特异性沉默Eca109 细胞系stat hmin 基因siRNA 表达载体的构建

 目的 构建并筛选特异性沉默stathmin基因的pSUPER-S逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞克隆。方法 用DNA重组技术,将64nt能转录产生靶向stathmin小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER-EGFP,应用脂质体将重组逆转录病毒载体pSUPER-S转染细胞系Eca109,G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,RT-PCR检测转染细胞stathminmR-NA的表达。结果 重组逆转录病毒载体经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,可见4692nt和285nt条带;测序结果表明插入序列正确;重组载体转染Eca109细胞,可表达绿色荧光蛋白（EGFP）,经G418筛选得到抗性细胞克隆,转染细胞stathmin mRNA的表达较对照组明显减弱。结论 特异性沉默stathmin基因的pSUPER-S逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞系构建和筛选成功。     

pLXSN-bcr/abl质粒载体的构建及其逆转录病毒的生成

目的:构建bcr/abl融合基因的逆转录病毒载体,通过细胞包装获取高滴度含bcr/abl基因的逆转录病毒.方法:RT-PCR法克隆K562细胞bcr/abl基因断裂点DNA片段,构建pLXSN-bcr/abl表达载体;阳离子脂质体法将重组体转染EcoPack2TM-293包装细胞,序列测定鉴定病毒并测定病毒滴度.结果:成功构建pLXSN-bcr/abl重组体,序列测定与已知相应bcr/abl融合基因序列相同;脂质体法将重组体转染293包装细胞获得携带bcr/abl基因病毒,测滴度为6×105 cfu/mL.结论:成功构建pLXSN-bcr/abl表达载体,并获得高滴度含bcr/abl融合基因的逆转录病毒.     

人白细胞介素2重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA,并经核苷酸测序加以证实。将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2,体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10~5CFU/ml。NIH3T3小鼠成纤维细胞感染hIL-2重组逆转录病毒后,分泌IL-2水平达118.2U/ml;PCR从其基因组DNA中扩增到NeoR基因片段,提示重组逆转录病毒载体己整合至宿主细胞的基因组DNA中。本研究为开展人IL-2基因治疗奠定了基础。     

利用GFP逆转录病毒标记肿瘤与血管内皮细胞

目的 制备携带GFP基因的逆转录病毒,以简便、快速标记活细胞。方法 将编码GFP的cDNA片段插入逆转录病毒载体pLNCX构建重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP,借助脂质体转染单嗜性及双嗜性逆转录病毒包装细胞,G418筛选抗性克隆,然后利用荧光显微镜选出GFP表达最高的克隆。取含有毒颗粒的上清液感染NIH3T3及多种肿瘤或血管内皮细胞。结果 重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转染包装细胞后,包装细胞可表达GFP并产生GFP逆转录病毒。尽管GFP逆转录病毒对动物及人的肿瘤细胞或血管内皮细胞的感染能力各不相同,但由于逆转录病毒能整合进入宿主细胞基因组DNA内,经短期G418筛选后容易获得持续、稳定、高水平表达GFP的阳性细胞。表达GFP的肿瘤细胞仍可在同系动物体内生长并持续表达GFP。携带GFP基因的逆转录病毒能简便、快速介导稳定的基因转移,遗传标记多种细胞,比表达质粒等更优越。     

靶向EBV潜伏期基因EBNA2小干涉RNA系统的构建

[目的]构建携带靶向EBV核抗原EBNA2(EBV nuclear antigen,EBNA)的pSUPER.retroRNAi逆转录病毒载体,进而筛选出稳定产毒的细胞克隆。[方法]用DNA重组技术将60nt能转录产生靶向EBNA2小发夹RNA(smallhairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸序列定向插入逆转录病毒载体pSUPER.retro,并用限制性内切酶酶切和测序鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PheonixA,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆。[结果]重组逆转病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7167bp和281bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染的包装细胞经G418筛选获得能产生逆转录病毒的抗性细胞克隆,病毒滴度为2.5×104CFU/ml。[结论]成功构建和筛选出靶向EBV潜伏期基因EBNA2的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系,为深入探讨EBNA2基因的细胞转化和抗凋亡作用提供了实验基础。     

重组人GM-CSF逆转录病毒基因转移系统的建立及其在人肿瘤细胞中的稳定表达

目的　建立逆转录病毒介导的 GM- CSF基因转移系统 ,为 GM- CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。方法　应用基因重组技术将 GM- CSF c DNA克隆于逆转录病毒载体p DORneo,获得重组载体 p DORGM。经脂质体介导将其转染于病毒包装细胞系 PA317细胞 ,经NIH3T3细胞检测病毒滴度 ,NIH3T3放大实验检测辅助病毒 ,并用高滴度病毒感染人乳腺癌细胞系MCF- 7。结果　GM- CSF基因克隆入逆转录病毒载体 ,经 PA317细胞包装产生病毒 ,最高的病毒滴度为 1× 10 6CFU/ ml,且没有发现辅助病毒存在。重组病毒感染的人乳腺癌 MCF- 7细胞在体外长期培养中保持稳定分泌 GM- CSF,活性在 50 0～ 80 0 U/ 10 6细胞 / 2 4小时。结论　建立的逆转录病毒介导的GM- CSF基因转移系统安全、有效 ,为 GM- CSF应用于肿瘤基因治疗提供了实验基础。     

人肝癌相关基因ANGPTL4的克隆及鉴定

目的获取人肝癌相关基因血管生成素样4（angiopoietin-like4，ANGPTL4）cDNA克隆，构建重组逆转录病毒载体pMSCV-ANGPTL4，为进一步相关研究打下基础。方法以人肝细胞株HL-7702的总RNA为模板，用RT-PCR方法体外扩增出人肝癌相关基因ANGPTL4 cDNA，将其亚克隆至逆转录病毒载体pMSCV，测序鉴定。结果所克隆的ANGPTL4基因cDNA与文献报道的ANGPTL4基因完整编码区cDNA一致，成功构建重组逆转录病毒载体pMSCV-ANGPTL4。结论从人肝细胞株HL-7702中可以稳定克隆出ANGPTL4基因cDNA，成功将ANGPTL4 cDNA亚克隆至逆转录病毒载体pMSCV。     

ePNP自杀基因载体的构建及其表达

[目的]构建稳定表达ePNP（E.coliPNP）的细胞模型,为肿瘤的基因治疗提供实验基础。[方法]提取大肠杆菌E.coliK12总DNA,PCR方法克隆大肠杆菌ePNP基因,构建逆转录病毒载体质粒pMSCV-ANGPTL4,鉴定测序。脂质体法将三种逆转录病毒载体pMSCV-ANGPTL4、pVSV、pGAG-POL共转染293-EBNA包装细胞,获得高滴度病毒并感染MDA-MB435细胞。荧光显微镜与RT-PCR检测MDA-MB435细胞ePNP基因的表达。[结果]所克隆的ePNP基因与文献报道一致;成功构建了pMSCV/ePNP重组逆转录病毒载体;ePNP基因在MDA-MB435细胞中获得稳定表达。[结论]pMSCV/ePNP自杀基因载体的成功构建及其表达为ePNP应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

膜结合型TNF-α基因转导人胃癌细胞株的建立及其生物学特性研究

本研究利用逆转录病毒载体LXSN构建了插入突变的膜结合型TNF-α基因的重组逆转录病毒载体,将重组载体及空载体导入包装细胞CRIP,筛选G418抗性克隆。测定病毒滴度均为1×10~4CFU/ml,并转入胃癌细胞MGC-803,经筛选分别获得抗性克隆MGC-803~T及MGC-803~P。经Southern杂交证实目的基因已整合在MGC-803~T细胞基因组中。MGC-803~T对L929细胞有杀伤作用,而对照细胞无杀伤作用。MGC-803~T细胞的形态、体外增殖率无明显改变。裸鼠体内接种结果表明,与对照组相比,MGC-803~T细胞在裸鼠体内的生长受到明显抑制,表现为肿瘤发生延缓,肿瘤重量明显减轻。上述结果表明,逆转录病毒介导的突变型膜结合型TNF-α基因可在人胃癌细胞中获得有效表达,并能改变其生物学特性。     

重组人GM—CSF逆转录病毒基因转移系统的建立及其在人肿瘤细胞中的稳定…

建立逆转录病毒介导的ＧＭ－ＣＳＦ基因转移系统,为ＧＭ－ＣＳＦ基因悠我肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。应用基因重组技术将ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲｎｅｏ,获得重组载体ｐＤＯＲＧＭ。经脂质体介针其转染于病毒包装细胞系ＰＡ３１７细胞,经ＮＩＨ３Ｔ３细胞检测病毒滴度,ＮＩＨ３Ｔ３放大实验检测辅助病毒,并用同熵度病毒感染人乳腺癌细胞系ＭＣＦ－７。     

丁胱亚磺酰亚胺增强DAAO/D-Ala系统杀伤K562e细胞作用的研究

目的：研究丁胱亚磺酰亚胺（BSO）增强D－氨基酸氧化酶（DAAO）／D－丙氨酸（D－Ala）自杀基因系统在白血病基因治疗中的作用。方法：应用逆转录病毒转染技术获得稳定表达DAAO的高致瘤性K562e单克隆细胞KDfGC，用PCR、原位杂交对DAAO基因修饰的KDfGC进行鉴定。应用MTT法检测D－Ala对BSO预处理过的KDfGC细胞的杀伤作用。结果：PCR和原位杂交分析证明DAAO基因已整合至细胞基因组中，并在mRNA水平上表达。D－Ala作用24h，KDfGC细胞的半数抑制浓度（C50）为10.21mmol/L，KDfGC＋BSO的IC50为7.92mmol/L，两者的95％可信区间不重叠。结论：BSO可增强DAAO／D－Ala系统杀伤K652e细胞作用。     

Transfection of the DAAO gene and subsequent induction of cytotoxic oxidative stress by D-alanine in 9L cells

D-amino acid oxidase (DAAO) can catalyze the dehydrogenation of D-amino acids, such as D-alanine, to the corresponding amino acids and is then reoxidized by molecular oxygen to yield hydrogen peroxide, a reactive oxygen species, which reacts with DNA, lipids and protein, inducing cell death. This study investigated whether rat glioma 9L cells infected with the recombinant retrovirus containing the DAAO cDNA fragment can be induced in order to undergo cytotoxic oxidative stress by D-alanine. The recombinant retroviral vector, plzrus-DAAO-FLAG-GFP (pl-Dfg), was constructed and used to transfect packaged phoenix cells. The supernatant containing recombinant retroviral particles from the transfected phoenix cells was harvested and utilized to infect target 9L cells. The cytotoxic oxidative stress of infected 9L cells was induced by the DAAO substrate, D-alanine. The plasmid pl-Dfg was successfully constructed. The high titer retroviral supernatant was obtained from the transfected phoenix cells. Infected 9L cells were less viable after exposure to D-alanine compared to the control group. Anti-apoptotic proteins significantly inhibited cell death. The DAAO/D-alanine system has a potential utility for gene therapy and may be an effective strategy for the treatment of brain cancer and other malignant tumors.     

逆转录病毒载体介导人GM—CSF基因在HL—60白血病细胞的高效转…

探讨将外源基因导入白血病细胞的条件及可行性,为造血系统恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。方法采用脂质体（ｌｉｐｆｅｃｔｉｎ）包装技术将Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ导入包装细胞ＰＡ３１７,获得重组逆转录病毒,将重组病毒悬液感染人髓系白血病ＨＬ－６０细胞,经Ｇ４１８筛选出ＨＬ－６０转基因细胞群,应１用ＭＴＴ法测定ＧＭ－ＣＳＦ活性。结果ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测结果证实,ＧＭ－ＣＳＦ基因成功地转移     

逆转录病毒载体介导的IL-6大肠癌基因治疗实验研究

目的 探讨ＩＬ－６转基因表达对人肠癌细胞的体内外抑制作用。方法 参照分子克隆技术将重组建转录病毒载体ｐＺＩＰＩＬ－６ｃＤＮＡ转染ＰＡ３１７包装细胞,以Ｇ４１８筛选抗药性细胞人肠癌常规制备重组病毒液并感染大肠癌ＨＴ－２９细胞,采用ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ分析基转录水平,ＥＬＩＳＡ法和ＭＴＴ显色法检测蛋白表达的量与细胞活性,以细胞生长曲线和集落形成实验以及裸鼠移植瘤实验,观察转导株的体内外抑瘤作用,结     

人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

[目的] 构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体，建立高表达bax基因的Hela细胞。[方法] 通过RT-PCR方法从Hela细胞克隆bax基因，根据基因工程原理，经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBax SN-IRES2-EGFP．转染Hela细胞后，荧光显微镜和Western Blotting检测bax基因的表达情况。[结果] 成功构建了带有EGFP的bax基因的逆转录病毒表达载体，并将其转入Hela细胞。[结论] 成功建立的高表达bax基因的Hela细胞株，为探讨bax基因与放射敏感件之间的关系奠定了基础。     

核酶对肝癌耐药细胞株BEL—7402／DOX耐药性的逆转作用

为逆转多药耐药ｍｄｒ－１基因产物Ｐ－ｇｐ蛋白所介导的肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性，作者设计合成了一种能切割ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ第１９６密码子ＧＵＣ序列的锤头状核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ），并定向克隆于逆转录病毒载体。经ＰＡ３１７包装后，病毒上清感染ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞株。经Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证实，ＰＡ３１７及转化的ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞中均有病毒的高表达，ＲＴ－ＰＣＲ结果表明，转化细胞中ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ与未转化细胞相比明显减少甚至不能扩增出来，流式细胞技术检测发现转化细胞表面Ｐ－ｇｐ的表达与非转化细胞相比明显下降。ＭＴＴ法检测发现转化细胞对多种化疗药物重新产生较高的敏感性。结果提示，此Ｒｉｂｏｚｙｍｅ转化ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞后能有效抑制ｍｄｒ－１基因的表达，使已产生耐药的肝癌细胞的多药耐药表型发生逆转。     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建分泌型核心蛋白聚糖(decorin)真核表达载体,并在肝癌细胞HepG2中表达,为研究核心蛋白聚糖的抗肿瘤作用奠定基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术扩增核心蛋白聚糖全长基因cDNA片段,与pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot检测其表达。结果获得了约1080bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型核心蛋白聚糖cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞decorin蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染decorin的HepG2细胞株。     

慢病毒介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达

目的：探讨慢病毒系统介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的过表达,为进一步研究LKB1基因在子宫内膜癌的作用机制奠定基础。方法以PCR扩增LKB1克隆质粒获得全长cDNA,将LKB1 cDNA链接到慢病毒载体pWPI,构建慢病毒表达质粒LKB1/pWPI。通过与包装质粒pCMV-Dr8.74和pMD2.G共转染293T细胞进行病毒包装,用包装成功后的病毒液感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,以荧光定量PCR、Western blot法检测HEC-1A细胞中LKB1的相对表达量。结果成功扩增LKB1全长cDNA和构建LKB1重组慢病毒表达载体LKB1/pWPI。转染包装293T细胞后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞HEC-1A。转染后HEC-1A-LKB1-pWPI细胞中LKB1的表达率明显高于亲本细胞和空白对照细胞（P〈0.01）。结论成功构建携带LKB1基因的慢病毒表达载体,包装病毒后能有效地感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,为进一步探讨LKB1基因在子宫内膜癌中的生物学效应奠定了基础。     

HSV-tk/GCV系统对小鼠肝癌细胞体外杀伤效应的研究

目的:研究HSV-tk/GCV系统对小鼠肝癌细胞的体外杀伤作用.方法:利用重组DNA技术,将HSV-tk基因亚克隆至逆转录病毒载体(pLNCTK)中,在LipofectAMINE介导下,转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NTH3T3细胞测定病毒滴度,将重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞MM45T.Li,G418筛选,直至出现抗性克隆,挑取阳性克隆,扩大培养,命名为MM45T.Li/TK.PCR,RT-PCR对HSV-tk基因修饰的MM45T.Li细胞进行鉴定,然后观察CCV对MM45T.Li/TK和不同比例TK~ 与TK~-混合细胞的杀伤作用.结果:重组逆转录病毒滴度为5×10~5CFU/ml,PCR及RT-PCR分析证明HSV-tk基因已整合至MM45T.Li细胞基因组中,并在mRNA水平上的表达.MM45T.Li/TK与未转基因的原肿瘤细胞,二者的生长速度与形态结构无明显差别.MM45T.Li/TK细胞对CCV高度敏感,即低浓度GCV(1mg/L)处理MM45T.Li/TK细胞3d,即可将其杀死.旁观者效应显示将25%MM45T.Li/TK细胞与75%MM45T.Li混合,发现90%以上的细胞被杀死.结论:小鼠肝癌细胞对HSV-tk/CCV系统高度敏感,并具有明显的旁观者效应.     

S100A13 基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

 目的 构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,观察S100A13基因在COS-7细胞中的表达及定位。方法 采用克隆和亚克隆技术构建S100A13基因真核表达载体,脂质体介导转染COS-7细胞,RT-PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果 酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于全胞浆。结论 成功构建了S100A13基因真核表达载体,该基因在COS-7细胞中成功表达,S100A13基因表达定位于全胞浆。