HSVTK/GCV自杀基因系统治疗乳腺癌的研究

 目的　探讨HSV TK/GCV自杀基因系统对小鼠乳腺癌细胞系MA782 / 5S 810 2体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法　采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染小鼠乳腺癌细胞MA782 / 5S 810 2 ,得到带有HSV TK基因的MA782 / 5S 810 2 /TK细胞 ,并将其分别用于体外和体内实验。结果　载体HSV TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示 ,当MA782 / 5S 810 2 /TK细胞数占混合细胞 10 %时 ,低浓度 (10 μg/ml)的GCV就可将 5 0 %左右的肿瘤细胞杀死。体内实验结果显示GCV可明显抑制MA782 / 5S 810 2 /TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成。实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变。结论　逆转录病毒可介导HSV TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782 / 5S 810 2并获稳定表达 ,HSV TK/GCV自杀基因系统在体内外对乳腺癌细胞均有杀伤作用 ,且存在明显的旁观者效应。     

自杀基因系统HSV-TK/GCV联合声动力疗法对人肺癌细胞NCI-446的体外杀伤实验

目的 探讨自杀基因系统HSV-TK/GCV联合声动力疗法对人小细胞肺癌NCI 446细胞的体外杀伤作用.方法 利用荧光和RT PCR检测方法,筛选出含HSV-TK基因的阳性克隆株NCI-446/TK.用MTT法检测不同浓度的GCV对NCI-446/TK细胞的杀伤效应,以及不同浓度混合NCI-446和NCI-446/TK细胞后的旁观者效应.同时,将HSV-TK/GCV自杀基因系统与声动力疗法进行联合,通过MTT法测定细胞存活率,并以流式细胞术检测细胞周期及凋亡率.结果 当GCV浓度为0.2 mg/L时,筛选出的阳性克隆株NCI-446/TK细胞的生长受到明显的抑制(P＜0.01),并且随着GCV浓度的递增,抑制效应越明显.当NCI-446/TK细胞占总细胞的10％时,有46％的混合培养细胞生长受到抑制(P＜0.01),其抑制效应随NCI-446/TK细胞所占比例的增加而增加.将HSV-TK/GCV自杀基因系统与声动力疗法进行联合后,其细胞存活率明显低于单一治疗组(P＜0.01),并且G0/G1期细胞所占比例及凋亡率均高于单一治疗组.结论 HSV-TK/GCV自杀基因系统的杀伤效应随着GCV浓度的递增而增强,并且有明显的旁观者效应.与声动力疗法联合后,其作用效果优于单一治疗组.     

HSV-TK/CD基因联合IL-12基因体内治疗肝癌

目的观察HSV-TK/CD基因联合IL-12基因体内治疗肝癌的疗效.方法SCID小鼠双侧腋部皮下植入5×105(0.2ml)HepG2细胞,同时腹腔注射PBL 2×107(0.5 ml).荷瘤小鼠分为4组,左侧腋部瘤内分别注射5×105(0.1 ml)丝裂霉素处理过的HepG2-IL-12细胞、5×105(0.1 ml)HepG2-pALBeAFP-CD/TK细胞或两者(各0.05 ml),次日起腹腔注射PBS或GCV 100 mg/kg 5-FC 500 mg/kg,连续10天.Ⅰ组:HepG2-IL-12 GCV,5-FC;Ⅱ组:HepG2-pALBeAFP-CD/TK PBS;Ⅲ组:HepG2-pALBeAFP-CD/TK GCV,5-FC;Ⅳ组:HepG2-pALBeAFP-CD/TK HepG2-IL-12 GCV,5-FC.治疗结束5天后作常规肿瘤组织病理学检查.结果与Ⅱ组比较,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组治疗侧均有明显的生长抑制,第30天较Ⅱ组分别减小20.5%、54.9%和87.6%,且Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组之间差异明显.Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组右侧肿瘤较Ⅱ组同侧显著缩小,分别达23.2%、24.9%和45.0%.结论pALBeAFP-CD/TK双自杀基因体内治疗肝癌有效.在免疫活性鼠,局部转染IL-12基因可增强双自杀基因的疗效和远处旁观者效应.     

HSV1-TK/GCV自杀基因系统治疗卵巢癌的体内杀伤作用

目的:探讨Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirustypeⅠthymidinekinase,HSV1TK)/丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)自杀基因系统对卵巢癌的体内治疗效果。方法:用携带TK基因的重组逆转录病毒转染人卵巢癌细胞系SKOV3,用G418筛选抗性克隆(命名为SKOV3/TK)。PCR方法检测TK基因整合情况。将SKOV3和SKOV3/TK细胞按不同比例混合培养,给与10mg/LGCV治疗,观察体外旁观者效应。再分别用含有不同SKOV3/TK浓度的细胞建立荷瘤鼠模型作为3个TK基因转染组,并以接种单纯SKOV3细胞的动物模型作为对照组。TK基因转染组均行GCV20mg/(kg·d)腹腔注射共9d,对照组给等体积生理盐水腹腔注射。绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率,并取瘤细胞做病理学检查。结果:体外混合培养细胞显示明显BSE,当SKOV3/TK细胞数占混合细胞数20%时,10mg/LGCV就可将约50%的混合细胞杀死。体内实验显示,20%、40%和100%TK基因转染组肿瘤体积与对照组比较,抑瘤率分别为38%、61%和99%,各组间两两比较差异有统计学意义,P<0.01(除20%TK基因转染组和40%TK基因转染组P值为0.001外,其余各组间P值均<0.001)。病理结果显示,TK基因转染组出现不同程度点、片状坏死,以100%TK基因转染组最重,残存的肿瘤均为坏死组织。结论:HSV1TK/GCV自杀基因系统对荷人卵巢癌皮下瘤裸鼠模型的肿瘤具有杀伤作用,同时存在BSE。这种杀瘤作用随着TK基因转染率的提高而增强。     

MicroRNA-122调控的TK基因有效降低TK/GCV治疗系统的肝毒性

目的：探讨利用肝脏特异性microRNA-122(miR-122)调控外源基因在肝细胞的表达,减轻单纯疱疹病毒1型胸苷激酶和更昔洛韦（herpes simplex virus type 1-thymidine kinase/gancyclovir,TK/GCV）治疗系统的肝毒性。方法：通过在相应基因的3′非翻译区（３′ＵＴＲ）插入miR-122靶序列,构建miR-122调控的pEGFP-122T、pLuc-122T和pTK-122T表达载体,分别转染miR-122阳性的Huh7肝癌细胞和miR-122阴性的HeLa宫颈癌细胞,观察细胞中报告基因的表达及TK/GCV的细胞毒杀伤作用。水动力法分别注射上述质粒至小鼠体内,冰冻切片和活体成像观察肝脏EGFP和Luc的表达,通过小鼠血清ALT、体质量变化、存活率和肝脏病理变化评价TK/GCV系统的肝毒性。结果：在Huh7细胞,miR-122靶序列的插入抑制了EGFP的表达和Luc的活性,减轻TK/GCV的毒性杀伤;而在HeLa细胞,miR-122靶序列的插入对报告基因表达和TK/GCV的杀伤无影响。体内实验结果显示,pEGFP-122T处理组的肝细胞不表达EGFP,而pEGFP处理组的肝细胞有30%高表达EGFP;与pLuc处理组相比,pLuc-122T处理组的Luc活性下调了33.70%。pTK处理组小鼠血清ALT显著升高、体质量进行性下降、肝脏出现明显病理损伤,进而引起小鼠死亡;而pTK-122T处理组小鼠血清ALT正常、无体质量下降、肝脏切片未见病理改变。结论：miR-122靶序列的插入可抑制外源基因在肝脏的表达,并可有效地降低TK/GCV系统的肝毒性。     

HSV-TK/GCV自杀基因系统联合不同分割剂量照射对人胶质瘤细胞的实验研究

脑胶质瘤对常规分割放疗的疗效较差,促使人们探索非常规分割放疗的价值.自杀基因治疗被认为是肿瘤基因治疗最有前景的策略之一,而肿瘤基因-放疗是近年提出的肿瘤治疗新思路.单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)-胸苷激酶(thymidine kinase,TK)(HSV-TK)/鸟嘌呤(ganciclovir,GCV)(HSV-TK/GCV)自杀基因系统治疗脑胶质瘤已进入临床Ⅲ期实验,但仍存在不足之处[1].Rogulski等[2]实验证明HSV-TK/GCV系统均能提高肿瘤对放射的敏感性.笔者通过逆转录病毒介导将HSV-TK转入人胶质瘤细胞系U251(U251/TK细胞)后联合不同分割方式照射,观察其杀伤效应,为临床改进胶质瘤治疗方案提供理论基础.     

HSV1-tk/GCV系统联合Topotecan治疗人卵巢癌的动物实验研究

目的探讨Topotecan能否增强HSV1-tk/GCV自杀基因系统对卵巢癌的体内治疗作用.方法 先用携带tk基因的重组逆转录病毒上清转染人卵巢癌细胞系SKOV-3,用含G418的培养液筛选抗性克隆(命名为SKOV-3/TK).PCR方法检测tk基因整合情况.用SKOV-3细胞建立荷瘤鼠模型作为对照组和Topotecan组.用SKOV-3与SKOV-3/TK细胞按82比例混合细胞建立者为HSV1-tk/GCV组和HSV1-tk/GCV联合Topotecan组;从用药第1天开始每5天测量肿瘤体积一次,至用药结束后一周,绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率,并取瘤组织做病理学检查.结果与对照组比较,HSV1-TK/GCV组和Topotecan组、联合用药组抑瘤率分别为38.8%、25.3%和89.7%,差异均有显著性,P＜0.01.组间两两比较差异亦有显著性,P＜0.01.病理显示实验组出现不同程度点、片状坏死,以联合用药组为重.结论HSV1-tk/GCV自杀基因系统具有强大的杀伤肿瘤效应及旁观者效应,联合Topotecan化疗将起到协同作用.     

双自杀基因CD和TK对K562细胞体内外杀伤作用的实验研究

目的:探讨双自杀基因CD和TK对K562细胞的体内外抑制作用及前体药物对肿瘤的杀伤作用。方法:将目的基因转染入K562细胞,MTT法观察细胞在体内外的增殖状况及5-FC/GCV对转染细胞的杀伤作用,电子显微镜观察其超微结构变化。将K562/CDgly TK和K562细胞接种于裸鼠皮下,观察各种肿瘤细胞在体内的成瘤情况及对前体药物治疗的敏感性。结果:单独使用GCV或5-FC对K562及K562/CDgly TK细胞产生明显的杀伤作用,联合应用该2种药物对肿瘤细胞的杀伤作用更强。将K562细胞和K562/CDgly TK细胞接种于小鼠皮下后小鼠成瘤率为100%,GCV或5-FC可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成,联合应用GCV和5-FC治疗K562/CDglyTK细胞在小鼠体内形成的肿瘤,较单独应用GCV和5-FC及对照组小鼠形成的肿瘤体积明显缩小,生存期也明显延长。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有明显的抑制作用,可增加前体药物GCV和5-FC对瘤细胞的杀伤率。     

hNIS/TK基因共转染介导131I/GCV对肝癌细胞株的毒性作用

背景与目的:与传统的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)/丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)肿瘤自杀系统相比,人钠/碘同向转运体(human sodium-iodide symporter,hNIS)是近年来发现的新型治疗基因.然而,两者的疗效尚需进一步提高.本研究旨在探索hNIS介导的放射性核素体系与HSV-TK/GCV自杀基因体系对肝癌细胞的联合毒性作用.方法:构建EF1-a启动子调控下的hNIS的表达载体与CMV启动子调控下的GFP和HSV-TK共表达载体,慢病毒包装后转染肝癌细胞HepG2,荧光显微镜下观察重组肿瘤细胞HepG2/NTG荧光蛋白的表达;采用RT-PCR技术进一步检测目的基因hNIS和HSV-TK的表达情况;MTT检测GCV对HepG2/NTG的杀伤作用;摄碘试验及流出试验评价HepG2/NTG对碘的摄取及滞留情况;最后通过克隆形成实验评价GCV和131I对HepG2/NTG的单独及联合杀伤作用.结果:RT-PCR技术、荧光显像证实hNIS、GFP和HSV-TK基因在肝癌细胞中成功表达;与对照组相比,HepG2/NTG的摄碘高出76倍,20 min摄碘率最高,其后表现出碘外流,有效半衰期不到10 min,同时这种碘摄取能被NaClO4特异性抑制.GCV或131I对HepG2/NTG的毒性作用呈现剂量依赖性:50μg/mL GCV作用72 h后,实验组细胞的存活率仅为(33.98±2.71)%;放射性浓度为7.4MBq/mL的131I处理7 h后,细胞的存活率仅为(41.17±0.72)%;GCV和131I联合作用后,细胞的存活率仅为(8.55±1.22)%,较单一药物作用细胞存活率下降了6倍.结论:131I/GCV对重组肝癌细胞产生显著的毒性作用,提示慢病毒介导hNIS/TK基因共转染介导肿瘤的放射化学治疗是可行的.     

HSV1-TK/GCV系统作为肿瘤疫苗"死亡开关"的研究

背景与目的:肿瘤活疫苗有高效的抗肿瘤免疫能力,但其体内增殖性限制了进一步的临床应用。本研究将Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1鄄TK/GCV)系统作为肿瘤活疫苗的“死亡开关”,以期控制疫苗在体内的存活状态,并探讨其作用机制。方法:以逆转录病毒为载体将HSV1鄄TK基因转导入大鼠卵巢癌细胞株NuTu鄄19,经G418筛选出阳性克隆后与Fischer344大鼠骨髓来源的树突细胞融合,制成携带有HSV1鄄TK基因的卵巢癌DC活疫苗(FC/TK)。以RT鄄PCR和Westernblot检测FC/TK细胞中的HSV1鄄TK表达。体外以XTT法检测不同浓度GCV对FC/TK的体外杀伤作用;以流式细胞仪和Hoechst染色法检测GCV作用5天后FC/TK的凋亡现象。体内实验中,取大鼠经足垫皮下接种FC/TK后分为两组:FC/TK GCV组大鼠再予GCV腹腔注射7天;FC/TK 生理盐水组作为对照组。接种FC/TK后观察90天,记录注射部位有无肿瘤形成及各脏器的肿瘤转移情况。结果:FC/TK中有HSV1鄄TK的表达,在体外GCV对FC/TK的杀伤率可达86.25%,其中大于80%的FC/TK发生凋亡,并出现细胞核浓缩、边集等凋亡现象。FC/TK 生理盐水组共有3只(60%)的大鼠注射部位出现低分化腺癌;而FC/TK GCV组未见局部肿瘤形成及脏器转移。结论:HSV1鄄TK/GCV通过诱导肿瘤活疫苗发生凋亡而起到控制其存活状态的作用。