利用膜片钳技术对急性分离小鼠螺旋神经节神经元的电生理研究

目的 探讨小鼠螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons，SGN)的电生理特性。方法 应用全细胞电压钳技术对急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞膜上的离子通道电流进行记录和分析。结果 在SGN细胞膜上记录到对氯化四乙胺、4-氨基吡啶敏感的外向延迟整流钾电流和瞬时钾电流，以及对河豚毒素敏感的内向钠电流。并且离子通道活动具有明显的电压依赖性，在没有记录到钠电流的细胞记录到延迟整流钾电流。结论 急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞的电生理特性可为听觉传导机制的研究提供了重要的参考，并指导下一步通道药理学的研究。     

庆大霉素对小鼠螺旋神经节神经元电生理特性的影响

目的 探讨庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节神经元细胞电生理特性的影响及其意义。方法 应用全细胞电压钳技术研究庆大霉素对急性酶分离小鼠螺旋神经节神经元细胞膜上的钾、钠离子通道电流的峰值的影响．与细胞外液中庆大霉素浓度的关系，以及庆大霉素洗脱后电流的恢复情况。结果 庆大霉素能抑制电压依赖性钾通道，但不能抑制电压依赖性钠通道，其钾通道抑制作用与细胞外液中庆大霉素的浓度呈剂量依赖性，庆大霉素洗脱后电流恢复不完全。结论 庆大霉素通过抑制螺旋神经节神经元细胞的钾离子通道而产生耳毒性。     

耳蜗螺旋神经节细胞的电生理实验研究现状

耳蜗螺旋神经节细胞(spiral gaaglion cell,SGC),可将毛细胞的信号传向听觉中枢,在听觉信息的传导中起着极其重要的作用.目前,应用全细胞记录膜片钳技术,证实了SGC细胞膜上可表达多种离子通道,如电压门控离子通道,ATP控制的离子通道,神经递质受体介导的离子通道等,而各种病理状态下的SGC均伴有某些特定离子通道的电变化.对这些电变化的研究,将为我们在细胞和分子水平上诊断和治疗许多由内耳疾病所导致的耳聋和听力障碍提供可能.     

大鼠耳蜗切片螺旋神经元的红外可视膜片钳技术

目的建立大鼠离体耳蜗切片技术，结合红外可视膜片钳技术探讨耳蜗螺旋神经元（spiral ganglion neuron，SGN）的电生理特性。方法0～2日龄、3～6日龄及7～14日龄的健康SD大鼠各10只，快速制作耳蜗切片，应用红外微分干涉相差技术，结合膜片钳记录，观察SGN的基本电生理特性，并分析影响耳蜗切片制作质量及膜片钳记录成功的因素。结果3～6日龄大鼠耳蜗切片的成功率最高，每只耳蜗可制备2～4张切片；保持部分颅骨与耳蜗的连接及耳蜗骨壳的完整是影响切片成功的关键，切片时蜗轴与刀片的位置及切片取材的时间也是影响切片质量和细胞活性的重要因素。红外可视膜片钳技术可准确找到状态良好的SGN，有助于对封接过程的判断。全细胞记录SGN静息膜电位平均为（-45．6±5．3）mV（x±s，n=52），可记录到Na^＋和K^＋电流。结论耳蜗切片技术能够较完整地保持耳蜗结构以及各种构成细胞的活性及其相互之间的联系，红外可视膜片钳技术具有实时、直视的特点，可操作性强，二者结合能为深入研究SGN的电生理特性及听觉传导机制提供良好的手段和平台。     

耳蜗螺旋神经节细胞的电生理实验研究现状

耳蜗螺旋神经节细胞(spiral gaaglion cell，SGC)，可将毛细胞的信号传向听觉中枢，在听觉信息的传导中起着极其重要的作用。目前，应用全细胞记录膜片钳技术，证实了SGC细胞膜上可表达多种离子通道，如电压门控离子通道，ATP控制的离子通道，神经递质受体介导的离子通道等，而各种病理状态下的SGC均伴有某些特定离子通道的电变化。对这些电变化的研究，将为我们在细胞和分子水平上诊断和治疗许多由内耳疾病所导致的耳聋和听力障碍提供可能。     

应用膜片钳技术对螺旋神经元放电类型的初步研究

目的：研究原代培养新生鼠螺旋神经元的放电类型。方法：应用膜片钳技术全细胞构型从原代培养的螺旋神经元获得电流钳记录。结果：从螺旋神经元记录到动作电位，螺旋神经元具有不一致的放电特征。结论：螺旋神经元具有快适应和慢适应两种放电特征，多数神经元为快适应神经元。     

电刺激螺旋神经节细胞的形态学研究

为定量确定刺激螺旋神经节神经元的电流强度的安全范围，利用图象分析仪测量不同电流强度刺激下兔螺旋神经节经（ＳＧＮ）面积、周长、直径和体积的变化，发现ＳＧＮ形态各主要参数对０．４～１．２ｍＡ电流有显著改变，对０．１ｍＡ电流的变化则不显著，与正常组和对照组（药毒致聋组）比较无显著性差异。     

小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育

目的研究小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育,探讨螺旋神经节神经元的发育成熟过程。方法应用透射电镜观察３２只１～６０天龄小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育。结果新生小鼠螺旋神经节神经元为形态相同的幼稚细胞,由卫星细胞及其伸出的单层突起包绕,无致密髓鞘形成;出生后７天,Ｉ型神经元出现,Ｉ型神经元局部致密髓鞘开始形成;出生后１０～１４天,Ｉ型神经元多层致密髓鞘出现;出生后３０天,可见一种细胞形态和Ｉ型神经元相似而有明显致密髓鞘的神经元;出生后６０天,螺旋神经节神经元髓鞘基本发育成熟。螺旋神经节神经元的发育成熟由底回向顶回逐步发展。结论出生后７～１４天是螺旋神经节神经元发育和成熟的重要阶段。     

小鼠耳蜗螺旋神经节细胞电生理学特性的研究

目的：应用膜片钳技术记录小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的全细胞电流,了解电压依赖性离子通道的基本电生理学特性,并比较耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞电生理学特性的差异。方法：应用全细胞构型电压钳制技术,采用不同的电极内液及阻断剂,在不同的刺激参数下记录耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞的电压依赖性离子通道电流,并进行分析比较。结果：实验记录到了内向的钠电流、延迟整流钾电流、超极化激活内向阳离子通道电流及瞬时外向钾电流,并发现耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞的延迟整流钾电流及瞬时外向钾电流的电生理学特性具有显著性差异（P〈0．05）。结论：实验记录到的各种离子电流数据表明耳蜗螺旋神经节细胞具有完成动作电位的形成、传导并对其功能进行调节的离子通道基础;耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞电生理学特性的差异有助于听觉的形成过程。     

Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice

We have developed a reliable protocol for the serum-free dissociation and culture of spiral ganglion neurons from adult mice, an important animal model for patients with post-lingual hearing loss. Pilot experiments indicated that the viability of spiral ganglion cells in vitro depended critically on the use of Hibernate medium with B27 supplement. With an optimized protocol, we obtained 2 × 10³ neurons immediately after dissociation, or about one-fifth of those present in the intact spiral ganglion. After four days in culture, 4% of the seeded neurons survived without any exogenous growth factors other than insulin. This yield was highly reproducible in five independent experiments and enabled us to measure systematically the numbers and lengths of the regenerating neurites. Furthermore, the survival rate compared well to the few published protocols for culturing adult spiral ganglion neurons from other species. Enhanced survival and neurite outgrowth upon the addition of brain-derived neurotrophic factor and leukemia inhibitory factor demonstrated that both are potent stimulants for damaged spiral ganglion neurons in adults. This responsiveness to exogenous growth factors suggested that our culture protocol will facilitate the screening of molecular compounds as potential treatments for sensorineural hearing loss.     

去甲肾上腺素抑制大鼠耳蜗螺旋神经元γ氨基丁酸门控氯通道电流

目的 研究去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)对培养大鼠耳蜗螺旋神经元γ氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)诱发电流的作用.方法分离培养大鼠耳蜗螺旋神经元,采用制霉菌素穿孔膜片钳全细胞记录技术,记录NA对GABA诱发电流的作用.结果 大鼠螺旋神经元GABA诱发反应的反转电位为(-0.78±0.05)mV(n=8),与Cl-平衡电位一致.GABA在钳制电位为-50 mV时,可引起内向电流,EC50为(5.2±0.5)μmol/L,Hill系数为1.03(n=26),该电流可被GABA-A受体拮抗剂荷包牡丹碱抑制,NA对该电流具有抑制作用.结论 NA可以抑制螺旋神经元GABA-A受体介导的门控氯通道电流,该作用可能与交感神经系统对听觉的调控有关.     

顺铂对大鼠耳蜗螺旋神经节细胞外向延迟整流钾电流的影响

目的:观察记录顺铂作用下急性分离新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(SGNs)延迟整流钾通道的电流曲线,分析顺铂对SGNs钾电流激活动力学的影响,并初步探讨其耳毒性机制。方法:采用全细胞膜片钳技术记录SGNs外向延迟整流钾电流及顺铂对此电流的影响。结果:钳制电压为-60mV,刺激电压从-60mV到 80mV逐渐去极化,阶跃电压为10mV,持续时间为500ms,可在SGNs上记录到外向钾电流,该电流对TEA-Cl(4-乙基胺)敏感,具有延迟整流特性;在细胞外液中加入10μmol/L顺铂,能明显抑制SGNs延迟整流钾电流;顺铂对此电流的抑制作用与细胞外液中顺铂的浓度呈剂量依赖性;外液洗脱后SGNs电流可基本恢复正常。结论:钾通道与SGNs动作电位的产生密切相关,顺铂可抑制SGNs钾通道电流,导致听觉功能障碍。     

Some morphological features of neurons in the rat spiral ganglion

Summary By means of serial sections in different planes, the perikarya in the rat spiral ganglion were found to be of an irregular spherical shape, with the largest maximal diameter and perimeter in tangential sections. Type-I and type-II neurons have a mean size of about 18 m and 13 m, respectively. Since some type-I perikarya are in the range of type-II cells, it is not possible to distinguish them from type-II cells in unstained thick sections. Some type-I cell perikarya exhibit areas with a reduced number of organelles. These cells are considered as being in a degenerating state, a fact finally leading to an age-dependent loss of neurons.     

不同培养方法对螺旋神经元体外生长的影响

目的 观察不同培养条件下螺旋神经元体外生长情况,获得高纯度螺旋神经元培养物.方法 利用酶消化法、剪切分离结合酶消化法对出生后3～5天的大鼠螺旋神经节进行分离,分别在血清培养基和神经元专用培养基内培养,观察神经元形态及生长情况,并进行免疫组化鉴定.结果 神经元专用培养基比含血清培养基能够得到纯度更高的神经元,且细胞形态良好,轴突再生能力强.结论 酶消化结合剪切分离螺旋神经节,经神经元专用培养基培养,能获得高纯度的螺旋神经元.     

螺旋神经节细胞无血清培养方法的研究

目的：通过对比不同培养条件下螺旋神经节细胞（SGCs）的生长特性,从而确定一种可以获得足够数量和纯度的SGCs体外培养的最佳方法。方法：采用出生3d内的SD大鼠,取螺旋神经节组织,观察有血清培养基及无血清培养基,加或不加阿糖胞苷（Ara—c）对体外培养SGCs纯度及活性的影响。免疫组织化学鉴定培养的螺旋神经节细胞。结果：使用DMEM／F12培养基及B27添加剂,联合5μmol／L Ara-c作用48h,能有效抑制非神经细胞增殖,得到比较纯的SGCs。通过hochest33258及PI双标,发现Ara-C对SGCs毒性较小。得到的细胞经免疫组织化学抗神经丝蛋白抗体证实为SGCs。结论：本实验建立的方法,所获得的SGCs纯度较高,细胞活性保持良好,为体外研究外周听觉系统疾病提供了重要方法。     

Ad-DsRed2-NT3转染小鼠离体耳蜗基底膜预防庆大霉素耳毒性的实验研究

目的将含有目的基因NT3的重组腺病毒Ad-DsRed2-NT3转染新生小鼠的离体耳蜗基底膜培养组织,观察其在预防庆大霉素的耳毒性中的作用。方法取新生小鼠的耳蜗基底膜离体培养1d后,用含有目的基因NT3的重组腺病毒Ad-DsRed2-NT3转染新生小鼠的离体耳蜗基底膜培养组织,转染成功1d后用终浓度为3mM的庆大霉素对离体耳蜗基底膜造模,造模3d后,行离体耳蜗基底膜的神经微丝免疫荧光染色,观察各组耳蜗基底膜神经微丝的密度,以观测NT3对离体耳蜗基底膜上的螺旋神经的保护作用。结果新生小鼠的离体耳蜗基底膜生长良好,重组腺病毒Ad-DsRed2-NT3能对其有效转染,庆大霉素造模后3d各组耳蜗基底膜神经微丝的密度(每100μm距离内的螺旋神经微丝数)分别为(±s):造模组16.67±1.63、Ad-DsRed2组16.17±2.31、Ad-DsRed2-NT3组40.33±1.63、空白组为43.17±0.75,其中,造模组与空白组、Ad-DsRed2-NT3组与造模组、Ad-DsRed2-NT3组与Ad-DsRed2组之间具有显著性统计学差异(P<0.05)。结论终浓度为3mM的庆大霉素对小鼠离体耳蜗基底膜上的螺旋神经有明显的损害作用,而NT3基因的过表达对这种损害具有保护作用。     

小鼠耳蜗螺旋神经节细胞电压依赖性离子通道的研究

目的了解小鼠耳蜗螺旋神经节细胞电压依赖性离子通道的特性。方法采用耳蜗螺旋神经节细胞与耳蜗基底膜整体培养和膜片钳全细胞记录方法。结果采用出生后0至5d的C57BL/10J小鼠(n=30)，耳蜗螺旋神经节细胞与基底膜一道取出，培养8～48h后，基底膜内侧和周围散落的螺旋神经节细胞贴壁良好，便于进行生理学记录。螺旋神经节细胞根据在电流钳记录下有无动作电位来鉴别，健康的细胞在刺激电流的起始端和结束端均可记录到动作电位。细胞平均静息电位(