登革病毒NS1蛋白在病毒致病与免疫中的作用

登革病毒可引起人类登革热、登革出血热以及登革休克综合征,其在世界范围内均有流行.至今登革出血热的发病机制仍未明确,也没有可用的疫苗和特效药物.近年来对登革病毒非结构蛋白NS1的研究逐渐增多,认为它与登革出血热的发病机制有一定关系,它在登革病毒感染的诊断以及亚单位疫苗的研制等方面也有一定的价值.本文就登革病毒NS1蛋白与病毒复制和致病的关系以及其在临床诊断和疫苗研制中的意义作一综述.     

登革病毒NS1蛋白在病毒致病与免疫中的作用

登革病毒可引起人类登革热、登革出血热以及登革休克综合征,其在世界范围内均有流行.至今登革出血热的发病机制仍未明确,也没有可用的疫苗和特效药物.近年来对登革病毒非结构蛋白NS1的研究逐渐增多,认为它与登革出血热的发病机制有一定关系,它在登革病毒感染的诊断以及亚单位疫苗的研制等方面也有一定的价值.本文就登革病毒NS1蛋白与病毒复制和致病的关系以及其在临床诊断和疫苗研制中的意义作一综述.     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体。方法应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度：用Western-blot、ELISA法检测纯化后IgG性质及效价。结果重组NS1蛋白获得分泌表达。其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1：6000。结论重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础。     

登革病毒Ⅱ型NS1基因在小鼠体内诱导的DNA免疫

目的　研究含有登革病毒Ⅱ型NS1基因的重组质粒肌内注射小鼠后在其体内诱导的细胞和体液免疫。方法　用含有登革病毒NS1基因的真核表达质粒pCNX2 NS1于小鼠胫前肌注射并加强免疫 2次。然后定期处死 ,采集血液标本以及小鼠脾细胞 ,检测小鼠的体液和细胞免疫。结果　在末次免疫后 4周检测到小鼠抗NS1抗体 ,并且检测到小鼠CD4 、CD8 亚群的变化。结论　含有登革病毒NS1基因的真核表达质粒pCNX2-NS1免疫小鼠后 ,可以诱导小鼠产生针对NS1的稳定特异性体液、细胞免疫     

2型登革病毒核酸疫苗诱导的体液免疫研究

为研究以２型登革病毒ＮＳ３基因构这酸疫苗能否诱导体液免疫，用表达２型登革病毒ＮＳ３的重组真核表达质粒ＰＳＶ．ＮＳ３直接接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。结果发现在接种后２周即可检测到ＩｇＭ抗体，该抗体在加强接种后滴度显著升高，６周达最高水平至少维持２个月；ＩｇＧ抗体在接种后４周可检测到，８周达最高水平至少维持２个月。     

EB病毒潜伏膜蛋白2 DNA疫苗的构建及其初步免疫效果观察

目的：以EB病毒潜伏膜蛋白2（latent membrane protein 2,LMP2)为靶基因,构建EBV－LMP2的侯选DNA疫苗,并初步探讨其在小鼠体内诱导特异性细胞毒方面的作用,为研制鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC)等EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗提供有益资料。方法：将EB病毒LMP2全cDNA片段克隆至含CMV早期启动子的真核表达载体pCDNAⅢ,构建CMV启动子EB病毒LMP2DNA疫苗,在体外将重组质粒转染COS细胞,以RT－PCR和间接免疫荧光法检测重组质粒在转染的COS细胞中的转录和表达,采用50μg,100μg,200μg3种质粒剂量进行初步的小鼠后可诱发机体产生会对LMP2蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫,50μg,100μg,200μg 3种免疫剂量产生的抗体水平差异不大。在免疫接种6周后,重组质粒免疫的小鼠产生针对LMP2的特异性CTL均明显高于空载体免疫小鼠,3种剂量的CTL结果显示：在100μg,200μg免疫组,小鼠诱导产生的CTL水平要略高于50μg免疫组。结论：EB病毒重组质粒LMP2免疫小鼠可以诱发小鼠产生特异的体液和细胞免疫应答,这些结果为研制鼻咽癌DNA疫苗提供有益的资料。     

登革病毒非结构蛋白NS1群特异性单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备登革病毒NS1群特异性单克隆抗体,建立可检测登革病毒1～4型NS1抗原的ELISA检测法,为登革热的早期快速诊断奠定基础。方法应用毕赤酵母表达系统分泌表达登革病毒2型重组非结构蛋白NS1,以此为抗原免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选和亚克隆,获得能稳定分泌登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用所获得的单克隆抗体建立可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结果从登革病毒2型NS1重组毕赤酵母（Pichia Pastoris-NS1）中获得了大量纯化的登革病毒重组NS1蛋白;经免疫小鼠、细胞融合、间接ELISA筛选及3次亚克隆后,最终获得2株能高效分泌抗登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D7B6B4和2D10E2F6,间接ELISA显示抗体效价高达1∶8000～1∶16000;ELISA及免疫荧光检测证实,其所分泌的抗体与1～4型登革病毒及其重组NS1蛋白均有特异性免疫反应,为登革病毒NS1群特异性单克隆抗体;两株单克隆抗体均为IgG2a亚类;初步建立了检测4个血清型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结论成功研制出两株能高效分泌抗登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。初步建立了可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测法。     

登革病毒多价DNA疫苗构建及免疫保护效果验证北大核心CSCD

目的研究登革病毒(dengue virus,DENV)的多价DNA疫苗pVAX1-EDIII在小鼠体内的免疫原性及其保护作用。方法采用真核表达载体p VAX1,设计并构建含4种血清型登革病毒EDIII结构域的DNA疫苗。在第0、14和42天采用电脉冲肌肉导入方式免疫小鼠。末次免疫后1周,ELISA检测针对4种血清型登革病毒的血清特异性IgG抗体水平;ELISpot检测免疫后小鼠脾细胞分泌特异性IL-4、IFN-γ的水平;体内中和实验检测小鼠免疫后血清对感染DENV和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)乳鼠的保护效力。结果与对照组相比,电脉冲肌肉导入DNA疫苗诱导产生较高滴度的IgG抗体与较强的细胞免疫应答。免疫后血清对致死剂量DENV感染的3日龄乳鼠有完全保护作用,对ZIKV感染C57BL/c 1日龄乳鼠有部分保护作用。结论电脉冲肌肉导入登革DNA多价疫苗免疫可诱导针对4种血清型登革病毒的特异性体液免疫以及细胞免疫应答并能有效抵抗DENV的致死剂量攻毒,对ZIKV也能产生一定的保护效应,具有广谱抗黄病毒感染的潜力。     

登革病毒2型非结构蛋白NS2B的原核表达、纯化及其抗体的制备

目的 原核表达登革病毒(Dengue Virus,DV)NS2B蛋白并纯化,制备NS2B的小鼠多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增DV2全长的NS2B基因序列,构建表达带有6×His标签的NS2B的原核表达载体,进行表达与纯化,免疫Balb/c小鼠,制备NS2B多克隆抗体.采用ELISA检测抗体效价,Westem-blot及免疫荧光染色检测其特异性.结果 成功构建原核表达载体pQE-31/NS2B,进一步获得相对分子质量为16 000的纯化蛋白及多克隆抗体,EHSA显示抗体效价达1:25 600.Western-blot和免疫荧光染色显示多克隆抗体与NS2B蛋白特异性结合.结论 本研究获得了纯化的DV2 NS2B蛋白,成功地制备了NS2B多克隆抗体,为进一步研究NS2B的作用机制奠定了基础.     

登革2型病毒43株NS1基因重组质粒DNA的免疫原性及保护作用研究

目的 研究以pcDNA3.1为载体的登革2型病毒43株（D2－43）NS1基因重组DNA的免疫原性及对登革病毒感染所致小鼠神经毒的免疫保护作用。方法 将纯化的pcDNA-NS1重组质粒DNA采用肌肉多点注射途径免疫3周龄BALB／c小鼠，剂量为每只100μg/次，检测了免疫鼠血清抗体滴度及特异性细胞毒作用。并以D2－43病毒脑内攻击6周龄BALB/c小鼠产生的神经毒症状为实验模型，对pcDNA-NS1的免疫保护作用进行了初步探讨。结果 用间接ELISA测得pcDNA-NS1免疫后抗体滴度为1：800，在补体存在下，对D2－43病毒感染的BHK－21细胞特异性杀伤率可达到61．6％。由免疫的BALB／c小鼠脾制备的效应细胞在体外可特异性地杀伤D2－43感染的P－815细胞（H－2^d)。当效靶比（E／T）为20：1时，pcDNA-NS1质粒免疫后的特异性CTL杀伤百分率为22．6％。将100 LD50的D2－43病毒经脑内攻击BALB／c小鼠，结果表明免疫pcDNA-NS1组小鼠存活率最高（90．9％）；与免疫pcDNA3.1对照组比较，P值＜0．05。结论 pcDNA-NS1质粒免疫BALB／c小鼠不仅可诱导体液免疫，还可诱导特异性细胞免疫。初步结果还显示，用含NS1基因的重组质粒DNA免疫的小鼠能免受致死剂量登革病毒的攻击，为登革热新型疫苗的研究奠定了基础。     

DNA vaccines against dengue virus based on the ns1 gene: the influence of different signal sequences on the protein expression and its correlation to the immune response elicited in mice

We analyzed four DNA vaccines based on DENV-2 NS1: pcENS1, encoding the C-terminal from E protein plus the NS1 region; pcENS1ANC, similar to pcENS1 plus the N-terminal sequence from NS2a (ANC); pcTPANS1, coding the t-PA signal sequence fused to NS1; and pcTPANS1ANC, similar to pcTPANS1 plus the ANC sequence. The NS1 was detected in lysates and culture supernatants from pcTPANS1-, pcENS1- and pcENS1ANC-transfected cells and not in cells with pcTPANS1ANC. Only the pcENS1ANC leads the expression of NS1 in plasma membrane, confirming the importance of ANC sequence for targeting NS1 to cell surface. High levels of antibodies recognizing conformational epitopes of NS1 were induced in mice immunized with pcTPANS1 and pcENS1, while only few pcENS1ANC-inoculated animals presented detectable anti-NS1 IgG. Protection against DENV-2 was verified in pcTPANS1- and pcENS1-immunized mice, although the plasmid pcTPANS1 induced slight higher protective immunity. These plasmids seem to activate distinct patterns of the immune system.     

登革3型病毒prM-E和NS1多基因重组质粒DNA免疫原性增强效果观察

目的　观察登革 3型病毒的prM E和NS1基因重组质粒DNA混合免疫对免疫原性的增强作用 ,为登革DNA疫苗混合免疫提供实验依据。方法　将登革 3型病毒的prM E和NS1基因重组质粒DNA分别混合及单独免疫BALB/c小鼠 ,采用中和试验及MTT法检测免疫小鼠血清中和抗体及脾细胞特异性CTL(cytotoxicT lymphocytes)杀伤率。结果　混合重组质粒DNA免疫组与单一prM E基因重组质粒DNA免疫组均在末次免疫后第 14天检测到中和抗体 ,在第 33天达到高峰 ,为 1∶32。在末次免疫后第 4 1天 ,当效靶比为 4 0∶1时 ,混合重组质粒DNA免疫组的特异性CTL杀伤率为 15 % ,而 2个单质粒DNA组分别为 10 .9%和 12 .4 %。结论　重组质粒DNA混合免疫可同时诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫 ,而且细胞免疫应答具有一定的增强作用 ,但没有出现特异性CTL杀伤率的协同增强效果。     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的：构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)gag—gp120嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法：将gag和gp120连接后的嵌合基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞72h后，取转染的Hela细胞进行RT—PCR检测和和Dot—ELISA分析。结果：重组质粒转染细胞的总RNA中，可扩增出目的基因的转录产物。Dot-ELISA的结果显示，目的基因在Hela细胞内得到表达。结论：成功地构建了表达gag—gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒，为HIV—1核酸疫苗的制备奠定基础。     

登革2型病毒NS3基因的酵母表达及其免疫反应性的测定

目的克隆登革2型病毒(DEN2)NS3基因并用酵母真核表达,获得全长的重组NS3蛋白质,为其结构与功能的研究提供条件。方法从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清液中提取RNA,通过RTPCR扩增NS3基因片段,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P.pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut 菌诱导表达,SDSPAGE检测表达产物。结果RTPCR得到1.85kb的NS3基因片段,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长NS3基因;Mut 酵母转化菌可分泌表达Mr约78000的蛋白质,与DEN2多抗和登革2型病毒患者恢复期血清的免疫印迹证实它为型特异的重组NS3蛋白质。结论成功将克隆的全长DEN2NS3基因在酵母菌中表达,获得的重组NS3蛋白质具有免疫反应性。     

两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析

目的　对从登革出血热 (denguehemorrhagicfever,DHF)病人血清分离到的一株登革 2型病毒 (denguevirustype 2 ,DEN 2B株 )和DEN 2NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析 ,了解其变异及分子进化特征。方法　利用RT PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段 ,PCR产物直接测序 ;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列 ,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树。结果　B株与NGC株E蛋白基因区第 1～ 4 76nt( 4 76bp)碱基序列存在 8个位点的差异 ;编码氨基酸存在 4个位置的不同 ;NS1基因区第 5 89～ 10 0 2nt( 4 13bp)碱基序列存在 7个位点的差异 ,编码氨基酸有 2个位置的改变 ;B株与NGC株和DEN 2 4 4株E区部分片段核苷酸同源性分别为99 .1%和 98.7% ;与NS1区部分片段核苷酸同源性分别为 98.3%和 98.1%。B株E基因、NS1基因序列已登录GenBank ,注册号分别为AY179733和AY2 384 71。结论　B株E、NS1基因序列和氨基酸序列与NGC株存在差异 ;B株与我国海南 1989年流行的DEN 2 4 4株和NGC株系统进化关系较近。     

免疫途径及载体对乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影响的研究

目的探讨ＤＮＡ载体结构及接种途径对ＤＮＡ疫苗免疫效果的影响。方法分别构建插入ＨＢＶ表面抗原编码基因的表达载体ｐｃＤＮＡ１．１／ＳＡ（无抗性基因）和ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ／ＳＡ（含氨苄青霉素抗性基因）,肌注小鼠后比较其诱生特异性免疫应答的能力;同时比较不同接种途径（肌内、皮内、皮肤划痕）及ＣｐＧ免疫刺激元件（ＩＳＳ）对ＤＮＡ疫苗诱生免疫效果的影响。结果ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ／ＳＡ的免疫效果优于ｐｃＤＮＡ１．１／ＳＡ。ｐｃＤＮＡ１．１／ＳＡ的免疫效果可被ＩＳＳ增强,而ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ／ＳＡ诱生特异性免疫应答的能力则可被ＩＳＳ抑制;诱生免疫应答的能力以肌内注射最强,皮内注射免疫其次,皮下划痕法较弱。结论不同ＨＢｓＡｇ表达载体诱生免疫应答的能力不尽相同;ＣｐＧ免疫刺激元件在决定ＤＮＡ疫苗免疫原性中起重要作用,可增强不含相应结构ＤＮＡ疫苗的免疫效果;皮内注射可诱发与肌内接种相似的免疫应答,是一种简便、有效的免疫接种途径     

中国株HIV-1核心蛋白Gag核酸疫苗的构建与表达

目的 构建含HIV－1中国流行株B亚型核心蛋白Gag基因的真核表达质粒，并在体外进行表达和鉴定。方法 将Gag基因插入到核酸疫苗载体质粒pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGAG。用脂质体法。将重组质粒转染人Hela细胞后进行表达产物的检测。结果 间接免疫荧光检测显示，转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。Western blot和Dot ELISA分析显示，重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的Gag蛋白。结论 构建的核酸苗可在体外进行表达，且表达的蛋白具有特异性。     

丙型肝炎病毒基因组部分E2／NS1蛋白基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达了丙型肝炎病毒基因组的部分Ｅ２／ＮＳ１蛋白（氨基酸３６４－５１２）。表达蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，主要表达带的分子量在～４３０００左右。表达蛋白用于检测已用Ｃ３３ｃ及Ｑ２２检测过的血清，发现Ｅ２ＮＳ１引抗体阳性率占Ｃ３３ｃ及Ｑ２２抗体阳性血清的２０％，尚没有发现单独Ｅ２／ＮＳ１抗体阳性的血清。