小鼠异基因造血干细胞移植中清髓照射对供者来源内皮祖细胞归巢的影响

目的 研究异基因造血干细胞移植预处理因素--清髓照射对供者来源内皮祖细胞(EPCs)归巢的影响. 方法 密度梯度离心和差速贴壁法获取小鼠骨髓单个核细胞,EGM-2培养基培养,5～7 d检测CD133+CD31+CD45low表面标记及吸食Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1鉴定,并行羟基荧光素=醋酸盐琥珠酰亚胺酯(CFSE)标记.实验分组:正常组,正常+EPCs移植组,照射组,照射+EPCs移植组.流式细胞术(FCM)分析外周血、脾脏和骨髓中内皮细胞(ECs)、EPCs和CFSE阳性细胞比例;病理、电镜和免疫荧光分析各组织的损伤情况及CFSE标记EPCs的分布. 结果 流式细胞术鉴定内EPCs为CD45lowCD133+CD31+;Dil-ac-LDL+、FITC-UEA-1+.照射后短时间内循环中ECs即开始升高,第5 d达高峰,持续到第7 d,与正常组相比差异有统计学意义 (P<0.05);循环中EPCs照射后短时间内也增加,于第4 d达到峰值,随后下降至正常水平,其增加与正常组相比差异有统计学意义 (P<0.05).照射后3 d光镜下肝脏弥漫性的炎症浸润,小肠大量炎症细胞浸润;电镜下肝脏中血小板聚集到内皮下暴露的胶原上,小肠中ECs和基底膜间被损坏.照射+EPCs移植组,荧光显微镜下观察,移植后3 h见CFSE阳性细胞归巢至损伤的肝脏和小肠,细胞少且不连续; 36 h细胞较多,且呈连续性.结论 移植预处理中的清髓照射可引起严重的内皮损伤, 该损伤启动了EPCs的动员,并驱动外源性EPCs归巢至损伤比较重的组织中.     

两种内皮祖细胞修复兔颈动脉内膜损伤血管的对比研究

目的 观察比较外周血两种内皮祖细胞(EPC和EOC)移植对内膜球囊损伤血管的修复作用.方法 密度梯度离心法分离兔外周血单个核细胞(MNC).以不同的分离培养方法 ,获得兔外周血EPC和EOC.并将相同数量(5×105个)的EPC和EOC分别移植至兔内膜球囊损伤血管局部,对照组仅注入100 μl生理盐水.同时用亲脂性碳青染料标记两类细胞,进行细胞示踪.术后4周,处死动物,荧光显微镜下观察标记细胞的分布,并测量各组内膜损伤血管段再生内皮覆盖率和新生内膜增生程度.结果 术后4周,荧光显微镜下,在血管中膜、新生内膜层和内膜表面均可见荧光标记的细胞.EPC移植组和EOC移植组的再内皮化区域面积均显著大于对照组,差异有统计学意义(91.6%±3.6%、89.1%±6.3% vs 62.1%±7.5%,P＜0.01),但移植细胞组之间比较差异无统计学意义.结论 EPC移植或EOC移植均可显著加速内膜损伤血管的再内皮化,并减少新生内膜的形成,相等数量的两种内皮祖细胞移植表现出相近的效果.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外CFSE染色标记的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）体外分离、培养、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光标记的实验方法。方法差速贴壁离心法分离纯化大鼠BMSCs,并进行表面标志物流式检测鉴定和成脂、成骨分化鉴定。 CFSE标记BMSCs ,荧光显微镜下观察BMSCs 形态和标记率,台盼蓝染色检测CFSE对BM-SCs存活率的影响,以筛选CFSE标记BMSCs的最佳条件。结果第5代BMSCs的特异性表面标志物： CD29阳性,阳性率为90．10％;CD90阳性,阳性率为96．61％;CD45阴性,仅0．40％表达。且BMSCs具有成脂和成骨分化能力。10μmol/L CFSE作用15 min时,BMSCs的CFSE标记率几乎达到100％,且对BMSCs 的活性没有影响（P＞0．05）。结论利用差速贴壁法可获得纯度高、未分化性能强的BMSCs,BMSCs标记CFSE的最佳条件为10μmol/L CFSE作用15 min。     

Gd-BOPTA标记对人脐血内皮祖细胞生物学特性的影响与MR成像研究

目的探讨Gd-BOPTA标记人脐血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的方法和对标记EPCs生物活性的影响,观察标记EPCs的体外磁共振成像特点。方法应用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离培养EPCs。采用jetPEITM-FluoF介导Gd-BOPTA标记EPCs,比较不同标记浓度和标记时间对EPCs生物活性的影响,收集未标记细胞和标记24 h的细胞进行体外MR成像,比较不同浓度标记的细胞在不同扫描序列中的信号强度变化。结果荧光显微镜下观察,标记的EPCs胞质内可见绿色荧光颗粒,透射电镜可见胞质内散在分布许多Gd颗粒,颗粒主要位于胞质的细胞器如高尔基体周围以及附着在细胞膜内层上。Gd-BOPTA标记规律呈"抛物线"样,即随着标记浓度增高和标记时间的延长,细胞内聚集的Gd颗粒增多,细胞的标记率也增高,但在浓度为25μg/ml标记24 h标记率达峰值[(88.2±1.6)%]后,标记率逐渐降低。在标记浓度低于25μg/ml标记24 h时,对细胞的黏附能力、迁移能力及增殖能力均无影响(P>0.05)。在T1 WI序列最大相对信号强度出现在浓度为25μg/ml时,而后信号降低,与对照管相比差异显著(P<0.05),在T2 WI和T2*WI序列上相对信号强度变化无显著性差异(P>0.05)。结论 jetPEITM-FluoF可介导Gd-BOPTA有效地标记EPCs,对MR信号的影响主要为T1WI正性效应,最适标记浓度和最佳标记时间分别为25μg/ml、24 h。     

血管内皮祖细胞靶向损伤血管内皮磁共振成像的实验研究

目的采用超顺磁性氧化铁（sPIO）作为磁共振示踪细胞的标记物,为血管内皮祖细胞移植防治血管内皮损伤性疾病提供实验依据。方法分离、鉴定并培养新西兰大白兔外周血血管内皮祖细胞（EPCs）,制备Fe2O3^-多聚左旋赖氨酸（PIJL）并体外标记EPCs。用2．5F球囊扩张兔右侧颈动脉,制作血管内膜损伤模型,进行EPCs局部移植。A组5只,移植Fe2O3-PLL标记的EPCs,B组5只,移植荧光标记的EPCs,C组5只为空白对照,局部注射生理盐水。细胞移植后7d,所有实验兔行MR颈动脉扫描,并取受损伤血管做病理组织学检查,并与MR信号变化进行对比分析。结果EPCs的Fe2O3^-PLL标记率〉95％,A组标记细胞移植后7d,MR扫描T2WI显示损伤血管壁明显低信号区,而B组和C组无明显异常信号改变;病理学检测显示A组损伤血管内膜有普鲁氏蓝染色阳性细胞黏附,B组损伤血管内皮有强荧光表达,C组损伤血管内皮无表达。结论利用1．5TMR仪进行活体成像技术,可示踪并检测磁粒子标记血管内皮祖细胞在损伤血管内皮的归巢、黏附及分布,为血管内皮祖细胞移植防治血管内皮损伤性疾病提供了实验依据。     

另一类型内皮祖细胞移植在损伤血管内膜修复中的作用

目的：观察体外培养的兔外周血另一种内皮祖细胞(EOCs）自体移植修复内膜球囊损伤血管的效果。方法：实验动物随机分为EOCs移植组（n＝8）和对照组(n＝8)。密度梯度离心法分离兔外周血单核细胞（MNCs）,在EGM-2培养基的诱导分化下获得EOCs。将第二次传代的EOCs重悬于100 μL生理盐水中移植至兔颈总动脉内膜球囊损伤血管局部(移植组),仅注入100 μL生理盐水者作为对照组。同时用CM-DiI标记EOCs移植,进行细胞示踪。术后4周,荧光显微镜下观察标记细胞的分布,并测量内膜损伤血管段再生内皮覆盖率(RA/TA)和新生内膜增生程度（IA/MA）。结果：术后4周,荧光显微镜下,在血管中膜、新生内膜层和内膜表面均可见荧光标记的细胞。伊文思蓝染色显示,EOCs移植组的再生内皮覆盖率(89.1%±6.3%)显著高于对照组(62.1%±7.5%,P<0.01）;与对照组比较,EOCs移植组的新生内膜形成明显减少,两者的IA/MA比值分别为0.88±0.14和0.44±0.06（P<0.01）。结论：EOCs移植可显著加速内膜损伤血管的再内皮化,并减少新生内膜的形成。     

Long Evans大鼠视网膜神经节细胞培养与鉴定

目的建立Long Evans大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)体外培养的方法,为RGCs的体外实验研究奠定基础.方法出生后1～3 d的Long Evans大鼠视网膜神经上皮层,胰蛋白酶 透明质酸酶消化制成单细胞悬液,用DMEM培养液进行培养,观察细胞生长规律,图像分析系统分析有突起的RGCs数目、胞体面积和最长的突起长度,Thy1.1单克隆抗体和微管相差蛋白2多克隆抗体荧光双标法鉴定RGCs.结果 Long Evans大鼠RGCs体外培养存活4 d;荧光双标显示RGCs纯度为80%～90%.结论在普通培养基中Long Evans大鼠RGCs体外培养能获成功.胰蛋白酶 透明质酸酶联合消化较单独用胰蛋白酶消化效果好.     

乳腺癌雌激素受体阳性细胞对雌激素受体阴性细胞增殖的影响

目的探讨雌激素受体(ER)表达不同的乳腺癌细胞间相互作用。方法 PCR法检测MDA-MB-231及MCF-7细胞中ER的基因表达。CCK-8法检测17β-雌二醇对MCF-7和MDA-MB-231细胞生长增殖的影响。将MDA-MB-231(雌激素受体阴性细胞)用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)法标记荧光信号,将其分别与MCF-7细胞(雌激素受体阳性细胞)和未标记荧光的MDA-MB-231细胞(雌激素受体阴性细胞)用Transwell侵袭小室分层共培养,加入或不加入雌二醇,检测MDA-MB-231细胞的增殖差异。结果 MCF-7细胞表达雌激素受体α(ESR1,ERα)和雌激素受体β(ESR2,ERβ),而MDA-MB-231细胞均不表达。17β-雌二醇浓度为10-11 mol/L时促MCF-7增殖作用最大,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),对MDA-MB-231细胞则无明显作用(P>0.05)。在加入雌二醇培养的MCF-7细胞与MDA-MB-231细胞小室分层共培养组,经流式细胞仪检测发现MDA-MB-231平均荧光强度较对照组显著降低。结论雌激素受体阳性细胞在雌激素作用下,可促进雌激素受体阴性细胞的增殖。     

标记后转输的凋亡细胞流式细胞术体内示踪方法

目的 探索一种可用于转输凋亡细胞体内示踪研究的方法。方法 首先对分离所得活细胞进行（CFSE）荧光标记,再诱导细胞凋亡。将该细胞经静脉注射入受体后,采用流式细胞术和组织学荧光显微镜观察标记凋亡细胞在不同组织的动态分布。同时进行CFSE标记稳定性观察实验。结果 CFSE标记凋亡细胞的阳性率高,荧光强度大,不会迅速衰减和外漏。流式细胞术检测可发现标记凋亡细胞在不同组织的动态分布。结论 CFSE标记细胞后诱导凋亡,再经流式细胞术检测组织内细胞分布,必要时辅以组织学检测可以作为一种可靠、高效,经济的凋亡细胞体内示踪研究技术方法．     

DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究

目的:研究随着时间延长,DAPI标记间充质干细胞(MSCs)的标记率变化。方法:分离培养纯化成年大鼠骨髓MSCs,DAPI标记,不同时点荧光显微镜观察,计算MSCs中DAPI阳性率。将标记的MSCs移植到缺血下肢模型动物骨骼肌中,不同时点取材,冰冻切片,观察移植细胞。结果:标记当天,荧光镜下MSCs胞核呈明亮蓝色荧光,标记率接近100%,随着培养时间延长,标记率逐渐下降。移植1周和2周组织切片中,可见密集移植MSCs,3周以后,可检出的DAPI阳性细胞明显减少。结论:DAPI短期标记细胞效率很高,但标记率随着时间延长而迅速下降。     

自体骨髓单个核细胞心肌内移植的实验研究

目的：观察自体骨髓单个核细胞（BMMNC）在动物模型心肌微环境中的存活和分化情况，探索该方法应用至临床的可行性。方法：选取成年新西兰兔共20只，随机分为四组。无菌状态下取胫骨骨髓15ml，采用改进后的密度梯度离心法分离出BMMNC，荧光染料CFSE作细胞标记后备用。正中切口进胸，心肌内注入上述备用细胞悬液。于术后1、2、4、8周先后处死四组动物，取心脏标本冰冻切片在共聚焦显微镜下观察局部含荧光细胞的存活发育情况。结果：移植后4周可观察到与心肌纤维平行的荧光带，部分标本血管内壁中观察到了荧光细胞。结论：自体BMMNC心肌内移植可在心肌微环境的诱导下分化为心肌样细胞及血管内皮细胞。改进后的BMMNC分离纯化方法过程简便、可靠，处理过程无毒性，获得的细胞纯度和活性较高，该方法可应用于临床研究。     

骨髓间充质干细胞在激光损伤大鼠视网膜下分化的观察

目的鉴定骨髓间充质干细胞(MSC)在体外不诱导的条件下移植于掺钕钇铝石榴石(Nd：Y．AG)激光损伤大鼠视网膜后的定位以及蛋白表达情况。方法体外培养大鼠。MSCs,用荧光染料4′,6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记MSCs,视网膜下移植后分别于10、20、35和50d处死动物,做DAPI荧光观察,并在阳性的连续切片上作神经元核(NeuN),神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和角蛋白(CK)免疫组化染色及HE染色。分别于损伤前及损伤后即刻、1-7周检测损伤移植组、损伤组和损伤注射生理盐水组的视网膜电图(ERG)b波分析。结果培养的MSC集落生长迅速,均一性好;DAPI染色观察表明,10d时移植细胞多集中于移植部位周围,但分布散乱;20d时可见阳性细胞分布范围扩大,分布于视网膜视锥、视干细胞层、双极细胞层及节细胞层;到35d阳性细胞范围进一步扩大,且细胞向损伤部位迁移;50d观察损伤范围与35d相比扩大不明显。免疫组织化学染色发现阳性区域的细胞在NeuN、NSE、GFAP和CK的表达有不均一性。检测到的阳性区域视网膜未见到玫瑰花结样结构,但某些区域的细胞排列不整齐,在某些部位有细胞层增生。HE染色表明移植组损伤的恢复好于损伤对照组,ERGb波检测表明5周后损伤移植组的b波水平高于对照组。结论。MSC在视网膜下移植后可与原视网膜结构相融合,检测到的阳性细胞分布于视网膜色素上皮层、视细胞层、双极细胞层及节细胞层,但细胞的排列和蛋白表达仍有紊乱。MSC的移植对激光损伤斑及ERGb波的恢复有促进作用。     

Transplantation of human umbilical cord-derived endothelial progenitor cells promotes re-endothelialization of the injured carotid artery after balloon injury in New Zealand white rabbits

Background Cell transplantation has great potential for promoting endothelial repair and reducing the complications of percutaneous coronary intervention (PCI).The aim of this study was to investigate ...     

萤光逆行双标技术——一种新的神经解剖研究方法

用成年大白鼠20只,将国产樱草黄和伊凡思兰二种萤光染料分别注射至尾壳核头部的不同部位。实验结果表明,两种萤光染料均可用作萤光逆行性双标记研究。本文叙述了萤光逆行性双标记技术的操作步骤和体会,并介绍了一种简便而不影响萤光标记的萤光逆行性标记和儿茶酚胺神经元萤光组化联合法。     

Endothelial progenitor cell mediates transport of hepatitis B virus into myocardial tissue

Background Hepatitis B virus （HBV） replication has been reported to be involved in many extrahepatic viral disorders; however, the mechanism by which HBV is transinfected into extrahepatic tissues such as myocardium and causes HBV associated myocarditis remains largely unknown.
Methods In this study, endothelial progenitor cells （EPCs） were infected by HBV and then transfused into ischemic model of mice. HBV surface and core antigen as well as mutation of HBV particles were detected by immunohistochemistry, fluorescent activated cell sorter and transmission electron microscopy in vitro and in vivo.
Results Human cord blood EPCs, but not human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） could be effectively infected by taking up HBV in vitro. HBV envelope surface and core antigen expressions were first detectable in EPCs at day 3 after virus challenge, sustained for up to 11 days, and decreased thereafter. Similarly, the virus particles were the most abundant in EPCs in the first week observed by a transmission electron microscope, and declined in 3 weeks after HBV infection. HBV DNA but not HBV cccDNA in EPCs were detectable even 3 weeks after virus challenge, as shown by PCR analysis. Furthermore, intravenous transplantation of HBV-treatod EPCs into myocardial infarction Sprague ＆ Dawley rats model resulted in incorporation of both EPCs and HBV into injured endothelial tissues of capillaries in the ischemic border zone.
Conclusions These results strongly support that EPCs serve as virus carrier mediating HBV trans-infection into the injured myocardial tissues. The findings might suggest a novel mechanism for HBV-associated myocarditis.     

嗅鞘细胞移植到损伤脊髓存活时间的研究

目的观察植入损伤脊髓的自发绿色荧光的嗅鞘细胞（green fluorescent protein-olfactory ensheathing cells,GFP-OECs）,研究移植后嗅鞘细胞的存活时间。方法用酶消化法分离培养来自2.5月龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠嗅球最外层的嗅鞘细胞,培养第10天,用显微外科技术将嗅鞘细胞移植到脊髓挫伤后的T10节段,对照组移植术后未作特殊处理,实验组移植术后腹腔注射环孢菌素A,两组分别在移植术后1、2、4、8周取材,观察细胞植入损伤脊髓后存活情况。结果对照组在移植术后2周内可见存活的嗅鞘细胞;实验组在移植术后4周仍可见存活的嗅鞘细胞,8周未见存活的嗅鞘细胞。结论嗅鞘细胞移植后存活时间小于8周。     

造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的 对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型.方法 采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2) ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3)ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin(-)c-kit(+)Sea-1+(LSK)造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠.结果 活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光.流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS和C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞.结论 筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具.     

CFSE标记的淋巴细胞增值实验检测方法的建立

[摘要] 目的　建立基于流式细胞术和活细胞荧光染料CFSE的淋巴细胞增殖、单向混合淋巴细胞实验的免疫学检测方法。 方法　分离单个核细胞，将反应细胞经CFSE染色后，分别加入不同的淋巴细胞增殖刺激物或与灭活异基因淋巴细胞共培养。培养后细胞经流式细胞术检测标记细胞是否增殖，应用CD4-PE抗体检测增殖细胞中CD4阳性T细胞亚群比例，ModFit软件分析增殖动力模型。计算增殖CDI或PI指数。 结果　基于CFSE建立的淋巴细胞增殖实验，经不同刺激物或异基因抗原刺激后增殖指数明显升高，使用CD4-PE抗体进行再次标记后可以对增殖实验中CD4阳性淋巴细胞亚群的增殖进行评估。 结论　成功建立了基于CFSE标记淋巴细胞的增殖实验检测方法，该方法简单，实用，灵敏度高，可以取代3H或MTT用于不同条件，不同免疫刺激情况下淋巴细胞增值的检测或评估。     

骨髓干细胞治疗大鼠急性肝损伤效果的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓干细胞移植治疗急性肝损伤的疗效.方法 取50只正常雄性大鼠,采用2-乙酰氨基芴和四氯化碳溶液灌胃,制成急性肝损伤模型,取其骨髓,以淋巴细胞分离液分离出于细胞,再用荧光染料(PKH26)进行标记.将50只急性肝损伤大鼠分为实验组和对照组,每组25只.实验组大鼠麻醉后,取腹部正中切口,经门静脉注入自体骨髓干细胞悬液0.4 mL(4×106个).移植术前及术后3d、7d、14 d、4周观察血清转氨酶(ALT、AST)、总胆红素(TB)、凝血酶原时间(PT)和白蛋白(ALB)水平变化;骨髓干细胞移植后4周,取各组肝脏组织,制成冰冻切片,用异硫氰荧光素标记的抗体进行免疫组织化学染色,检测其PKH26标记阳性细胞.结果 术后3、7d,各项肝功能指标无显著性差异(P＞0.05);术后14 d ALT、AST及ALB有所改善(P＜0.05),其余指标无明显改善;4周各项肝功能指标均有改善(P＜0.05).大鼠肝脏切片中可见散在的PKH26染色阳性的红色荧光,PKH26染色阳性细胞数为(57.2±6.18)个,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 经门静脉注入的骨髓干细胞能定植于肝脏,是治疗急性肝损伤的一种安全有效的方法,可显著改善急性肝损伤大鼠肝功能.     

绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植修复脊髓损伤实验中的应用

目的:观察绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植修复脊髓损伤实验中的应用。方法:40只成年SD大鼠随机分为移植组(n=20)和对照组(n=20),均进行脊髓半切损伤。伤后9d,移植组于伤处移植体外转染GFP基因的大鼠MDSCs,而对照组仅注射等量PBS,于移植后1、2、3、4周用BBB评分方法测大鼠的运动功能,同时进行损伤脊髓取材、快速冰冻切片进行荧光显微镜观察。结果:移植后1周两组动物运动功能恢复无明显差异;移植后2、3、4周与对照组比较,移植组显著提高运动功能;荧光显微镜观察经绿色荧光蛋白基因标记的肌源性干细胞在损伤脊髓组织局部生长良好,并且有沿着脊髓神经束向头尾两侧迁移的趋势。结论:携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒表达载体的细胞标记方法是安全可靠、简便有效的生物示踪标记方法,可以用于标记细胞移植实验研究。