人源Dickkopf-1真核表达质粒的构建

目的构建人源Dickkopf-1（DKK-1）基因的真核表达质粒,为进一步探讨DKK-1的生物学功能奠定基础。方法Trizol法从人新鲜胎盘组织中抽提总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增人源DKK-1的基因序列,将真核表达载体pcDNA3.1和DKK-1的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pcDNA3.1-DKK-l,转化至大肠杆菌后经菌落PCR、NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定。结果RT-PCR法从人胎盘中扩增出816bp大小的目的片段,重组质粒转化至大肠杆菌后菌落PCR同样扩增出816bp大小的目的片段,NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒能切出两条目的条带,测序后与Genbank中DKK-1的cDNA对比,证明DKK-1的基因序列完全正确。结论成功构建了pcDNA3.1-DKK-1重组质粒,为研究人源DKK-1的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础。     

肾上腺髓质素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建大鼠肾上腺髓质素(ADM)真核表达质粒,观察其在大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达。方法提取大鼠肾上腺组织总RNA,RT-PCR扩增ADM全长cDNA;将扩增产物连接于pMT-18T载体,双酶切及测序鉴定重组质粒。用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ分别对pMT-18T-ADM和真核表达质粒pcDNA3.1双酶切;将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切鉴定。将重组质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,RT-PCR检测ADM表达。结果特异扩增出ADM片段,大小为585 bp;片段成功插入pcDNA3.1载体中。RT-PCR方法证明NRK-52E中存在ADM高表达。结论成功构建大鼠ADM真核表达质粒,并将其成功转染NRK-52E。     

乙酰胆碱受体α1亚基真核表达载体的构建

目的：构建含人乙酰胆碱受体（AChR）α1亚基N末端主要免疫区205个氨基酸（AChRα205）编码基因的真核表达载体。方法：以pMARα205为模板PCR扩增AChRα205。酶切后将PCR产物插入到载体pcDNA3.1（＋）的EcoRⅠ、XhoⅠ位点之间,重组子经转化E.coliDH5α菌、筛选、酶切并测序进行鉴定。结果：用PCR方法从pMARα205中扩增出了约644bp的片段,构建的重组质粒经双酶切可得到约633bp的片段,大小与预期结果相符,测序表明序列正确。结论：用基因重组方法获得了含正确目的基因序列的重组质粒pcDNA3.1（＋）/AChRα205。     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fim H基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建以尿路致病性大肠杆菌临床分离株Ⅰ型菌毛编码基因fimH 为目的基因的真核表达载体pcDNA3.0-fimH.方法 提取尿路致病性大肠杆菌临床株基因组DNA,PCR扩增fimH基因片段,然后克隆至TA载体,通过PCR 、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段用限制性内切酶切下克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒.通过PCR 、酶切对重组质粒pcDNA3.0-fimH进行鉴定.结果 PCR 法克隆出全长为903 bp 的fimH基因并构建了pcDNA3.0-fimH重组质粒.结论 本研究成功构建尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒pcDNA3.0-fimH,为尿路致病性大肠杆菌基因疫苗的研制奠定了基础.     

阴道毛滴虫黏附蛋白33基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定阴道毛滴虫黏附蛋白33基因(adhesionprotein33gene,ap33gene)真核表达载体。方法提取阴道毛滴虫分离株基因组DNA,PCR扩增黏附蛋白33基因,克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定出的重组质粒pMD-18T-ap33和pcDNA3.1( )空质粒经BamHⅠ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,凝胶电泳后回收ap33目的基因和pcDNA3.1( )空质粒酶切片段,将ap33基因亚克隆入pcDNA3.1( )载体并进行筛选和鉴定。结果PCR扩增出阴道毛滴虫黏附蛋白33基因,重组质粒pMD-18T-ap33经双酶切,PCR及序列分析,ap33基因的长度为930bp,与GenBank上公布的ap33基因序列同源性达99%。经凝胶电泳、PCR鉴定和限制性酶切鉴定,构建出pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。结论成功构建了阴道毛滴虫pMD-18T-ap33克隆质粒及pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。     

hURAT1基因真核表达重组体的构建及意义

目的 构建pcDNA3.1(-)/hURAT1真核表达重组体.方法 提取人全血基因组DNA,进行PCR扩增,将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞.重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后,应用核苷酸序列测定方法进行鉴定.结果 PCR扩增得到hURAT1第2外显子至第5内含子长1 958 bp的基因片段.该片段与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞.重组质粒经酶切和核苷酸序列测定方法鉴定,证实hURAT1片段插入序列和方向正确.结论 hURAT1基因组DNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的序列和方向正确,可用于后续基因功能研究,尤其是编码序列和内含子序列变异的功能研究.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.     

人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6 P-1-GST-PTEN构建

目的构建人第10号染色体缺失的磷酸酶（PTEN）真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应。方法根据基因库中PTEN序列,设计并合成相关引物。用基因重组技术将目的片段插入pCDNA3.1-Flag和pGEX-6P-1-GST空载质粒中,通过PCR和DNA测序,鉴定插入基因序列。将pCDNA3.1-Flag-PTEN转染到HEK 293细胞,将pGEX-6P-1-GST-PTEN转到E.coli BL-21中,通过Western blotting和考马斯亮蓝染色法分别检测PTEN蛋白的表达。结果PCR显示目的基因插入成功;DNA测序显示插入序列与目的基因序列完全一致,无位点突变;Western blotting和考马斯亮蓝染色法证实融合质粒可以在生物体内正确表达。结论成功构建PTEN相关真核和原核融合质粒并正确表达,为PTEN在帕金森疾病中的机制研究奠定了基础。     

PTEN基因真核表达载体重组质粒的构建及序列测定

目的 构建编码肿瘤抑制基因PTEN的正义与反义真核表达重组载体并进行其序列测定．方法 新鲜胎盘组织抽提基因组RNA；根据基因库PTEN基因序列分别设计合成三对反义引物及一对正义引物，采用RT-PCR法扩增编码PTEN的基因片段；将PTEN基因定向克隆到pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达载体，筛选阳性重组子并鉴定；对重组子进行序列测定。结果RT-PCR所扩增的PTEN基因片段为241，239，227bp(反义)及1209bp(正义)，表明所克隆的基因为编码PTEN的基因片段。结论 成功构建编码肿瘤抑制基因PTEN的pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达质较pcDNA3．1／Hygro(—)PTEN。     

PTEN影响宫颈癌Hela细胞对顺铂的化疗敏感性

目的:通过转染PTEN基因表达载体,提高宫颈癌Hela细胞中PTEN的表达水平,观察能否影响Hela细胞对顺铂的敏感性,并探讨其分子学机制.方法:将培养的宫颈癌Hela细胞分为空白对照(未转染质粒的Hela细胞)、质粒对照(转染空质粒的Hela细胞)和PTEN转染(转染PTEN表达载体的Hela细胞)3组.分别用RT-PCR和Western检测各组Hela细胞中PTEN的mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测各组Hela细胞对顺铂的化学敏感性;RT-PCR检测各组Hela细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的表达水平.结果:PTEN转染组Hela细胞中PTEN的表达水平比另2组细胞显著增高(P＜0.01);经顺铂处理后,PTEN转染组Hela细胞生长抑制率比其它2组显著增高(P＜0.01),PTEN转染组Hela细胞中PI3K被显著抑制(P＜0.01).结论:PTEN能增强宫颈癌Hela细胞对顺铂的化疗敏感性,它可能通过下调Hela细胞中PI3K而导致Hela细胞对顺铂耐药性下降.     

PRL-3调节PI3K信号通路在促进结肠癌细胞增殖侵袭中的作用

【目的】 研究肝再生磷酸酶-3 (PRL-3)的过表达与PI3K信号通路的调节及其与结肠癌细胞增殖侵袭的关系?【方法】 构建稳定转染PRL-3基因和空白对照质粒的结肠癌细胞株LoVo- PRL-3和LoVo-VC,用qRT-PCR和Western blot的方法对miR-21及其靶蛋白PTEN的表达进行检测,在稳转细胞株中转染miR-21或对其进行敲除,用CCK-8?Tanswell实验对细胞的增殖侵袭能力的变化进行研究?【结果】 LoVo- PRL-3细胞的增殖侵袭能力要强于对照组LoVo-VC细胞?在结肠癌细胞株LoVo-PRL-3中miR-21的表达上调而PTEN的表达被下调,在LoVo-VC细胞中过表达miR-21促进了细胞的增殖侵袭并降低PTEN的表达,而在LoVo- PRL-3细胞中敲除miR-21抑制了细胞的增殖侵袭并能部分恢复PTEN的表达?【结论】 PRL-3通过上调miR-21抑制PTEN的表达,调节了PI3K信号通路,从而促进了结肠癌细胞的增殖侵袭?     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及对人卵巢癌细胞系SW626增殖的影响

目的 构建抑癌基因PTEN的真核表达载体,研究外源性PTEN基因稳定表达对人卵巢癌细胞系SW626体外增殖的影响.方法 构建PTEN基因的真核表达载体pcDNA3.1/PTEN,转染重组质粒pcDNA3.1/PTEN于体外培养的人卵巢癌细胞系SW626,筛选并获得稳定表达PTEN基因的细胞克隆,应用RT-PCR和western blot分析PTEN基因的mRNA及蛋白质表达,MTT实验分析细胞增殖能力.结果 稳定转染PTEN基因的细胞系有外源目的 基因的mRNA及其蛋白表达.MTT实验表明,pcDNA3.1/PTEN 转染组细胞增殖能力低于pcDNA3.1(-)转染组和对照组 (P＜0.05).结论 外源性抑癌基因PTEN的稳定表达可抑制人卵巢癌细胞系SW626的增殖.     

野生型抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建野生型PTEN基因真核表达载体pcDNA3.0-PTEN,并进行鉴定.方法：参照野生型PTEN基因mRNA全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点.从正常人外周血淋巴细胞中提取mRNA作为模板合成PTEN cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片段,经双酶切后定向克隆至pcDNA3.0真核表达载体中,蓝白斑试验筛选阳性重组质粒.分别经双酶切、特异PCR及测序法对重组质粒进行鉴定.结果：双酶切和特异PCR结果表明克隆的基因片段约为1.2 kb;测序法进一步证实该基因为野生型PTEN编码基因,经NC-BI BLAST分析与GenBank中PTEN基因序列同源性为99.92%,编码的氨基酸同源性为100%.结论：成功构建了PTEN真核表达载体pcDNA3.0-PTEN,为研究PTEN在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

PTEN基因对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性影响的研究

目的研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性的影响。方法将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞（pBp-PTEN-BIU87）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞（pBp-BIU87）和正常BIU-87细胞为对照,用RT-PCR检测PTEN的表达情况,应用MTT分别研究转染前、后膀胱癌细胞对不同浓度抗癌药物丝裂霉素MMC（1、10和100g/mL）、康朴赛星（0.25、2.5和25g/mL）和吡柔比星（2、20和200g/mL）的抑制率和敏感性的变化。结果 RT-PCR证实PTEN在转染的BIU-87细胞中能稳定表达。PTEN转染后,BIU-87细胞对MMC的药物抑制率和敏感性明显提高,对吡柔比星和康朴赛星的药物抑制率和敏感性无明显变化。结论 PTEN基因转染能提高人膀胱癌细胞系BIU-87对某些抗癌药物的敏感性,作用的强弱取决于药物的作用机制。     

人抑癌基因p53与PTEN的CRISPR-Cas9导向RNA靶点筛选与效率验证

目的：探讨应用新兴基因编辑技术规律性成簇的间隔短回文重复序列-核酸酶系统（CRISPR-Cas9）对人体内2个抑癌基因p53与PTEN进行编辑的可行性,并通过体外检测研究其编辑效果,为原代细胞向肿瘤细胞转化及建立人源化小鼠肿瘤模型提供实验研究工具。方法：序列分析确定p53及PTEN基因各亚型mRNA剪辑的共同外显子区域,针对该区域进行软件评分,设计选择针对p53及PTEN基因的CRISPR-Cas9导向RNA （sgRNA）靶点各2个,即p53-1、p53-2、PTEN-1和PTEN-2。构建共表达sgRNA与Cas9-P2A-GFP的CRISPR-Cas9质粒。选择处于对数生长期的293T细胞,将其分为对照组（未转染质粒的野生型293T细胞）和实验组（利用Lipofectamine2000转染sgRNA-Cas9-P2A-GFP共表达质粒的293T细胞）,流式细胞术分选实验组绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞（成功转染质粒的细胞）,2周扩增培养后提取基因组DNA,PCR扩增基因组DNA包含突变位点的区段,将扩增产物凝胶电泳后胶回收,连接至pEASY-Blunt Zero克隆载体中,转化,挑取单克隆菌斑培养,提取质粒DNA测序,对比对照组与实验组测序结果后确定RNA介导的特异基因位点突变效率。结果：转染sgRNA-Cas9-P2A-GFP质粒的实验组流式细胞术分选后GFP阳性率高达82%,与分选前（4%）比较明显升高（P<0.05）。对分选培养后的细胞提取基因组PCR,其中包含p53突变位点的扩增片段长度均为612 bp,而包含PTEN-1突变位点的扩增片段长度为667 bp,包含PTEN-2突变位点的扩增片段长度为947 bp。对比实验组基因测序结果与未经sgRNA-Cas9-P2A-GFP质粒转染的对照组野生型细胞测序结果,p53-1、p53-2和PTEN-2诱导的突变效率分别为54.5%、45.5%和33.3%。结论：针对人p53及PTEN基因设计的sgRNA p53-1、p53-2和PTEN-2能够在基因组水平较高效率地成功介导Cas9进行位点特异性的基因编辑。     

恢复野生型PTEN基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468体外生物学行为的影响

目的研究野生型PTEN基因转染对人炎性乳腺癌MDA—MB-468细胞体外生物学行为的影响及机制。方法应用基因重组技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN，用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA—MB-468，用RT—PCR、免疫组化及免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达，并用免疫印迹方法检测转染后，在表皮生长因子的诱导下，磷酸化蛋白激酶B（PKB／Akt）的表达，四甲基唑蓝（MTT）法分析细胞增殖。Annexin V—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果RT—PCR、免疫组化及免疫印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达，且显示转染组在表皮生长因子的诱导下，p-Akt蛋白表达下调。MTT检测表明pcDNA3．1-PTEN转染组活细胞数较其它各组均低（P〈0．01），流式细胞分析其凋亡率达21．68％。结论野生型PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导乳腺癌MDA—MB-468细胞凋亡。     

Construction and Expression of Human PTEN Tumor Suppressor Gene Recombinant Adenovirus Vector

Phosphatase and tensin homologue deleted onchromosome10(PTEN)is a newtumor suppres-sor gene and possesses mutation in multiple kindsof tumors which include breast cancer[1].Teng[2]found the incidence for loss of heterozygosity(LOH)in breast cancer speci mens was48%(32/67),and the mutation and inactivation of PTENgene plays a central role in cell migration,growthandinvasion of breast cancer[3].This study ai ms atestablishing a kind of proliferative defective recom-binant adenovirus vector A…