噬菌体表达短肽模拟旋毛虫抗原表位及其抗血吸虫保护性免疫研究

目的　从噬菌体随机肽库中筛选出模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子 ,探讨其抗血吸虫的交叉免疫保护效果。　方法　以纯化的旋毛虫感染鼠血清IgG为配基 ,亲合筛选法富集特异性噬菌体 ,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性 ;混合噬菌体克隆经皮下免疫小鼠 3次 ,攻击感染后第 4 5天剖杀小鼠 ,观察减虫和减卵效果。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体得到了有效的富集 ,第三轮洗脱噬菌体的产量约为第一轮的 15 0倍。随机挑取 2 4个噬菌体克隆经ELISA测定 ,有 2 1个克隆能与旋毛虫感染鼠血清IgG特异性反应。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率与减卵率分别为 4 2 8%与 6 6 3% (P <0 0 0 1)。　结论　利用噬菌体随机肽库技术可获得模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导明显的抗血吸虫的保护性免疫。     

日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位，并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。方法用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机12肽库进行3轮亲和筛选，随机挑取18个噬菌体克隆用Dot-ELISA检测其特异性，并对其中的4个阳性克隆进行测序。分别在0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠3次，第6周每鼠经腹部感染40条日本血吸虫尾蚴，42d后剖杀冲虫，计数虫数和每克肝卵数。结果经3轮筛选，特异性噬菌体富集了200多倍，随机挑取的18个克隆经Dot-ELISA鉴定有17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比，混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为26．57％，减卵率为65．34％。结论采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子，这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位

目的　从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位。方法　制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体 Ig G,用此 Ig G包被酶标板对 12肽库进行反复淘选 ,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析。结果　获得一批阳性噬菌体克隆 ,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值 ,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别 ,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性。结论　获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆 ,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础。     

日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位 ,并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。　方法　用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机 12肽库进行 3轮亲和筛选 ,随机挑取 18个噬菌体克隆用Dot ELISA检测其特异性 ,并对其中的 4个阳性克隆进行测序。分别在 0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠 3次 ,第 6周每鼠经腹部感染 40条日本血吸虫尾蚴 ,42d后剖杀冲虫 ,计数虫数和每克肝卵数。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体富集了 2 0 0多倍 ,随机挑取的 18个克隆经Dot ELISA鉴定有 17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的 4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 2 6.5 7% ,减卵率为 65 .3 4%。　结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

两种方法筛选噬菌体肽库所获日本血吸虫抗原模拟表位的抗原性比较

目的比较两种不同方法筛选噬菌体肽库所获得的日本血吸虫抗原模拟表位的抗原性.方法以日本血吸虫病患者血清免疫球蛋白(Sj-Ig)作为靶分子, 分别以噬菌体12肽库(SjA)和经过蚯蚓免疫兔血清免疫球蛋白(L-Ig)筛选一轮后的噬菌体12肽库(SjB)为原肽库,进行3轮吸附-洗脱-扩增免疫筛选.随机挑取SjA和SjB蓝色噬菌斑各24个, 扩增后用ELISA方法检测其抗原性.结果 24个SjA克隆中有6个可以与Sj-Ig特异结合, 其中A491 nm值较高的2个克隆具有较好的特异性和敏感性;24个SjB克隆中有10个可以与Sj-Ig特异结合, 其中A491 nm值较高的5个克隆具有较好的抗原性.比较SjA 和SjB两组间克隆的抗原性,结果显示SjB的目的克隆具有更好的特异性和敏感性.结论从SjA 和SjB中均筛选到了对日本血吸虫病具有较高潜在诊断价值的抗原模拟表位,提示以异源性抗体结合后的肽库作为原肽库来筛选寄生虫抗原模拟表位是可行的,同时也为从噬菌体肽库中筛选抗原模拟表位提供了一个新的实验方法.     

用噬菌体随机肽库鉴定日本血吸虫22.6kDa抗原分子的表位

目的　筛选和鉴定日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6)的表位。　 方法　用纯化的抗Sj2 2 .6的多克隆抗体IgG对噬菌体十二肽库进行 5轮免疫学筛选 ,挑取克隆 ;采用Westernblotting免疫识别 ,将获得的阳性克隆免疫小鼠 ,并采用dot ELISA筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗Sj2 2 .6抗体的阳性克隆 ;测定核苷酸序列 ,分析其表位与Sj2 2 .6抗原的同源性。　结果　经 5轮免疫学筛选后挑取的 1 4个克隆 ,用Westernblotting方法均能被抗Sj2 2 .6抗体识别。经动物免疫初步实验筛选 ,共获得 6个免疫原性较强的阳性克隆 ,测序结果获得 4种不同表位 ,其中 1种表位与Sj2 2 .6抗原具有较高的同源性 ,其余 3种表位与其无一级结构的同源性。　结论　获得的 4种日本血吸虫中国大陆株抗原表位 ,1种可能为结构表位 ,3种为模拟表位     

日本血吸虫辐照尾蚴模拟表位的筛选和初步鉴定

目的从噬菌体表面显示随机肽库中筛选日本血吸虫辐照尾蚴抗原模拟表位。方法用Sepharose4B亲和层析法,从日本血吸虫辐照尾蚴免疫鼠血清中纯化抗体,经正常血吸虫尾蚴抗原吸收后,用于12肽噬菌体随机肽库的免疫筛选。经三轮筛选,随机挑取20个噬菌体克隆,经DNA序列分析后,对各独立表位进行免疫学鉴定。结果DNA序列分析,获得4个有序列重复的噬菌体克隆;Dot-ELISA分析显示,4个克隆均能被辐照尾蚴免疫血清中IgM型抗体识别,反应强度有一定差别;P1和P2克隆还能被IgG型抗体识别。结论从噬菌体随机肽库中成功筛选到日本血吸虫辐照尾蚴抗原模拟表位。     

应用噬菌体十二肽库筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位

目的从噬菌体12肽库中筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。方法将卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白(Ig)作为靶分子筛选噬菌体随机12肽库。经过5轮淘筛，随机挑取24个蓝色噬菌斑进行扩增，以ELISA检测其免疫活性并分析其诊断并殖吸虫病的价值。结果24个克隆中有12个可以被卫氏并殖吸虫病患者血清Ig所识别，其中有2个克隆(P5、P6)具有较好的特异性和敏感性，可能为特异性的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。结论应用噬菌体肽库筛选可以获得卫氏并殖吸虫抗原模拟表位，为并殖吸虫病诊断抗原和短肽疫苗的研究提供了新的方法学依据。     

日本血吸虫22.6kDa有效抗原表位对小鼠免疫保护性的研究

目的研究日本血吸虫(中国大陆株)22.6 kDa有效抗原表位对小鼠的免疫保护性,预测其在抗血吸虫感染中的作用.方法用纯化的抗Sj 22.6 kDa的多克隆抗体IgG对噬菌体12肽库进行5轮免疫学筛选,挑取克隆,经Western-blot免疫识别、动物初筛及序列分析后,将获得的阳性克隆免疫BABL/c小鼠.结果共获得4个有效抗原表位,各免疫组和对照组相比,4种表位混合免疫组小鼠,获得了39.5%(P＜0.05)的减虫率及57.1%(P＜0.01)肝总减卵率;4种表位分别免疫4组小鼠,各组分别获得了27.5%(P＜0.05)、5.4%(P＜0.05)、22.8%(P＜0.05)、11.6%(P＜0.05)的减虫率及41.4%(P＜0.01)、29.7%(P＜0.05)、32.2%(P＜0.05)、30.9%(P＜0.05)肝总减卵率.结论所获得4种有效抗原表位均可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力,可望为血吸虫疫苗研究增加新的内容.     

日本血吸虫抗原模拟表位免疫学活性的初步研究

目的研究从噬菌体12肽库中筛选得到的日本血吸虫抗原模拟表位的免疫学活性。方法以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白(Ig)作为靶分子，筛选噬菌体12肽库。经过3轮吸附-洗脱-扩增的淘筛过程．在筛选得到的阳性噬菌斑中随机挑取42个扩增，用ELISA检测不同寄生虫病患者和正常人血清，以分析其敏感性和特异性。并进一步免疫昆明株小鼠，经日本血吸虫尾蚴攻击感染后剖检，计算减虫率和减卵率，以分析其在小鼠体内诱导的免疫保护性。结果在挑取的42个阳性克隆中，有9个与日本血吸虫急感患者血清有不同程度的结合(6．25％～100％)。除其中1个灵敏性较低的克隆与其它寄生虫病患者血清有一定的交叉反应外，其余均未发现。而经其免疫后的小鼠也分别获得了29．3％减虫率和35．9％减卵率。结论从噬菌体12肽库中筛选到的日本血吸虫抗原模拟表位具有较高的特异性和敏感性，并能够在小鼠体内诱导一定的免疫保护力。     

大鼠抗感染血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　探讨大鼠抗日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)感染的分子机制 ,为血吸虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法　用Sj感染大鼠血清筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆cDNA插入片段进行PCR扩增及测序分析。 结果　对cDNA文库中约 3× 10 5个噬菌斑进行筛选 ,获 7个阳性克隆 ,其插入基因片段大小为 0 9kb～ 2 0kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中R3与Sj线粒体基因明显同源 ;R5为新基因序列 ,命名为Sj-Cs2 (GenBank的登录号为AY0 36 5 80 ) ,经计算机分析该基因片段编码 2 0 6个氨基酸组成的跨膜蛋白 ,Sj-Cs2蛋白含有 3个蛋白激酶C磷酸化位点和 6个N -肉豆蔻酸化位点 ;其余序列亦为新基因片段 ,但无完整编码框。结论　筛选获得了与大鼠抗Sj感染有关的基因克隆 ,相关克隆cDNA全长的获取、新基因的结构与功能以及免疫学特性值得深入研究     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫筛选及其生物信息学分析

目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCHGC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。     

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和鉴定

目的　构建抗日本血吸虫噬菌体抗体文库 ,以探索制备日本血吸虫病诊断用单克隆抗体的新方法。方法　用文库构建试剂盒 ,以日本血吸虫感染小鼠脾脏为材料 ,建立噬菌体抗体文库 ,并对其进行鉴定。结果　构建完成了一滴度为6 42× 10 10 cfu/ml的噬菌体抗体库。结论　日本血吸虫噬菌体抗体库的建立为对文库进行进一步的筛选、表达奠定了基础     

水牛感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 筛选新的有潜质的日本血吸虫保护性抗原分子编码基因。方法 用水牛感染血清对日本血吸虫(Schistosoma Japonicum，Sj)成虫cDNA文库进行免疫筛选，将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。结果 3轮筛选后，将7个阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切并PCR扩增显示，插入的日本血吸虫cDNA片段大小在0．8～2．0kb之间，选取其中4个经DNA测序分析，发现2个未曾报道过的日本血吸虫新基因，分别命名为Sj-IB1和Sj-Rho GTPase-like gene，并在Gene Bank登记注册。结论 水牛感染血清可识别日本血吸虫的特异性抗原分子，这些抗原分子的免疫保护作用值得进一步研究。     

血吸虫感染抗性人血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库

目的分析血吸虫感染抗性人血清中起免疫保护作用抗体针对的日本血吸虫蛋白抗原谱,为日本血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原分子。方法采集血吸虫流行病区感染抗性人血清,免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对获得的阳性克隆核苷酸进行序列分析,并利用软件对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测。结果共筛选出29个持续阳性克隆,对其进行测序,获得25个基因,包括5种已知基因(其中日本血吸虫肌球蛋白12个、丝氨酸蛋白酶抑制剂2个、细胞色素b1个、延伸因子1-α1个和线粒体编码区1个)和5个未知基因,软件分析显示不同抗原分别具有多个不同的抗原表位。结论获得的阳性克隆插入基因片段可能编码潜在的日本血吸虫病疫苗分子,其中日本血吸虫肌球蛋白为主要抗感染蛋白分子。     

应用噬菌体随机肽库研究细粒棘球蚴抗原模拟表位

用抗细粒棘球蚴B抗原(EgB)多克隆抗体筛选噬菌体随机7肽库。经过5轮筛选后,噬菌体回收率从第1轮的4.15×10-5增加到第5轮的4.30×10-2,说明阳性克隆得到富集。随机挑取60个蓝色噬菌斑进行扩增,对其核苷酸序列进行测定分析并与EgB进行同源性比较。采用ELISA法对阳性噬菌体与抗EgB多克隆抗体结合特性进行检测,共检测出45个与抗EgB多克隆抗体结合的克隆株(阳性率为75%),其递呈的七肽序列与EgB的同源性低。采用ELISA法检测所选多肽对棘球蚴病所致过敏性休克患者抗血清的反应性,结果显示,细粒棘球蚴病患者抗血清与45个阳性噬菌体克隆反应的吸光度(A410值)比其与7肽库反应的A410值大2倍以上,该45个阳性噬菌体克隆与EgB多克隆抗体的结合是特异的。提示成功分析细粒棘球蚴囊液B抗原肽表位以及模拟表位。     

日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建

目的 构建日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。 方法 用Trizol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA，分离纯化mRNA，经随机引物反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头，再用EcoRⅠ和HindⅢ消化，使其成为两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。收集300 bp以上的双链cDNA片段，与T7Select 10-3b载体连接，经体外包装后，以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。通过滴度测定及PCR技术鉴定文库质量，用7种特异性引物以PCR法从文库中钓取目的基因以检测文库的代表性。 结果 原始文库的库容量为4.98×10⁶ pfu，扩增后文库滴度为3.85×10¹¹ pfu/ml。对随机挑取的96个噬菌斑进行PCR鉴定，重组率为93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp。7种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。 结论 构建了日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。     

噬菌体表达的短肽模拟蚯蚓与日本血吸虫共同表位研究

目的采用噬菌体呈现技术,获得蚯蚓与血吸虫的共同表位。方法依次以日本血吸虫病患者血清(SjIg)、蚯蚓免疫兔血清(LtIg)和LtIg、SjIg作为靶分子,以噬菌体12肽库的第三轮扩增肽库为源肽库,进行2轮吸附-洗脱-扩增免疫筛选。每轮随机挑取蓝色噬菌斑各21个,用ELISA方法检测其抗原性,并对其反应性较好的阳性克隆进行测序。结果获得4个阳性克隆可与SjIg、LtIg较好的结合。得到3个阳性克隆的氨基酸序列,它们有蚯蚓与血吸虫共同的线性表位。结论结果说明,从12肽库筛选蚯蚓与寄生蠕虫抗原共同表位是可行的,同时也为获得寄生蠕虫共同抗原提供了一条新的途径。     

日本血吸虫童虫cDNA文库免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

用日本血吸虫感染14 d的小鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,将获得的7个阳性克隆进行核苷酸序列同源性分析,结果显示其中一个克隆所测序列与日本血吸虫HSP70有很高的同源性（分值score=650）,另有2个克隆所测序列分别与已报道的日本血吸虫FABP（score=229）和含锌指结构的CDGSH型蛋白样蛋白（score=246）明显同源,其余4个未找到已知的同源序列,为新基因。4个新基因序列已被GenBank接受（登录号为EU121231、202646、202647和202648）。