核转录因子KLF4在肾脏缺血再灌注损伤中的表达与保护机制探讨

目的 研究核转录因子KLF4在肾脏缺血再灌注损伤中的表达,并对其保护作用的可能机制进行探讨.方法 Realtime-RT-PCR方法检测大鼠双肾在缺血1h,再灌注后不同时间点的KLF4表达情况,Western Blot方法检测KLF4在过氧化氢(H2O2)刺激的人胚肾细胞HEK293中的表达情况,采用基因转染技术过表达KLF4或抑制HEK293细胞中KLF4表达,观察KLF4的表达改变对H2O2损伤引起HEK293细胞死亡率的影响.结果 KLF4在大鼠肾脏缺血-再灌注时表达显著增高,在遭受H2O2损伤时,人胚肾细胞HEK293中KLF4的mRNA与蛋白表达也显著增高.过表达KLF4基因则能显著降低H2O2所致的HEK293细胞株的死亡率.抑制KLF4的表达能明显增加H2O2导致的HEK293肾细胞的死亡率.结论 KLF4极有可能是一个在肾脏缺血再灌注损伤过程中具有保护作用的核转录因子.     

福辛普利、氯沙坦对肾小管上皮细胞TLR4表达的影响

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)在高血压肾损害中的作用机制以及福辛普利(fosinopril,Fos)、氯沙坦(Iosartan,Los)的肾脏保护机制.方法:将大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)分5组:正常时照组、NRK-52E Ang Ⅱ组、NRK-52E Ang Ⅱ Fos(10-5mmol/L)组、NRK-52E Ang Ⅱ Los(10-5 mmol/L)组、NRK-52E AngⅡ Fos(10-5 mmol/L) Los(10-5 mmol/L)组,培养24 h进行检测;同时建立稳定转染TLR4-specific RNAi质粒的NRK-52E细胞株.RT-PCR检测TLR4,IL-6,TNF-a mRNA表达;Western印迹检测TLR4蛋白表达;免疫细胞化学方法观察NF-KB核易位情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清IL-6及TNF-a水平.结果:Ang Ⅱ可上调TLR4,IL-6,TNF-a的表达水平,诱导NF-KB核易位活化(P<0.01);TLR4-specific RNA干扰后NRK-52E中TLR4水平显著下降(P<0.01),Ang Ⅱ刺激转染后的NRK-52E,其TLR4,IL-6,TNF-a水平较NRK-52E Ang Ⅱ组显著下降(P<0.01),NF-KB核活化水平无明显变化(P>0.05).Fos或/和Los干预后可明显下调TLR4,IL-6,TNF-a表达,显著抑制NF-kB活化(P<0.01或P<0.05),联合用药与单药组无统计学差异(P>0.05).结论:TLR4在高血压肾损伤中可能有致炎作用.Fos和Los治疗高血压肾损害的作用机制之一,可能是通过下调TLR4基因及相关炎症介质的表达.     

软脂酸对肾小管上皮细胞TLR4表达的影响

目的通过研究软脂酸(PA)对肾小管上皮细胞Toll样受体4(TLR4)表达的影响,初步探讨游离脂肪酸(FFA)在引发肾脏微炎症反应的相关作用机制。方法体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),采用不同浓度软脂酸进行干预,用RT-PCR法检测12 h、24 h后肾小管上皮细胞TLR4 mRNA水平,ELISA方法检测24 h后IL-6、TNF-α的表达。结果软脂酸组的TLR4、IL-6、TNF-α表达较对照组均明显升高,且呈现一定的浓度依赖趋势(P<0.05)。结论软脂酸可能是通过刺激肾小管上皮细胞表达TLR4而促进肾脏炎症反应。     

miR-155反义寡核苷酸转染对甲状腺癌细胞迁移、侵袭和MMP-13表达的影响

目的: 探讨miR-155表达对人甲状腺癌细胞增殖及侵袭力的影响。方法：构建针对miR-155的反义寡核苷酸（antisense miR-155,AS-miR-155),同时设立空白对照组和无义寡核苷酸(oligodeoxyribonucleotides,ODN)组。人甲状腺癌BCPAP细胞经转染处理后,采用荧光实时定量PCR检测3组细胞中miR-155 mRNA表达水平,划痕试验检测癌细胞迁移能力,Transwell方法检测细胞的侵袭能力。采用ELISA方法检测各组癌细胞上清液基质金属蛋白质酶（matrix metalloproteinase 13,MMP-13）含量。结果： 与对照组和无义ODN组比较,转染AS-miR-155组BCPAP细胞miR-155表达水平降低,细胞迁移速度变慢,穿膜细胞数较少,细胞中MMP-13蛋白水平亦明显减低（P<0.05）。结论： 采用寡核苷酸下调miR-155高表达可抑制甲状腺癌细胞增殖及侵袭力,下调MMP-13表达是其重要机制。［关键词］     

环孢素A对肾小管上皮细胞MMP-2和 MMP-9表达和活性的影响

 【目的】 观察环孢素A(CSA)对近端肾小管上皮细胞基质金属蛋白酶-2和-9(MMP-2 和 MMP-9)表达和活性的影响&;#65377;【方法】 体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株NRK52E细胞至完全融合时,分别给予不同浓度的CSA 0,0.42,0.84,4.2,8.4 μmoL/L,实验观察48 h和72 h&;#65377;收集培养液,用明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9活性&;#65377;提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测MMP-2和MMP-9的mRNA水平&;#65377; 【结果】 CSA刺激NRK52E细胞呈剂量依赖性抑制MMP-2活性和mRNA表达&;#65377;与对照组(CSA 0 μmoL/L)比较,CSA0.42,0.84,4.2,8.4 μmoL/L的MMP-2活性分别下降为27%,24%,11%,9%;差异均有统计学意义,P < 0.05&;#65377;CSA刺激NRK52E细胞增加MMP-9活性和mRNA表达&;#65377;与对照组比较,CSA 4.2 μmoL/L 刺激48 h MMP-9活性上调为438%,72 h上调为237%,差异均有统计学意义,P < 0.05&;#65377; 【结论】 CSA对肾小管上皮细胞MMP-2表达和活性呈剂量依赖性抑制,以及对MMP-9表达和活性的诱导作用可能与CSA所致肾小管间质损害相关&;#65377;     

特异性shRNA抑制人近端肾小管上皮细胞Toll样受体4的表达

目的:研究RNA干扰法对人近端肾小管上皮细胞(HKC)中Toll样受体4(TLR4)表达的抑制作用。方法:将针对TLR4分子设计的采用体外转录生物合成的特异性短发卡RNA(shRNA)双链分子用脂质体转染的方法导入体外培养的HKC;应用免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察TLR4的分布及表达强弱;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测TLR4及内参照-βactin在mRNA水平和蛋白水平的表达量。结果:干扰组TLR4的荧光强度显著低于对照组,其mRNA和蛋白的表达量分别下降了67%和62%。同时观察到TLR4主要分布于HKC细胞的胞膜及胞质区。结论:采用生物体外转录的方法成功合成针对TLR4的shRNA双链分子,并有效地转入HKC细胞中使TLR4的表达下调。     

KLF4调控 MMP9对原发性肝癌的侵袭迁移能力的影响

目的：研究Krüppel 样因子4(KLF4)和基质金属蛋白酶9(MMP9)在原发性肝癌中的表达情况,探讨 KLF4调节MMP9对原发性肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法收集原发性肝癌手术患者癌和癌旁组织标本,通过免疫组织化学、实时荧光定量 PCR 和免疫印迹试验(Western blot)检测50例肝癌组织及对应癌旁组织中 KLF4和 MMP9的表达情况;构建重组质粒,上调肝癌细胞(HepG2细胞系)的 KLF4表达,检测 MMP9 mRNA 及蛋白水平的表达情况;转染后的 HepG2细胞运用 Tran-swell 侵袭试验和划痕试验观察侵袭和迁移能力的变化。结果相比癌旁组织,KLF4在肝癌组织中的表达明显降低(P <0.05),而 MMP9的表达明显增高(P <0.05)。通过构建重组质粒,上调 KLF4的表达,发现 MMP9的 mRNA 和蛋白表达均降低,并影响 HepG2细胞的侵袭和迁移能力。结论在原发性肝癌中,KLF4低表达,而 MMP9高表达。在肝癌细胞中上调 KLF4表达可引起 MMP9表达下降,进而抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。     

人子宫颈癌组织中MMP-26、MMP-9和TIMP-4的表达及其意义

目的：检测人子宫颈癌组织中基质金属蛋白酶-26 (MMP-26)、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及基质金属蛋白酶组织抑制因子-4（TIMP-4）的表达,探讨其与临床病理特征的关系。方法：应用免疫组织化学SP法检测10例正常子宫颈组织、6例宫颈原位癌和79例宫颈浸润癌组织中MMP-26、MMP-9及TIMP-4的表达。结果：MMP-26在宫颈原位癌和浸润性癌中阳性表达率分别为83.33%和82.28%,较正常子宫颈组织中表达明显增强（P<0.05）;MMP-26表达与子宫颈癌的肌层浸润深度和淋巴结转移有密切关联（P<0.05）,随着子宫颈癌浸润深度的增加,MMP-26阳性表达增强;淋巴结转移组MMP-26蛋白阳性表达率明显高于无淋巴结转移组(P<0.05)。MMP-9在宫颈浸润癌组织中阳性率为68.35%,MMP-9表达与子宫颈癌病理分级有密切关联,其在Ⅲ级子宫颈癌组织中的表达明显高于Ⅰ和Ⅱ级（P<0.05）。TIMP-4在正常子宫颈、原位癌及浸润性癌组织中的表达呈下降趋势,但差异无显著性（P>0.05）;TIMP-4的表达与子宫颈癌的临床分期有密切关联,其在早期癌中的表达高于晚期癌（P<0.05）。MMP-26与TIMP-4在子宫颈癌组织中的表达呈负相关关系（r_s=－0.259,P<0.05）;MMP-26与MMP-9蛋白在子宫颈癌组织中的表达无相关性（r_s=0.140,P>0.05）。结论：MMP-26和MMP-9在宫颈癌组织中高表达,促进其侵袭和转移;TIMP-4在子宫颈癌组织中的表达下降,提示三者联合应用有望成为一项判断子宫颈癌预后的指标。     

CTGF对体外人晶状体上皮细胞表达MMP-2、TIMP-2的影响

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)对体外培养人晶状体上皮细胞(HLECs)基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)表达的影响.方法 采用免疫细胞化学染色法及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测不同浓度CTGF对HLECs诱导MMP-2及TIMP-2的表达.结果 在无CTGF刺激的情况下,HLECs基本不表达MMP-2及TIMP-2;随着CTGF浓度增加,HLECs表达MMP-2增加,并且这种作用随浓度的增加而增强,每两组之间的比较差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);对TIMP-2的表达无明显影响(P＞0.05).结论 CTGF能诱导HLECs表达MMP-2,对HLECs表达TIMP-2无影响;MMP-2/TIMP-2的比例失调,引起ECM的代谢紊乱,可能是后发性白内障的发病机制之一.     

siRNA靶向沉默HIF-1α基因对肺癌A549细胞转移和侵袭的影响

目的:探讨质粒介导RNA干扰抑制HIF-1α基因对肺癌A549细胞转移和侵袭能力的影响。方法:利用基因工程方法构建HIF-1α的干扰表达载体,并将其转染至肺腺癌A549细胞;分别用RT-PCR方法、Western blot方法检测细胞转染前后HIF-1α以及MMP-2的mRNA及蛋白表达的变化。细胞划痕试验和Transwell实验检测转染前后肺腺癌A549细胞迁移及侵袭能力的改变。结果:转染后肺腺癌A549细胞中HIF-1α和MMP-2的mRNA表达分别下降86%和64%(P<0.05)。转染后细胞蛋白表达明显下降。转染前后穿膜细胞数分别为(135.2±13.2)、(63.7±10.5),差异具有统计学意义(P<0.05)。转染前后划痕宽度分别为(0.48±0.14)、(1.04±0.15)mm,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:RNAi可有效抑制HIF-1α的表达,同时可结合MMP-2启动子下调MMP-2基因和蛋白的表达,降低肺癌A549细胞的转移和侵袭能力。     

携带人\AKT2、PDK1、BAD基因的慢病毒表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建含人丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT2)、磷酸肌醇依赖激酶-1(phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1）、bcl-2相关性死亡蛋白（bcl-2-associated death protein,BAD）基因的绿色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 选择病理证实的非小细胞肺癌(NSCLC)组织,采用特异性引物RT-PCR扩增AKT2、PDK1及BAD cDNA。将PCR产物与T载体连接测序,测序正确的目的片段从T载体上酶切下与慢病毒骨架质粒连接,将此重组的慢病毒表达载体质粒及包装系统共转染入293T细胞（人胚肾细胞系）,收集病毒上清,Western blot检测AKT2,BAD及PDK1蛋白质表达。结果 凝胶电泳证实AKT2,BAD,PDK1三基因成功转导至以pCDF1-MCS2-EF1-copGFP为骨架质粒的慢病毒包装系统中,磷酸钙转染法72 h后BAD、PDK1及AKT2的转染率分别约为100%、95%、90%。慢病毒包装后测定3种病毒滴度均达6.7×106 PFU/mL,并通过Western blot法检测到AKT2,BAD,PDK1蛋白在293T细胞的表达。结论 成功构建了携带人AKT2、BAD、PDK1原癌基因的慢病毒表达载体,在293T细胞中成功鉴定其表达。     

下调53BP1基因表达对喉部鳞癌细胞放射增敏作用的研究

目的 利用RNA干扰技术下调喉部鳞癌Hep-2细胞株P53结合蛋白1基因（53BP1）的表达,观察其对肿瘤细胞周期及放疗敏感性的影响。方法 构建53BP1短发夹RNA（shRNA）重组质粒,然后转染Hep-2细胞株,构建稳定低表达53BP1的Hep-2细胞系,通过Western blot检测转染空载质粒的Hep-2细胞（NC）、野生型Hep-2细胞（未转染,Hep-2组）和稳定转染下调53BP1表达的Hep-2细胞组（P6组）细胞53BP1蛋白的表达水平,MTT法检测转染对细胞正常情况下增殖的影响,通过流式细胞术检测经放射线照射后的细胞周期分布,并采用克隆形成实验检测下调53BP1表达的Hep-2细胞系对放射的敏感性变化。结果 成功构建了稳定低表达53BP1的Hep-2细胞株P6,Western blot显示P6组Hep-2相较野生型Hep-2细胞中53BP1蛋白水平下降（P<0.05)。MTT结果示下调53BP1蛋白表达并未影响细胞正常的生长。P6组下调53BP1后,经不同剂量放射后G2/M期周期阻滞较NC组和野生型Hep-2细胞减弱（P<0.05）,周期阻滞比例随放射剂量增加而增加。在0、2、6、10 Gy剂量的照射后,P6组放射敏感参数（D0、N、Dq、SF2）均低于野生型Hep-2组和对照组（P<0.05)。结论 RNA干扰可下调53BP1表达的Hep-2细胞,减少G2/M周期阻滞,从而增强对放射的敏感性。     

中国地鼠口腔颊囊黏膜癌变过程凋亡相关基因caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2的表达

目的 探讨凋亡相关基因caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2在中国地鼠口腔正常黏膜、上皮单纯增生、上皮异常增生和鳞状细胞癌组织中的表达及其意义。方法 采用免疫组织化学法、RT-PCR检测正常中国地鼠口腔黏膜上皮、单纯增生上皮、异常增生上皮和鳞癌组织中caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白及mRNA的表达。结果 在口腔黏膜癌变过程中,鳞癌组织中抑制凋亡蛋白Bcl-2表达明显高于口腔正常黏膜、上皮单纯增生、上皮异常增生（P<0.05）;异常增生上皮caspase-3、caspase-9、Bax表达均明显高于正常组（P<0.05）,但随着增生程度的加重,caspase-3、caspase-9、Bax表达明显降低（P> 0.05）。相关性分析显示,鳞癌组织中Bcl-2与Bax、caspase-3、caspase-9呈负相关（P< 0.05）。RT-PCR结果表明,与正常组织相比,鳞癌组织中Bcl-2高表达,而caspase-3、caspase-9、Bax的mRNA表达显著下调（P<0.05）。结论 本实验在中国地鼠鳞癌组织中caspase-3、caspase-9、Bax表达降低而Bcl-2表达上升,揭示了caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2表达与口腔鳞癌的发生、发展密切相关,可以为口腔颊囊黏膜癌的基因治疗提供一些线索或并为评价OSCC的生物学特征及预后提供参考。     

氧化应激对C2C12肌原细胞中KLF4表达的影响

目的:观察心肌细胞氧化应激反应对KLF4表达的影响.方法:采用过氧化氢处理的小鼠C2C12肌原细胞模拟相应的氧化应激细胞模型;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测C2C12肌原细胞中KLF4 mRNA的表达情况;采用蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测KLF4蛋白的表达情况.结果:不同浓度H2O2处理C2C12肌原细胞12 h后,KLF4 mRNA和蛋白的表达水平均明显增多,呈剂量依赖性;1 mM H2O2处理肌原细胞不同时间后KLF4 mRNA和蛋白的表达水平均明显增加,具有时间依赖性.结论:细胞氧化应激反应能显著诱导C2C12肌原细胞中KLF4的高表达.     

人VIGILIN基因分段克隆及表达大鼠肾组织干细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨人高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制。 方法 根据 VIGILIN基因全长编码区的结构域,将 VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/ VIGILIN为模板分别扩增5个片段及全长cDNA后克隆至pGEX 5X 3原核表达载体, 测序,然后将鉴定后的重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21中进行诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳及Western blot检测蛋白表达结果。结果 成功扩增了人 VIGILIN基因编码区分段片段,并且构建到原核表达载体中,经酶切、测序鉴定证实序列完全正确,重组载体构建成功,并且在pGEX原核表达系统中诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot检测初步证实表达成功。 结论 本实验首次根据VIGILIN蛋白不同的结构域成功构建了GST-VIGILIN分段克隆原核表达载体,并且对融合蛋白表达条件进行了优化,成功表达了GST 融合蛋白。     

miR-429及其目标基因HSPA4L在弱精症低活力精子中的表达

目的 探讨miR-429及其目标基因热休克蛋白A4L（HSPA4L）在弱精症患者低活力精子中的表达。方法 收集20份成年健康生育能力的精液标本和20份弱精症患者精液标本,按照 WHO第五版规定的精液分级标准,对液化后的精液进行常规参数分析;利用qRT-PCR检测精子中miR-429的表达水平;通过生物信息学手法预测miR-429 的靶点;构建HSPA4L 3′UTR双萤光素酶报告载体,采用双萤光素酶报告实验验证miR-429的靶基因;利用qRT-PCR和Western blot分别检测HSPA4L mRNA和蛋白的表达水平。结果 弱精症精子活力低于健康对照组,同时miR-429在弱精症精子中表达上调。通过生物信息学手法、双萤光素酶报告基因基检测以及转染实验发现miR-429 通过作用于HSPA4L 3′UTR来抑制HSPA4L mRNA和蛋白的表达。进一步的qRT-PCR分析发现弱精症组的HSPA4L mRNA和蛋白的表达水平下调,并且HSPA4L mRNA 表达水平与miR-429 的表达水平呈负相关（r=-0.725,P<0.05)。结论 miR-429在低活力精子中的表达上调,可能通过调控HSPA4L基因来影响精子的活力。     

miRNA-155 Modulates the Malignant Biological Characteristics of NK/T-Cell Lymphoma Cells by Targeting FOXO3a Gene

This study investigated the effects of miRNA-155 on malignant biological characteristics of NK/T-cell lymphoma cell lines and the possible mechanism. The expression of miRNA-155 was detected in lymphoma cell lines from different sources （SNK-6, YTS, Jurkat and DOHH2） by real-time PCR. Lentiviral vectors （pLL3.7） that could overexpress or downexpress miRNA-155 were constructed. Recombinant lentiviral particles were prepared and purified, and their titers determined. The expression of miRNA-155 in the infected SNK-6 cells and the cell proliferation were detected by PCR and CCK-8, respectively. Flow cytometry was used to determine the apoptosis of infected SNK-6 cells. The target of miRNA155 was predicted from Targetscan website. The effect of miRNA155 on FOXO3a expression was examined by Western blotting. The results showed that among the human NK/T-cell lymphoma cell lines SNK-6, YTS, Jurkat and DOHH2, the expression of miRNA-155 was highest in SNK-6. The infection efficiency of the recombinant lentivirns in SNK-6 was more than 70% at multiplicity of infection （MOI） of 100. The expression of miRNA-155 was significantly increased in SNK-6 cells infected by lentivirus vectors with high expression of miRNA-155 （4 times higher than the control group）, and profoundly decreased in those infected with lentivirnses with low expression of miRNA-155. The proliferation of letivirns-infected SNK-6 cells was decreased as the expression of miRNA-155 reduced. The apoptosis rate was increased with the reduction in the expression of miRNA-155. FOXO3a was found to be a possible target of miRNA155, as suggested by Targetscan website. Western blotting showed that the expression of FOXO3a was significantly elevated in SNK-6 cells with miRNA-155 inhibition. It was concluded that reduction in miRNA-155 expression can inhibit the proliferation of SNK-6 lymphoma cells and promote their apoptosis, which may be associated with regulation of FOXO3a gene.     

人子宫颈癌基因-2干扰抑制HepG2肝癌细胞mRNA的表达

目的利用构建的特异性针对HCCR-2的干扰质粒RNAi-H1,研究HCCR-2干扰对HepG2肝癌细胞mRNA的影响.方法将干扰质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系.Real-timePCR检测HCCR-2mRNA表达水平.结果Real-time PCR结果表明HepG2-H1mRNA表达明显减少.结论HCCR-2干扰可以抑制HepG2肝癌细胞mRNA的表达.     

RNA干扰抑制乳腺癌MCF-7细胞鼠双微体-2基因表达及细胞增殖的实验研究

目的 研究乳腺增生症、乳腺导管内癌和浸润性乳腺癌组织中mdm2蛋白的表达及siRNA mdm2对肿瘤细胞增殖的影响.方法 采用免疫组织化学方法检测乳腺增生症、乳腺导管内癌和浸润性乳腺癌组织中mdm2蛋白的表达;将siRNA mdm2质粒转染乳腺癌MCF-7细胞,应用MTT检测siRNA mdm2对肿瘤细胞增殖的抑制作用.结果 mdm2蛋白在乳腺导管内癌组织和浸润性乳腺癌组织中的阳性表达率均为100％(18/18,20/20),在乳腺增生症组织中表达阳性率为20％(4/20).与乳腺增生症组织比较,乳腺导管内癌组织和浸润性乳腺癌组织中mdm2蛋白阳性表达率明显增高(P＜0.01).MTT结果表明转染pGCsiRNA-mdm2后MCF-7细胞生长受到抑制,与mock组和pGCsiRNA-scramble组比较差异有统计学意义(P＜0.01).转染pGCsiRNA-mdm2 72 h后与48 h比较,MCF-7细胞生长受抑制明显,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 mdm2在乳腺癌组织中存在广泛表达,其阳性表达可能促进肿瘤细胞的增殖过程.     

miR-219a-5p通过下调 KLF4减轻 H2O2 诱导的人心肌细胞氧化损伤

摘要:目的 探究 miR-219a-5p对人心肌细胞(HCM)氧化应激损伤的作用和机制。方法 利用 H2O2建立 HCM 氧 化应激模型,将 HCM 细胞随机分成4组:对照组、H2O2组(200μmol/L H2O2处理6h),H2O2+NCmimic组(H2O2处理 前转染对照 mimic)和 H2O2+miR-219a-5p组(H2O2处理前转染 miR-219a-5pmimic)。噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力, 流式细胞术 检 测 细 胞 凋 亡,Real-timePCR 检 测 miR-219a-5p 和 KLF4 mRNA 表 达,Westernblot检 测 Bax、Bcl-2 和 Krüppel样因子4(KLF4)蛋白表达,试剂盒检测活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量。另外,利 用荧光素酶报告基因实验确证 miR-219a-5p与 KLF4的相互作用关系。结果 与对照组相比,H2O2 组中 miR-219a-5p 表达、细胞活力和SOD水平降低,细胞凋亡、Bax/Bcl-2、ROS和 MDA 水平以及 KLF4表达升高(均P<0.05)。与 H2O2 组相比,H2O2+miR-219a-5p组中 miR-219a-5p表达、细胞活力和 SOD 水平升高,细胞凋亡、Bax/Bcl-2、ROS和 MDA 水 平以及 KLF4表达降低(均P<0.05)。H2O2+ NCmimic组与 H2O2组相比上述指标变化均不大,差异均无统计学意义 (均P>0.05)。荧光素酶实验结果显示,miR-219a-5p能够降低 KLF4-野生型质粒的荧光素酶活性(P<0.05)。结论 miR-219a-5p对 H2O2诱导的 HCM 细胞氧化应激损伤具有缓解作用,这种作用可能是通过下调 KLF4的表达发挥的。