三氧化二砷对伊马替尼耐药bcr-abl基因突变细胞株生长抑制作用的研究

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)在体外对伊马替尼(IM)耐药bcr-abl基因突变细胞株(简称IM耐药细胞株)的生长抑制作用.方法 采用MTT比色法观察IM敏感细胞株32Dp210和包括32Dp210T3151等15种IM耐药细胞株的细胞增殖能力.选择其中5种慢性粒细胞白血病(CML)常见基因突变型细胞株,经膜联蛋白V(Annexin V)标记流式细胞术检测细胞凋亡,Westem blot检测bcr-abl融合蛋白、CRKL磷酸化及细胞凋亡相关蛋白表达的,变化.结果 32Dp210T3151等15种IM耐药细胞株具有不同程度的IM耐药性(IC50为IM敏感细胞株32Dp210的1.5～25.0倍).As2O3对IM耐药细胞株的IC50值仅为32Dp210细胞的0.18～0.34.将5种CML常见的IM耐药细胞株与32Dp210比较发现,As2O3更显著地旱剂量依赖性抑制IM耐药细胞株bcr-abl融合蛋白、磷酸化CRKL蛋白的表达,诱导细胞凋亡的作用也明显强于32Dp210.4 μmol/L As2O3可激活5种突变细胞的caspase-3、8、9蛋白表达.结论 As2O3在体外对IM耐药细胞株具有比IM敏感细胞株更显著的生长抑制和诱导凋亡的作用,细胞凋亡的产生主要与caspase-3、8、9蛋白的激活有关,提示As2O3可能成为治疗IM耐药CML患者的新选择.     

三氧化二砷对T315I突变细胞株KBM5R的诱导凋亡作用

本研究旨在探讨三氧化二砷(ATO)对耐伊马替尼(IM)并有T315I点突变的慢性髓系白血病(CML)细胞株KBM5R的诱导凋亡作用。选择T315I点突变的CML细胞KBM5R和野生型细胞KBM5为研究对象,用MTT法检测KBM5R细胞对IM的耐药性及ATO对KBM5、KBM5R细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测ATO诱导KBM5、KBM5R细胞凋亡;Western blot法检测ATO对KBM5、KBM5R细胞凋亡相关蛋白caspase-3、-8、-9的影响。结果表明,①IM作用于KBM5R细胞的IC50值为12.66±0.565μmol/L,明显高于对KBM5细胞的IC50值(0.303±0.031)μmol/L,两者比较差异具有显著性(p<0.01);②不同浓度ATO作用于KBM5、KBM5R细胞24、48、72、96小时均表现出显著的增殖抑制作用,且具有浓度依赖性和时间依赖性;相同的药物浓度和时间点ATO对KBM5R细胞的增殖抑制作用强于对KBM5细胞;③ATO(2、4、8μmol/L)作用于细胞48小时后KBM5、KBM5R细胞凋亡率均以药物浓度依赖形式增加,且相同药物浓度时KBM5R细胞凋亡率较KBM5细胞高;④4μmol/LATO作用于KBM5、KBM5R细胞24小时后,细胞内cleaved caspase-3、-8、-9蛋白表达明显增加。结论 :KBM5R细胞对IM具有显著的耐药性;ATO对KBM5、KBM5R细胞均具有增殖抑制和诱导凋亡作用,与野生型细胞KBM5比较,ATO对T315I突变的KBM5R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用更强;ATO通过活化凋亡相关蛋白caspase-3、-8、-9诱导细胞KBM5和KBM5R的凋亡。     

三氧化二砷对T3151突变细胞株KBM5R的诱导凋亡作用

本研究旨在探讨三氧化二砷(ATO)对耐伊马替尼(IM)并有T3151点突变的慢性髓系白血病(CML)细胞株KBM5R的诱导凋亡作用.选择T3151点突变的CML细胞KBM5R和野生型细胞KBM5为研究对象,用MTT 法检测KBM5R细胞对IM的耐药性及ATO对KBM5、KBM5R细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测ATO诱导KBM5、KBM5R细胞凋亡;Western blot法检测ATO对KBM5、KBM5R细胞凋亡相关蛋白caspase-3、-8、-9的影响.结果表明,①IM作用于KBM5R细胞的IC50值为12.66±0.565 μmol/L,明显高于对KBM5细胞的IC50值(0.303±0.031)μmol/L,两者比较差异具有显著性(p＜0.01);②不同浓度ATO作用于KBM5、KBM5R细胞24、48、72、96小时均表现出显著的增殖抑制作用,且具有浓度依赖性和时间依赖性;相同的药物浓度和时间点ATO对KBM5R细胞的增殖抑制作用强于对KBM5细胞;③ATO(2、4、8 μmol/L)作用于细胞48小时后KBM5、KBMSR 细胞凋亡率均以药物浓度依赖形式增加,且相同药物浓度时KBM5R细胞凋亡率较KBM5细胞高;④4 μmol/L ATO作用于KBM5、KBMSR细胞24小时后,细胞内cleaved caspase-3、-8、-9蛋白表达明显增加.结论:KBM5R细胞对IM具有显著的耐药性;ATO对KBM5、KBM5R细胞均具有增殖抑制和诱导凋亡作用,与野生型细胞KBM5比较,ATO对13151突变的KBM5R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用更强;ATO通过活化凋亡相关蛋白caspase-3、-8、-9诱导细胞KBM5和KBM5R的凋亡.     

反义寡核苷酸处理伊马替尼耐药慢粒细胞后Bcl-x剪接异构体的变化

目的探讨反义寡核苷酸Vivo-Morpholinos(vMO)处理对伊马替尼(Imatinib,IM)耐药慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞中Bcl-x基因选择性剪接的影响。方法将IM(1μM)组、荧光标记的vMO、IM联合vMO组(IM+vMO)、空白对照组分别与IM耐药CML细胞株K562/G01细胞进行共培养48h,通过RT-PCR和Western Blot分别检测K562/G01细胞胞内Bcl-x剪接异构体Bcl-xL/Bcl-xS mRNA和蛋白比值变化。结果分别与IM组和vMO组处理K562/G01细胞相比,IM+vMO组的Bcl-xL mRNA和蛋白表达量显著降低,同时Bcl-xS mRNA和蛋白表达量明显升高,而对照组中Bcl-x剪接异构体变化不明显。结论 K562/G01细胞在vMO处理后Bcl-xL/Bcl-xS mRNA和蛋白比值显著下调。     

Cyr61对慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药的影响及其机制研究

目的:探讨Cyr61对慢性粒细胞白血病(CML)伊马替尼(IM)耐药的影响及相关机制。方法:采用酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清中Cyr61含量，采用real-time PCR和Western blot检测细胞中Cyr61和Bcl-xL的表达水平，采用Annexin V-APC试剂盒分析细胞凋亡情况，通过Western blot检测细胞中信号通路相关蛋白的表达。结果:在CML IM耐药细胞系K562G细胞中Cyr61的表达水平增高。特异性下调Cyr61的表达降低了K562G细胞对IM的耐药性，促进IM诱导的细胞凋亡；在CML小鼠模型中，特异性下调Cyr61的表达能够提高K562G细胞对IM的敏感性。机制研究提示，Cyr61介导CML细胞IM耐药与Cyr61调控ERK1/2通路和凋亡相关分子Bcl-xL有关。结论:Cyr61在促进CML细胞IM耐药中起着重要作用，靶向Cyr61或其相关效应通路可能是克服CML细胞IM耐药的途径之一。     

三氧化二砷诱导T315I突变细胞KBM5R凋亡机制研究

伊马替尼( Imatinib,IM)是以bcr-abl融合蛋白为作用靶点的治疗慢性髓系白血病(CML)最有效的酪氨酸激酶抑制剂(TKI),但长期应用可使部分CML患者产生IM耐药性[1],特别是bcr-abl基因T315I点突变的CML患者对第一代和第二代TKI均具有较强的耐药性[2].我们前期临床试验已经证明,三氧化二砷( ATO)对T315I突变的KBM5细胞(KBM5R)增殖具有明显的抑制作用,可导致细胞G2/M期阻滞、诱导细胞凋亡,并且ATO对KB M5R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用明显强于野生型KBM5细胞[3-4].我们通过检测ATO对KBM5、KBM5R细胞bcr-abl mRNA和蛋白水平的变化及其对下游相关信号传导途径PI3K-AKT、JAK-STAT5的影响,探讨ATO对T315I突变KBM5R细胞诱导凋亡的作用机制.     

BMS-354825:一种新的酪氨酸激酶抑制剂

Bcr-Abl酪氨酸激酶的活化与慢性粒细胞白血病(CML)发病关系密切,伊马替尼作为Bcr- Abl激酶抑制剂可使CML缓解,但目前伊马替尼耐药的病例日渐增多。BMS-354825作为Src／Abl双重抑制剂,可对伊马替尼耐药的病例产生良好效果。本文就该药物的研究进展作一综述。     

伊马替尼耐药CML患者ABL基因激酶区突变检测

目的 研究伊马替尼(imatinib,IM)治疗慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)耐药患者ABL酪氨酸激酶区突变情况.方法 用巢式PCR扩增对IM治疗耐药的56例CML患者骨髓样本ABL基因激酶区序列,通过测序和序列同源性检索分析ABL激酶区突变情况.结果 56例患者检出突变1...     

ZD6474对伊马替尼耐药的K562细胞增殖的影响

目的 探讨酪氨酸激酶抑制剂ZD6474(Vandetanib)对K562细胞及其衍生的伊马替尼耐药的K562/G细胞的增殖抑制作用及其分子机制.方法 通过逐渐增加药物浓度的方法诱导伊马替尼耐药的K562/G细胞株,采用Western blot方法检测耐药细胞株中明显变化的分子.WST方法检测伊马替尼和ZD6474对细胞增殖的影响,流式细胞术检测药物对细胞周期的影响.采用RT-PCR、Western blot和体外Src激酶卣接测定的方法研究ZD6474作用的分子机制.结果 伊马替尼对K562细胞的IC50值为(0.28 4-0.04)μmol/L,而对K562/G细胞的IC50值为(15.80±0.93)μmol/L,K562/G细胞的耐药倍数为56倍,Western blot结果提示其耐药机制与磷酸化Src激酶(p-Src)的表达增强,Bcl-2和磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达升高有关.ZD6474呈剂量依赖的方式抑制K562和K562/G细胞增殖,48 h的IC50值分别为1.61 μmol/L和3.18 μmol/L.ZD6474作用24 h,可以显著诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡.分子机制研究显示,ZD6474显著抑制Src激酶活性,上调Bax/Bcl-2的比例,以及下调p-STAT3表达.结论 ZD6474可以有效抑制伊马替尼耐药的K562/G和亲本K562细胞增殖,诱导凋亡.其机制与ZD6474显著抑制Src激酶活性有关.     

Sonic hedgehog signaling regulates Bcr-Abl expression in human chronic myeloid leukemia cells

Purpose

Bcr-Abl fusion protein activates tyrosine kinase, resulting in the proliferation of leukemia cells, especially chronic myeloid leukemia (CML) cells. Imatinib (IM) effectively targets Bcr-Abl tyrosine kinase, but development of resistance to IM occurs with varying frequency.

Methods

Elucidation of the common regulatory pathway upstream of Bcr-Abl in IM-sensitive and IM-resistant CML cells is important for developing novel therapeutics against CML.

Results

This study demonstrated that IM preferentially inhibited the viability and Bcr-Abl expression in IM-sensitive K562 (K562) cells, but not in Bcr-Abl overexpressing IM-resistant K562 (K562R) cells. Both K562 and K562R cells expressed Shh preproprotein, cleaved Shh C-terminal and N-terminal peptides, as well as mRNA level of major Shh signaling molecules, including sonic hedgehog (Shh), patched (PTCH), smoothened (Smo) and Gli-1. Moreover, Gli-1 translocation into nucleus was evident in these two cell lines, suggesting that both K562 and K562R cells possess activated and major components of the Shh signaling pathway. Silencing of Gli-1 by interference RNA was accompanied by inhibition of Bcr-Abl protein expression. Pharmacological suppression of Bcr-Abl expression was restored by the Smo agonist purmorpharmine. Treatment of Shh peptide in both K562 and K562R cells not only increased Shh and Gli-1 expression, but also up-regulated Bcr-Abl expression. Resveratrol, a known Bcr-Abl inhibitor, reduced Gli-1 activation and inhibited the viability of CML cells.

Conclusions

Shh signaling may regulate Bcr-Abl expression in human chronic myeloid leukemia cells. Novel compounds inhibiting both Shh signaling and Bcr-Abl expression, such as resveratrol, may have potential to be effective agents against CML independent of IM resistance.     

Heme oxygenase-1 contributes to imatinib resistance by promoting autophagy in chronic myeloid leukemia through disrupting the mTOR signaling pathway

Heme oxygenase-1 (HO-1) has been verified to play an important role in imatinib (IM)-resistant chronic myeloid leukemia (CML) cells, but the mechanism remains unclear. In drug resistant CML cells, HO-1 expression abnormally increased and that of autophagy-related protein LC-3I/II also increased, so we herein postulated HO-1 was associated with autophagy. HO-1 expressions in IM-sensitive/resistant K562/K562R cells were regulated through lentiviral mediation. K562 cells transfected with HO-1 resisted IM and underwent obvious autophagy. After HO-1 expression was silenced in K562R cells, autophagy was inhibited and the sensitivity to IM was increased. The findings were related with the inhibitory effects of high HO-1 expression on the mTOR signaling pathway that negatively regulated autophagy. High HO-1 expression promoted autophagy by inhibiting mTOR. Similar to the cell line results, mononuclear cells of IM-resistant CML patients became significantly sensitive to IM when HO-1 expression was inhibited. In summary, HO-1, which is involved in the development of chemoresistance in leukemia cells by regulating autophagy, may be a novel target for improving leukemia therapy.     

流式细胞术检测Bcr-Abl阳性细胞的磷酸酪氨酸水平

[摘要] 目的：探讨流式细胞术检测Bcr-Abl阳性细胞的磷酸酪氨酸蛋白水平的应用。 方法：采用直接免疫荧光标记方法,应用P-Tyr-100抗体标记胞浆抗原,流式细胞术检测Bcr-Abl阳性细胞系(K562细胞)和Bcr-Abl阴性细胞系(HL60细胞)磷酸酪氨酸水平,并以同样的方法分析20例正常人外周血粒细胞和32例慢性粒细胞白血病病人(CML)中性粒细胞的磷酸酪氨酸水平,以细胞的平均荧光强度(MFI)表示其磷酸酪氨酸水平。结果：HL60细胞和K562细胞的MFI分别为170.89±23.42和 838.25±56.59,20例正常人、CML慢性期病人和CML加速/急变期病人的MFI分别为250.39±115.78、1549.66± 453.55和1879.29± 533.19,CML病人的MFI明显高于正常人(P<0.01),CML加速/急变期病人的MFI明显高于CML慢性期的病人(P<0.05)。结论：流式细胞术是一种理想的检测Bcr-Abl阳性细胞的磷酸酪氨酸水平的方法,且快速、敏感,有可能用于CML的快速诊断。     

5-氮杂胞苷可通过降低K562细胞miRNA-17-19b的表达抑制细胞增殖

本研究探讨miRNA-17-19b在不同细胞系的表达差异。用5-氮杂胞苷（5-aza）处理miRNA-17-19b表达水平相对较高的K562细胞系,观察其对miRNA-17-19b表达水平的影响。提取K562细胞系、HL-60细胞系、NB-4细胞系、HeLa细胞系、慢性髓系白血病（CML）病人外周血白细胞及动员后的正常人外周血白细胞总RNA,在多聚腺苷酸（ployA）加尾后进行逆转录,用荧光时实定量PCR的方法检测以上细胞miRNA-17-19b的相对表达水平。分别在24、48、72小时用2.5μmol/L的5-氮杂胞苷处理K562细胞系,在96小时后收集细胞,用荧光时实定量PCR的方法检测处理前后miRNA-17-19b的表达水平变化。抑制miR-19a在K562细胞系的功能,观察其对K562细胞增殖的影响。结果表明：K562细胞系及CML病人外周血白细胞的miRNA-17-19b的表达水平高于动员后的正常人外周血白细胞。对miR-17-19b表达水平相对较高的K562细胞系,5-氮杂胞苷处理可降低其miRNA-17-19b表达水平,通过抑制miR-19a的功能可以抑制K562细胞系的增殖。结论：与正常人外周血白细胞相比较,miRNA-17-19b在K562细胞系及CML病人的外周血白细胞中的表达水平较高,5-氮杂胞苷可抑制miRNA-17-19b在K562细胞系的表达,其中对miR-19a影响尤其显著;体外抑制miRNA-19a的功能可抑制K562细胞系的增殖。     

依托泊苷对伊马替尼体内清除慢性髓性白血病干细胞的作用研究

目的:探讨依托泊苷(ETO)对伊马替尼体内清除慢性髓性白血病干细胞的作用.方法:以SCL-tTA/ BCR-ABL小鼠为慢性髓性白血病动物模型,采用流式细胞术检测ETO单独或联合伊马替尼治疗慢性髓性白血病小鼠和正常FVB小鼠后,对小鼠骨髓和脾脏中白血病干细胞和外周血中性粒细胞数目的影响.结果:ETO和伊马替尼联合治疗后...     

STI-571 (imatinib mesylate) enhances the apoptotic efficacy of pyrrolo-1,5-benzoxazepine-6, a novel microtubule-targeting agent, in both STI-571-sensitive and -resistant Bcr-Abl-positive human chronic myeloid leukemia cells

Interactions between the Bcr-Abl kinase inhibitor STI-571 (imatinib mesylate) and a novel microtubule-targeting agent (MTA), pyrrolo-1,5-benzoxazepine (PBOX)-6, were investigated in STI-571-sensitive and -resistant human chronic myeloid leukemia (CML) cells. Cotreatment of PBOX-6 with STI-571 induced significantly more apoptosis in Bcr-Abl-positive CML cell lines (K562 and LAMA-84) than either drug alone (P < 0.01). Cell cycle analysis of propidium iodide-stained cells showed that STI-571 significantly reduced PBOX-6-induced G2M arrest and polyploid formation with a concomitant increase in apoptosis. Similar results were obtained in K562 CML cells using lead MTAs (paclitaxel and nocodazole) in combination with STI-571. Potentiation of PBOX-6-induced apoptosis by STI-571 was specific to Bcr-Abl-positive leukemia cells with no cytoxic effects observed on normal peripheral blood cells. The combined treatment of STI-571 and PBOX-6 was associated with the down-regulation of Bcr-Abl and repression of proteins involved in Bcr-Abl transformation, namely the antiapoptotic proteins Bcl-x(L) and Mcl-1. Importantly, PBOX-6/STI-571 combinations were also effective in STI-571-resistant cells. Together, these findings highlight the potential clinical benefits in simultaneously targeting the microtubules and the Bcr-Abl oncoprotein in STI-571-sensitive and -resistant CML cells.     

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡的机制探讨

本研究旨在探讨三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)诱导P210^Bcr-Abl K562细胞凋亡的发生机制。采用细胞培养、细胞形态观察、流式细胞术(FCM)测定凋亡细胞和细胞周期，应用半定量逆转录一-合酶链反应(RT—PCR)分析ATO作用不同时间后K562细胞bcl—Xl和bcr-abl基因的改变，并检测胞浆细胞色素C(cyt C)、半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白的表达。结果表明：2．5μmol／L ATO作用48小时可诱导K562细胞凋亡，凋亡进程中细胞胞浆内cyt C蛋白浓度增高，caspase-3活性增强；RT—PCR显示ATO对bcr-abl基因表达无明显影响，但12小时可下调bcl-XL基因。结论：ATO通过激活胞浆线粒体下游的cyt C和caspase-3激酶活性而诱导K562细胞凋亡，bcl—XL基因下调也促进了细胞凋亡。