乙型肝炎病毒X蛋白通过降低P4启动子甲基化水平上调人IGF-II基因的转录

目的:构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2-HBx,探讨HBx对胰岛素样生长因子 II(IGF-II)基因P4启动子甲基化水平及转录表达的影响。方法:应用基因重组技术,构建含HBx基因的重组逆转录病毒载体pBABE-puro-HBx,采用磷酸钙共沉淀法将其转染293FT包装细胞产生逆转录病毒,感染HepG2肝癌细胞,采用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选,Western blotting鉴定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx。采用亚硫酸氢盐测序法及实时荧光定量RT-PCR检测HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化水平及P4 mRNA表达水平变化。进一步将体外甲基化的人IGF-II基因P4启动子驱动的荧光素酶报告载体pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X质粒共转染HepG2肝癌细胞,采用亚硫酸氢盐测序法及双萤光素酶实验检测pGL3-P4载体上P4启动子甲基化水平及转录调控活性变化。结果:(1)经Western blotting鉴定,成功构建了稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx;(2)表达HBx蛋白的HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化CpG位点的比例(9.0%)明显低于对照细胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01),而其P4 mRNA表达水平则为对照细胞HepG2-control的2.8倍;(3)共转染pCMV-tag2B-X质粒的HepG2细胞中pGL3-P4载体上P4启动子甲基化CpG位点的比例(60.8%)明显低于共转染对照质粒pCMV-tag2B的HepG2细胞(84.1%)(P<0.01),而前者P4启动子相对萤光素酶活性(14.12±0.89)则明显高于后者(4.61±0.76)(P<0.01)。结论:HBx蛋白可降低IGF-II基因P4启动子甲基化水平,进而上调其转录表达。     

miR-122启动子序列的克隆及特异性分析

目的 miRNA- 122启动子序列的预测、克隆及特异性分析.方法 分别从肝癌细胞系Huh-7及HepG2中扩增出预测的miR-122启动子,并将其克隆至含荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)报告基因pGL4.17质粒上,用重组质粒转染Huh-7、HepG2及HeLa细胞,分析启动子的特性.结果 成功预测并克隆出miR-122的启动子序列.重组质粒转染细胞后,启动子能够启动Fluc的表达.用含启动子P1的重组载体pGL4.17-P1转染HeLa细胞后,用两种荧光素酶检测体系测得重组载体中荧光素酶的表达水平显著高于对照组(t =0.000 21,P＜0.01及t=0.000 38,P＜0.01).结论 Huh-7、HepG2细胞中miR-122表达差异与启动子序列缺失无关.而受miR-122启动子调节的报告基因在非肝细胞系(HeLa)中也表达,表明miR-122启动子不具有肝细胞特异性.     

HBV通过增强DNAJB4启动子活性调节其在HepG2.2.15细胞中的表达

目的 初步探讨HBV与DNAJB4基因的转录调节作用机制.方法 用RT-PCR及Real-time PCR检测HepG2.2.15细胞和HepG2细胞中DNAJB4在mRNA水平上的表达差异.构建DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒,分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞,比较虫荧光素酶活性.结果 在mRNA水平上,DNAJB4在HepG2.2.15细胞中的表达量是其在HepG2细胞中表达量的2.59倍,且二者有显著性差异(P＜0.01).DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性是其对照组的2.28倍.转染HBs和HBc表达质粒组的相对荧光素酶活性分别是其对照组的2.11倍和1.77倍,而HBx、HBp表达质粒对荧光素酶活性没有影响.结论 在HepG2.2.15细胞中,HBV能通过增强DNAJB4启动子活性增加DNAJB4转录水平的表达,其中HBs和HBc蛋白起主要作用.     

脂联素对HepG2细胞中脂肪酸 合成酶及激素敏感性脂肪酶基因启动子活性的影响

目的构建含人脂肪酸合成酶(FAS)及激素敏感性脂肪酶(HSL)基因启动子的荧光素酶报告基因表达质粒,探究脂联素对人肝癌细胞系HepG2中FAS及HSL基因启动子活性的影响。方法扩增人FAS及HSL启动子序列-622～+3 bp片段与-697～+53 bp片段,构建含人FAS及HSL启动子的pGL3-hFAS625-Luc(hFAS 625-Luc)与pGL3-hHSL750-Luc(hHSL 750-Luc)荧光素酶报告基因表达质粒。脂质体瞬时转染HepG2细胞,观察0.5～10.0μg/mL脂联素作用24 h或者5μg/mL脂联素作用2～32 h细胞中荧光素酶活性的变化。结果 hFAS 625-Luc与hHSL 750-Luc荧光素酶表达质粒均能在HepG2细胞中良好表达。1.0～10.0μg/mL脂联素作用24 h能剂量依赖性地促进转染hFAS 625-Luc及hHSL 750-Luc质粒的HepG2细胞中荧光素酶的表达,最高分别达到对照组的1.76倍(P0.01)和1.37倍(P0.01)。5μg/mL脂联素作用于转染hFAS 625-Luc质粒的HepG2细胞4 h和8 h能够促进荧光素酶的表达(P0.01),作用16 h和32 h则抑制荧光素酶的表达(P0.01);而脂联素对转染hHSL 750-Luc质粒HepG2细胞作用不同时间(2～32 h)均能促进荧光素酶的表达,最高为对照组的1.37倍(P0.01)。结论成功构建含人FAS与HSL启动子荧光素酶报告基因质粒。脂联素能够剂量依赖性地促进HepG2细胞中FAS及HSL启动子活性。脂联素作对FAS启动子的活性影响与作用时间有关,而对HSL启动子活性的影响一直表现为促进作用。     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

TFF1基因启动子双荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

目的:构建含有野生型或突变型人三叶因子1(Trefoil factor 1,TFF1)基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并研究雌激素对上述启动子转录活性的影响。方法:设计人野生型和突变型TFF1基因启动子的引物,扩增回收片段,将其克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中构建重组质粒,经双酶切和测序鉴定后转染胆囊癌GBC-SD细胞,24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的表达活性。结果:成功构建了野生型pGL3-TFF1质粒和雌激素应答元件(Estrogen response elements,ERE)位点突变的pGL3-TFF1-△ERE突变质粒,激活蛋白1(Activating protein-1,AP-1)位点突变的pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒。经双荧光素酶报告基因检测分析,pGL3-TFF1质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒均具有基础转录活性,与对照组比较(P0.001)。雌激素能进一步增强野生型TFF1启动子质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒的启动子转录活性(P0.01),而对pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒的活性无影响(P0.05)。结论:本研究成功构建了野生型以及突变型TFF1启动子质粒,发现非经典雌激素受体结合部位——激活蛋白1(AP-1)位点对雌激素诱导的TFF1启动子转录活性增强发挥决定性作用。     

载脂蛋白AⅠ基因启动子和内含子1中的单核苷酸多态性对其表达的影响

目的构建含ApoAⅠ基因调控区和荧光素酶报告基因的真核表达载体，探讨ApoAⅠ基因启动子区域-75bp G→A置换及第1内含子＋83bp C→T置换对ApoAⅠ表达的影响。方法采用PCR方法扩增人染色体中含ApoAⅠ基因-145～＋289bp的DNA片段，筛选出含ApoAⅠAA／CC基因型（-75bp变异，＋83bp无变异）、GG／TT基因型（-75bp无变异，＋83bp变异）及GG／CC（-75bp和＋83bp均无变异）的DNA片段，构建含以上3个基因片段的pUC重组载体，经SacⅠ和BglⅡ酶切后，再将不同的DNA片段连接到含荧光素酶报告基因的pGL2载体中，获得多个重组克隆。采用阳离子脂质体转染法将携带萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒和携带海肾荧光素酶报告基因的对照质粒共转染HepG2细胞，经48h培养，用化学发光法测定细胞裂解液中荧光素酶的活性，以反映ApoAⅠ的表达水平。结果质粒重组获得3个pGL2-ApoAⅠ-L（-2500～＋289bp）长片段质粒和3个pGL2-ApoAⅠ-S（-145～＋289bp）短片段质粒，分别含AA／CC、GG／TT及GG／CC3种基因型。荧光素酶报告基因活性显示：ApoAⅠAA／CC或GG／TT基因型携带者引起荧光素酶相对活性明显低于GG／CC基因型者。结论基因启动子ApoAⅠ-75bp G→A置换和＋83bp C→T置换对ApoAⅠ转录活性起抑制作用，这可能是-75A和＋83T等位基因携带者高密度脂蛋白血浆水平降低的原因。     

干扰素调节因子3 rs2304204野生型及突变型重组质粒的构建及活性分析

目的构建干扰素调节因子3（IRF-3）rs2304204野生型及突变型重组质粒并比较二者启动子活性。为进一步研究IRF-3对HBV感染的影响打下基础。方法以人全血DNA为模板,扩增含rs2304204位点的IRF-3启动子区1355bp目的序列,插入pGL3-Basic载体中,构建rs2304204野生型的重组质粒（wIRF-3）。以wIRF-3为模板,利用基因定点突变试剂盒构建rs2304204突变型重组质粒（mIRF-3）。wIRF．3、mIRF-3和pGL3-Basic质粒分别转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,并计算荧光素酶相对活性单位（RLU）。结果成功构建IRF-3rs2304204野生型及突变型重组质粒,且wIRF-3质粒转染组RLU明显高于mIRF-3质粒转染组（P〈0．005）。结论野生型重组质粒的启动子活性明显高于突变型重组质粒,启动子活性的不同可能进而影响机体抗HBV感染的临床结局。     

阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析

本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料。预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455~ 55bp)、pGL3-417(-417~ 55bp)、pGL3-280(-280~ 55bp)、pGL3-202(-202~ 55bp)、pGL3-81(-81~ 55bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL3-47(-47~ 55bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47~ 55bp区无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81~ 55bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47~ 55bp)和空载体pEGFP-1未见表达。因此-81~-47bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列。     

乙型肝炎病毒X蛋白抑制SFRP5启动子的活性

 目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)抑制分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)启动子活性的分子机制。方法:扩增不同长度的SFRP5启动子区片段，构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic上，并将构建好的重组质粒转染入正常肝细胞系LO2细胞，再分别感染编码HBx的腺病毒（Ad-HBx）或编码绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-GFP），荧光显微镜下观察病毒感染效率，检测萤光素酶活性以观察HBx对SFRP5启动子活性的影响。结果:(1) 含不同长度的SFRP5启动子区截短突变报告质粒构建成功。(2) 截短突变报告质粒的萤光素酶活性与pGL3-Basic对照组相比，分别为(6.32±0.04)倍(-478 bp~+47 bp)、(5.79±0.32)倍(-811 bp~+47 bp)、(3.59±0.34)倍(-1 235 bp~+47 bp)、(3.86±0.39)倍(-1 677 bp~+47 bp)、(3.26±0.42)倍(-2 072 bp~+47 bp) (均P<0.05)。过表达HBx可以明显抑制SFRP5启动子活性，抑制率分别为44%(-478 bp~+47 bp) (P<0.05)、 46%(-811 bp~+47 bp) (P<0.05)、 28%(-1 235 bp~+47 bp)、 24%(-1 677 bp~+47 bp)和40%(-2 072 bp~+47 bp)。结论: HBx可以明显抑制SFRP5启动子区活性，可能导致SFRP5基因表达下调。     

人类XBP1基因5′上游DNA序列的转录激活功能分析

目的分析人类转录因子X-盒结合蛋白1（X-box binding protein Ⅰ，XBP1）基因启动子在不同细胞系中转录活性的差别，研究其转录调控机制。方法在对XBP1基因进行生物信息学分析的基础上，设计6种XBP1启动子缺失突变体，分别包括剧XBP1基因5’上游-1039～66bp、-859～66bp、-623～66bp、-351～66bp，-227—66bp、-227～-45bp，针对每一种缺失突变体构建相应的氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltansferase，CAT）报告基因载体，再分别瞬时转染K562、HepG2、NIH-3T3和LO2细胞，应用报告基因CAT瞬时表达系统，检测XBP1每一种缺失突变体在K562、HepG2、NIH-3T3和LO2 4种不同细胞中的活性差异，并进一步确定脚，基因启动子的具体调节部位。结果成功获得XBP1基因启动子6种缺失突变体的正确克隆和6种相应的报告基因载体p1—XBP1p，p2-XBP1p，p3-XBP1p，p4-XBP1p，p5-XBP1p，p6-XBP1p，每一种报告基因转染K562、HepG2、NIH-313和LO2 4种不同细胞系后，p4-XBP1p和p5-XBP1p在K562、HepG2细胞中的转录活性均高于其它报告载体，p5-XBP1p在HepG2细胞中转录活性最高；而6种报告基因载体在NIH-3T3小鼠成纤维细胞中不具有转录活性。结论。XBP1基因的转录激活能力在不同细胞中有所差异，其表达活性具有一定的细胞类型特异性，与细胞类型和细胞状态密切相关；XBP1基因启动子的-227～66bp区域是该启动子的核心部位，而且核心启动子区包括ATG翻译起始密码子的下游部位，这一部位是转录活性的重要部位，一旦缺失，XBP1基因启动子会丧失活性。     

乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞生长的影响

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis Bvirus Xprotein，HBx）对肝癌细胞恶性程度的影响。方法构建携带HBV。基因真核表达载体pcDNA用Bx，以脂质体介导转染HepG2肝癌细胞，建立可稳定表达HBx的肝癌细胞系HepG2-HBx细胞，同时设空载体pcDNA，转染细胞HepG2-pcDNA，及未转染HepG2细胞为对照组。PCR法扩增Neo基因检测插入的质粒DNA片段．免疫荧光检测HBx的表达。通过生长曲线测定、平板克隆形成实验、MTr比色实验、Hoechst33342核形态学染色观察及流式细胞仪测定．了解稳定转染细胞的生物学行为变化。结果与对照组相比，转染pcDNA√IBx的HepG2-HBx细胞生长速度加快．其倍增时间缩短（28h对32．5h或34h，P〈0．05），克隆形成率增加[（10．12±0．23）％对（5．33±O．19）％或（5．19±0．28）％，P〈0．05]，细胞周期分析显示由GdG，期-S期的进程明显加快。细胞凋亡检测显示HepG2-HB。细胞可抵抗放线菌素D（ActD）诱导的凋亡作用。结论HBx可提高肝癌细胞的增殖活性，并增强肝癌细胞的抗凋亡能力．增加了肝癌细胞的恶性表型。     

重组TRAIL基因真核表达载体的构建及其诱导喉癌细胞株Hep2凋亡的效应

目的: 研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。方法: 利用已有编码凋亡诱导功能区的TRAILcDNA片断的表达载体pRNDE2 -1和IL- 2信号肽基因序列, 扩增IL- 2信号肽基因和TRAIL基因的融合基因, 并克隆入真核表达载体pGL3 181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游, 构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3 181hTERT/TRAIL。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人喉癌细胞株Hep2中, 以台盼蓝拒染法和基因组DNA琼脂糖凝胶电泳, 观察转染的Hep2细胞的凋亡。结果: 构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3 181hTERT/TRAIL, 其表达产物能诱导喉癌细胞Hep2凋亡。结论: 成功地构建了重组真核表达载体pGL3 181hTERT/TRAIL, 为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。     

pGL3-Claudin-1 promoter荧光素酶报告基因质粒的构建及其功能鉴定

背景：Claudin-1是一种多功能蛋白,除了组成紧密连接封闭细胞间隙,它在转录水平的表达失调可能作为一种分子标志反映到恶性肿瘤的侵袭转移和预后中。 目的：构建重组大鼠重组Claudin-1萤光素酶报告基因质粒。 方法：设计和合成包含5’非转录区的约2 000 bp的脱氧核糖核酸链,经过限制性内切酶KpnⅠ和MluⅠ酶切后插入到pGL3-Basic载体中,并用感受态E.coli DH5α和Pmd18-T-simple载体筛选阳性样品。阳性克隆通过测序和PCR证实。实验分为4组：对照组,阳性对照组(pGL3-promoter质粒转染),阴性对照组(转染pGL3-Basic质粒),实验组(转染pGL3-Claudin-1 promoter质粒)。将质粒转染293T细胞检测Claudin-1启动子活性。 结果与结论：重组质粒DNA测序结果采用NCBI blast比对与GenBank(gi|62750811)中大鼠Claudin-1基因启动子序列完全匹配。重组萤光素酶报告基因转录活性检测与pGL3-Basic质粒相比,重组pGL3质粒转录活性明显增强 (P < 0.001)。经过测序和转染结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子质粒构建成功。     

错配修复基因hMLH1启动子萤光素酶报告基因载体的构建与鉴定

 目的：构建含hMLH1启动子片段的萤光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素诱导下的转录活性。方法：以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增hMLH1启动子片段（-1953/+53）,插入萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic,将重组质粒转入HEK293细胞,检测在有和无雌激素诱导下萤光素酶的活性变化。结果：酶切和测序结果证实重组萤光素酶报告基因载体pGL3-Promoter1-luc构建成功。转染pGL3-Promoter1-luc后,雌激素诱导的萤光素酶活性为7.45±0.81,显著高于无水乙醇组的3.28±0.19 (n=3,P<0.001)。结论：hMLH1启动子片段存在与雌激素相关的调控序列。