腺病毒载体,并探讨其在转染树突状细胞中的表达。以质粒pcDNA3.0-survivin为模板,通过PCR扩增获得survivin基因全长序列。PCR产物回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pShuttle-CMV-survivin。通过双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pShuttle-CMV-survivin转化E.coliBJ5183菌(含腺病毒骨架质粒)并进行同源重组,然后筛选阳性克隆,提取质粒,将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,将病毒上清转染树突状细胞,应用Westernblot方法分析survivin的表达。结果表明成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.65×109pfu/ml。Westernblot鉴定显示,经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin。结论含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功,为下一步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础。     

抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)表达质粒的构建

目的:通过构建抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,为肿瘤基因治疗提供实验依据。方法:利用基因重组技术构建靶向cyclin D1RNA干扰(RNAi)表达质粒,双酶切鉴定电泳及测序分析构建的质粒是否成功;Western Blot分析转染前后K562细胞cyclin D1蛋白表达的变化。结果:体外合成的64个碱基成功插入到预计位点,并且与设计序列完全一致;Western Blot分析结果显示转染所构建的质粒能明显下调K562细胞cyclin D1基因表达。结论:质粒的成功构建为研究其抑制cyclin D1基因表达,发挥抗肿瘤效应以及与放、化疗联合的协同效应打下基础。     

FRAT1基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建FRAT1siRNA真核干涉表达载体pSINsi-FRAT1,并测序鉴定证实克隆正确。方法设计以FRAT1基因为靶标的RNAi序列和阴性对照片段序列,并克隆入载体pSINsi-hU6,用基因测序进行重组克隆验证。结果PCR检测证实siRNA插人pSINsi-hU6质粒,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建FRAT1基因的RNAi载体,为研究FRAT1基因对结肠癌细胞增殖凋亡侵袭的影响提供了稳定转染的RNA干扰质粒。     

视网膜母细胞瘤中survivin的表达

目的 探讨survivin在视网膜母细胞瘤中的表达情况.方法 对20例视网膜母细胞瘤组织和8例正常视网膜组织采用免疫组织化学方法分析,采用Mann-Whitney U法分析组间差异.结果 视网膜母细胞瘤组中有14例suvivin表达阳性,正常组无1例阳性,两组间存在统计学差异(P＜0.01).结论 视网膜母细胞瘤组织中snrvivin表达上调,可能与肿瘤的发生和发展相关.     

APRIL shRNA表达载体的构建与筛选

目的 构建并筛选有效的、编码短发夹RNA(shRNA)的增殖诱导配体(APRIL)基因特异性真核表达裁体.方法 分别设计、合成4对寡核苷酸单链,经退火、连接得到APRIL-shRNA双链,定向克隆至带有H1启动子、绿色荧先蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和Neo基因的pGCsi-H1/Neo/GFP质粒裁体中,柏建4条含APRIL基因shRNA的pGCsi-H1/Neo/GFP-APRIL-shRNA真核表达裁体,转染高表达APRIL的结直肠癌细胞株SW480.G418筛选,荧光显微镜下现察转染效率,FQ-RT-PCR检测APRIL mRNA水平,Western印迹分析APRIL蛋白表达.结果 测序证实pGCsiH1/Neo/GFP-APRIL-shRNA(APRIL shRNA)构建成功,无碱基突变,4种不同shRNA质粒转染细胞后APRIL mRNA和蛋白表达差别有统计学显著性意义(P＜0.01).结论 成功地构建APRIL shRNA真核表达裁体,敲低效率85%以上,可用于后续的实验研究.     

调控抗凋亡基因survivin表达的因素研究

为了探讨调控存活蛋白（survivin）基因表达的影响因素,以NB4和HL-60细胞株作为实验对象,对细胞进行体外细胞培养、形态学观察,并用半定量RT-PCR检测survivin mRNA的表达.结果显示：NB4细胞株细胞survivin基因表达阳性,经1 μmol/L ATRA处理后,随着作用时间延长,其细胞分化抗原CD11b表达量逐渐增高（-↑x=47.002,P=0.000）,而CD33表达量逐渐减低（-↑x=1.614,P=0.806）,并见survivin基因表达下调,细胞周期阻滞于G0-G1期（-↑x=58.566,P=0.000）;ATRA对HL-60细胞株细胞survivin mRNA表达有下调作用;G-CSF、GM-CSF和植物血凝素（PHA）均能使NB4和HL-60细胞株细胞survivinmRNA表达上调,并呈时效关系;100-1 000 nmol/L survivin反义寡聚核苷酸（AS-0DN）抑制NB4细胞株细胞survivin mRNA表达,随着浓度增加其抑制率增加,600nmol/L时其抑制率最低为38%,增加浓度未见抑制率继续下降,而对照组、脂质体组和正义链组中NB4细胞株细胞sur-vivin mRNA表达几乎未受到抑制;在细胞形态学上,NB4细胞株细胞经survivin AS-ODN处理后出现典型的凋亡形态学变化.结论：PHA、GM-CSF和G-CSF对HL-60和NB4细胞株细胞survivin基因表达起正向调节作用,而sur-vivin AS-ODN和ATRA起负向调节作用;ATRA下调survivin基因表达,且细胞周期阻滞于G0-G1期,这说明survivin基因表达与细胞周期之间关系密切,抑制NB4细胞株细胞survivin基因的表达可促使细胞发生凋亡.     

存活蛋白和P63蛋白在B细胞非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及其对细胞凋亡和增殖的作用

本研究探讨存活蛋白（Survivin）和P63蛋白在B细胞非霍奇金淋巴瘤（B—NHL）发生发展中的可能作用及其与细胞凋亡和增殖的相互关系。应用免疫组织化学SP法和TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术检测43例B-NHL和10例反应性增殖淋巴组织（RHL）中的survivin和P63蛋白表达以及细胞凋亡和增殖细胞核抗原（PCNA）的水平。结果表明：survivin和P63在43例B-NHL中表达的阳性率分别为69．8％（30／43）和82．7％（36／43），survivin和P63在10例RHL中表达阳性率分别为10％（1／10）和40％（4／10），survivin在侵袭性B—NHL中的阳性率明显高于惰性B—NHL（83．3％vs46．2％，P〈0．01），P63蛋白表达差异无显著性意义；survivin阳性表达与凋亡指数（AI）和增殖指数（PI）呈正相关（r=0．429，P〈0．01；r=0．348，P〈0．01），P63蛋白阳性表达与AI和PI呈正相关（r=0．451，P〈0．01；r=0．369，P〈0．05），B—NHL的AI和PI呈显著正相关（r=0．598，P〈0．001）。结论：survivin可能参与了B—NHL的凋亡和增殖调控机制，P63作为癌基因参与B—NHL发生，二者可能共同影响细胞增殖和凋亡。     

凋亡抑制基因Survivin与宫颈癌的发生

目的:探讨凋亡抑制基因Survivin生存素在宫颈癌发生、发展中的作用。方法:选取宫颈上皮内瘤样病变60例、宫颈浸润癌32例和正常宫颈组织25例作为研究对象,用TUNEL法测定凋亡指数及S—P免疫组化法进行Survivin基因表达检测,分析比较各组间凋亡指数及Survivin表达差异。结果:凋亡指数随着宫颈上皮病变的发展而减少(P＜0．05),但在CINⅢ与宫颈浸润癌间无明显差异。正常宫颈组织Survivin基因表达均为阴性,随着宫颈上皮病变的发展,Survivin表达强度显著增加(P＜0．05)。Survivin基因表达强度与细胞凋亡指数呈负相关(r=-0．67,P＜0．01)。结论:细胞凋亡的改变与宫颈癌发生的早期过程有关,凋亡抑制基因Survivin在宫颈从癌前病变向宫颈癌演变的过程中起重要作用。     

SSA抗原真核表达载体的构建

目的：通过基因克隆构建表达人干燥综合征抗原A（SSA）的巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体。方法：从人白血病淋巴细胞HL60株中提取RNA，反转录出cDNA，然后以cDNA为模板，通过PCR法扩增目的基因SSA，经纯化、双酶切、DNA浓缩回收，插入到酵母分泌型表达载体pPIC9k，用热冲击法转化感受态细胞DH5a，筛选阳性克隆提取质粒，双酶切鉴定并测序。结果：PCR产物大小符合要求，重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致，测序结果正确。结论：成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体，为今后获取高纯度、高产量的SSA抗原，研制新型抗SSA诊断试剂盒作前期准备。     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。