流式细胞仪快速优化大鼠原代培养肝细胞基因转染

【目的】用流式细胞仪(FCM)快速检测外源性血管内皮生长因子基因(VEGF基因)在大鼠原代培养肝细胞转染表达，根据结果优化其转染表达条件。【方法】以加强型黄色荧光素蛋白(EYFP)为标记，用FCM快速检测重组质粒pIRES-EYFP／VEGF121在大鼠原代培养肝细胞中转染表达，根据结果优化pIRES-EYFP／VEGF121转染表达条件。【结果】pIRES-EYFP／VEGF121得以成功构建，并转染大鼠原代培养肝细胞；优化的转染表达条件：在细胞数密度O．1xl0^6／mL，质粒孵育时间30min，质粒与脂质体混合物孵育时间15min，质粒与脂质体比例为1：1O，转染时间2h，NAIR-1作转染培养液时，转染效率达17．5％。【结论】以EYFP为标记，FCM可简便快捷地检测并优化外源性VEGF基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达，可为研究VEGF基因修饰大鼠原代培养肝细胞移植和肝基因治疗打基础。     

原代培养大鼠肝细胞的基因转染

目的：研究原代培养大鼠肝细胞的基因转染的方法．方法：采用胶原酶灌注法获取原代培养大鼠肝细胞．利用脂质体转染法将含有绿色荧光蛋白(GFF)和Neo基因的真核细胞表达载体(pEGFP-N3)转染原代培养大鼠肝细胞．用荧光显微镜观察和Neo基因原位杂交染色方法检测肝细胞内基因表达情况．结果：获取的原代大鼠肝细胞活细胞率达95％,荧光显微镜下观察可见转染基因的细胞可发出绿色荧光,原位杂交显示有Neo基因的表达．结论：pEGFP-N3基因可转入大鼠肝细胞并获得表达,可用于标记原代培养的大鼠肝细胞,有利于研究肝细胞移植后移植的肝细胞在体内的分布及功能．     

加强型黄色荧光蛋白和VEGF双基因载体在肝细胞共转染表达

【目的】构建携带加强型黄色荧光素蛋白 (EYFP)和人类血管内皮生长因子 (VEGF)的双基因真核表达载体pIRES EYFP/VEGF12 1,用EYFP作标记基因 ,研究外源性VEGF12 1基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达 ,为实时监测VEGF12 1基因修饰肝细胞移植后状态提供基础。【方法】将 pcDNA3VEGF12 1中VEGF12 1定向克隆到 pIRES EYFP ,构建重组质粒 pIRES EYFP/VEGF12 1,经酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析证实后 ,转染大鼠原代培养肝细胞 ,用荧光显微镜等观察转染表达。【结果】酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析等证明pIRES EYFP/VEGF12 1质粒成功构建 ,转染大鼠原代培养肝细胞后 ,可以通过荧光显微镜观察到黄绿色荧光。【结论】构建了 pIRES EYFP/VEGF12 1质粒 ,为实时监测外源性VEGF12 1基因转染表达和VEGF基因修饰肝细胞的基因治疗奠定基础。     

加强型黄色荧光蛋白和VEGF双基因载体在肝细胞共转染表达

目的 构建带加强型黄色荧光素蛋白（VYFP）和人类血管内皮生长因子（VEGF）的双基因真核表达载体pIRES-EYFP/VEGF12,etEYFP作标记基因，研究外源性VEGF121基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达，为实时监测VEGF121基因修饰肝组织移植后状态提供基础。方法 将pcDNA3VEGF121中VEGF121定向克隆到pIRES－EYFP，构建重组质粒pIRES－EYFP／VEGF121，经酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析证实后，转染大鼠原代培养肝细胞，用荧光显微镜等观察转染表达。结果 酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析等证明pIRES－EYFP／VEGF121质粒成功构建，转染大鼠原代培养肝细胞后，可以通过荧光显微镜观察到黄绿色荧光。结论 构建了pIRES－EYFP／VEGF121质粒，为实时监测外源性VEGF121基因转染和VEGF基因修饰肝细胞的基因治疗奠定基础。     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

剑尾鱼肝细胞原代培养

目的探讨剑尾鱼肝细胞原代培养的方法。方法分别用机械分散法、酶消化法对肝细胞进行分离,并比较在William’s E(Williams’Medium E)、DMEM、DMEM/F12无血清培养基中肝细胞的生长效果。结果⑴组织块培养法(机械分散法)的肝细胞在William’s E、DMEM、DMEM/F12无血清培养基中,温度25℃~28℃,pH 7.3左右时都可以短期正常生长,而生长效果好依次是William’s E、DMEM、DMEM/F12无血清培养基。⑵酶消化法分离的肝细胞的产量为(6.4±1.7)×106 cell/g肝组织,即时存活率为(85±6)%。24 h贴壁率不足20%。结论酶消化法培养肝细胞产量、即时存活率及贴壁率偏低。组织块培养法肝细胞生长良好,而不需要苛刻的条件,可以满足毒理学实验要求。培养肝细胞首选William’s E培养基。     

基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较

将外源基因导入真核细胞的方法很多。我们通过对绿色荧光蛋白(GFP)报告基因在真核细胞中表达的研究,比较了较常用的两种方法一脂质体转染法和磷酸钙转染法。研究结果表明：脂质体转染法的转染效率较磷酸钙转染法高,且简单易行,是外源基因导人体外培养细胞内较理想的方法。     

流式细胞仪检测人脾LAK细胞

目的：探求ＬＡＫ细胞对白血病疗效的监测手段。方法：用流式细胞仪测定５例成人脾淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）和２１例正常人外周血淋巴细胞的ＤＮＡ指数（ＤＩ）及增殖周期。结果：人脾ＬＡＫ细胞的增殖活力明显高于未激活的脾淋巴细胞和外周血淋巴细胞。培养（１～１４ｄ）期间人脾ＬＡＫ细胞的增殖活力高，并且稳定。在人脾ＬＡＫ细胞中，未找出非整倍体细胞，ＤＩ指数在正常范围。结论：流式细胞仪可用于判断人脾ＬＡＫ细胞对白血病的疗效。     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

流式细胞仪检测重组毕赤酵母发酵过程中的细胞活性

建立了流式细胞仪检测重组巴斯德毕赤酵母(P.p astoris)细胞活性的方法,并在高密度发酵过程中得到应用。使用碘化丙锭染色法测定细胞活性,发现甲醇诱导时酵母细胞活性开始下降,随着细胞密度的增加,由于细胞胁迫和甲醇的影响,细胞活性明显下降,活细胞率最大下降了14%。与此同时,细胞生长减缓,目的蛋白发生降解,表明细胞活性与发酵过程中细胞的生长和目的蛋白生成等参数密切相关。实验证明:流式细胞仪可作为检测毕赤酵母发酵过程中细胞活性参数的一个便捷精确的有力工具。     

神经前体细胞的分离培养及绿色荧光蛋白基因的转染

[目的]为替换中枢神经损伤后死亡的神经元提供方便追踪观察的神经前体细胞.[方法]应用含碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养技术,从新生大鼠海马组织分离培养神经前体细胞,并借助免疫组织化学技术检测这些细胞巢蛋白(nestin)的表达以及细胞分化后神经丝蛋白(NF)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.采用磷酸钙法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转染目的细胞内.[结果]从海马组织分离的细胞具有分裂能力,能表达nestin.分化后一些细胞能表达NF,而另一些细胞则表达GFAP.GFP基因修饰的细胞能发出荧光.[结论]从海马组织分离的细胞能表达nestin,属于神经前体细胞,它们具有明显的增殖能力.有些神经前体细胞已经分化为神经元和神经胶质细胞.GFP基因已成功转染到神经前体细胞内,并表达了GFP.     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨对大鼠骨髓基质细胞进行重组人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165基因修饰的可行性。方法采用全骨髓细胞贴壁培养法获得稳定的大鼠骨髓基质细胞,分别在脂质体LipofectamineTM2000和新型的阳离子聚合物Sofast介导下行pcDNA3.1-VEGF165转染骨髓基质细胞,在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化,通过免疫细胞化学鉴定VEGF在细胞中的表达情况。结果脂质体LipofectaminTM和新型阳离子聚合物Sofast介导转染的阳性细胞率分别为11.34%和11.42%,两者无明显差异。而细胞存活率分别为74.60%和85.88%,后者稍高于前者(P<0.05)。结论真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165可以成功地在骨髓基质细胞中表达,新型阳离子聚合物Sofast的转染效率与传统的脂质体无明显差异,而细胞毒性略小于传统的脂质体。     

绿色荧光蛋白标记人脂肪基质细胞成骨分化能力体外实验研究

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)基因体外转染人脂肪基质细胞的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法体外分离培养人脂肪基质细胞,用重组腺病毒载体Ad-GFP及脂质体介导质粒pEGFP-C1两种方法转染GFP基因,通过流式细胞术观察比较GFP转染和表达的结果;倒置显微镜下观察细胞生长情况;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果重组GFP基因的腺病毒Ad-GFP转染的脂肪基质细胞的感染率达(42.5±1.5)%,16h即有GFP表达,7d时表达趋于稳定,感染6周时仍可见有GFP表达,明显优于脂质体转染组(转染效率最高为11.4%)。感染Ad-GFP后的脂肪基质细胞与未感染的对照组脂肪基质细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶(ALP)表达均逐渐增高,两组间差异无统计学意义(P>0.05);诱导21d后两组均见到茜素红钙盐染色阳性。结论重组GFP基因的腺病毒载体Ad-GFP可高效率感染脂肪基质细胞,基因转染后细胞的增殖分化能力未受到影响,可以作为一种高效可靠的人脂肪基质细胞标记方法。     

脂质体法介导pIRES2-EGFP-hVEGF165转染人胎盘源间充质干细胞

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165）的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,通过脂质体法将其转入人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs)中,鉴定hVEGF165的表达活性及携带目的基因的HPMSCs的多向分化潜能。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 技术,从人白血病细胞HL-60中扩增出hVEGF165的基因片段,构建pIRES2-EGFP-hVEGF165 重组质粒,经酶切检测其构建的正确性,通过脂质体法转染HPMSCs后分别采用RT-PCR、Western blotting 法及MTT法检测其转录和表达活性;荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP),检测含有报告基因EGFP空载体及携带报告基因和目的基因的真核表达载体转染靶细胞的情况;并再次鉴定转染后HPMSCs的多向分化潜能。结果：成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165;RT-PCR、Western blotting及MTT法检测表明,构建的质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165具有转录及表达活性;绿色荧光显微镜下观察到EGFP表达,目的基因成功转入靶细胞,携带目的基因的HPMSCs仍保持多向分化潜能。结论：成功构建具有表达活性的hVEGF165真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,hVEGF165在HPMSCs中具有转录及表达活性,且对HPMSCs的增殖具有促进作用;HPMSCs本身可能具有hVEGF165的内分泌功能。     

阳离子脂质体介导小干扰RNA转染EOMA细胞时转染条件的优化

目的 优化在阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000介导下将小鼠NF-κB的小干扰RNA（siRNA）转染入EOMA细胞时的转染条件.方法 将1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000与20 pmol、30 pmol、40 pmol、50 pmol 、60 pmol的带荧光标记的siRNA分别组合,制备成相应的转染混合物,转染小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA细胞）,于转染24 h后在荧光显微镜下计数阳性细胞率、MTT法检测各转染条件下EOMA的细胞活性.结果 在siRNA量相同的情况下,分别采用1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000进行转染其转染效率、细胞毒性无明显差异（P＞0.05）;转染混合物中siRNA浓度为50 pmol时,转染效率最高达到86%,继续增加siRNA的浓度,转染效率提高并不明显;siRNA浓度为60 pmol时转染混合物表现出较高的细胞毒性.结论 以1.0 μl Lipofectamine^TM2000与50 pmol的siRNA组成转染混合物可以实现对EOMA细胞高效转染并保持较高的细胞活性.