常染色体显性遗传帕金森病家系1例基因缺失序列分析

目的:分析常染色体显性遗传帕金森病家系的基因缺失.方法:根据Parkin基因外显子和内含子DNA序列合成14对引物,以人基因组DNA为模板,巢式PCR扩增,扩增产物纯化后直接测序.通过与正常人相应的DNA序列比较,检测1例常染色体显性遗传帕金森病家系基因缺失位点.结果:该家系检测到染色体6q25.2-q27Parkin基因外显子3中110 bp的缺失,第4和第5外显子检测到部分碱基的变异.结论:Parkin基因外显子3缺失的检出对常染色体显性遗传帕金森病的早期诊断和基因治疗具有指导意义.     

常染色体显性遗传性听神经病家系全外显子组测序分析

目的：在多年围绕1个常染色体显性遗传性非综合征型听神经病家系开展系统分子遗传学研究的基础上,进一步探讨该家系耳聋的致病机制,以期发现新的听神经病致病基因和突变位点。方法：对3例耳聋患者和1例配偶进行全外显子组测序,初步筛选出与家系耳聋相关的候选致病基因。采用PCR-Sanger测序法,检测上述候选基因变异是否与家系表型共分离。最后,以50例与研究家系无关的听力正常人为对照,检测候选致病突变在正常群体中的突变频率和SNPs遗传多态性。结果：全外显子测序分析得到41个候选致病基因突变;用PCR-Sanger测序法对核心家系的9名成员和2名家系外听力正常人进行验证,仅发现1个基因突变（ALOX15B 7942797 C>T）与家系耳聋表型共分离。选取50例家系外正常对照的DNA样本对ALOX15B基因进行PCR扩增和序列分析,结果显示有2例听力正常人也检测到该基因的同一变异,提示该变异为SNPs遗传多态性。结论：对核心家系成员的全外显子组测序分析和Sanger测序法验证未发现有意义的突变位点,排除了该家系耳聋由基因编码区突变及Indels致病的可能性。     

先天性无虹膜家系致病基因的突变检测

目的 对一常染色体显性遗传的先天性无虹膜( AN)家系进行PAX 6基因突变筛查,以确定其致病基因及致病突变.方法 收集一常染色体显性遗传的AN家系,采集该家系患者、家族健康成员外周静脉血,提取基因组DNA,应用聚合酶链式反应( PCR)方法扩增PAX 6 基因exon 4 ~exon 13共11个外显子以及外显子-内含子拼接部,将纯化后的PCR扩增产物直接测序,运用DNAStar软件(综合性序列分析软件)对测序结果进行序列分析,检测PAX 6基因的突变类型,并与80名随机抽取的与该家系无血缘关系的健康人PAX 6基因序列进行比对. 结果 该家系患者PAX 6 基因exon 11存在一个杂合突变c. 949 C>T(P. R 317 X),导致第317位精氨酸的密码子CGA被终止密码子UGA替代,造成编码PAX 6蛋白的过早终止,而该家系其他健康成员及80名与该家系无血缘关系的健康对照组成员均未检测到该突变. 结论 PAX 6基因c. 949 C>T( P. R 317 X)突变导致PAX 6蛋白提前编码终止是该常染色体显性遗传先天性无虹膜家系的致病原因.     

常染色体隐性遗传早发型帕金森病家系的DJ-1基因研究

目的：探讨DJ-1基因与中国人常染色体隐性遗传早发型帕金森病（AREP）家系的关系.方法：对3个AREP家系的6位患者和23位成员进行系统的临床检查并进行DJ-1基因PCR扩增,标本进行基因测序.结果：所有研究对象的DJ-1基因外显子均扩增成功.3个家系中6位患者的DJ-1基因所有外显子测序均未发现突变.结论：DJ-1基因突变在中国人AREP家系中发生率较低,不是常见致病因素.     

华人遗传性混合息肉病综合征BMPR1A基因种系突变检测

[目的]探讨遗传性混合息肉病综合征华人家系中BMPR1A基因是否存在种系突变.[方法]34个家系成员外周血提取基因组DNA,利用聚合酶链式反应分别扩增BMPR1A基因全部外显子,进行DNA测序与突变分析,对突变外显子PCR扩增产物作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定.[结果]家系12和2所有发病成员BMPR1A基因2号外显子位于codon23处缺失11个碱基(AAAGTCAGAAA),同时2号外显子PCR扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳也发现异常迁移条带,而家系中正常成员的检测未发现这一突变.[结论]两华人HMPS家系中BMPR1A基因缺失突变与疾病共遗传,该基因极可能是HMPS华人家系的致病基因.     

X染色体连锁显性遗传先天性眼球震颤家系的致病基因突变研究

目的对4个X染色体连锁显性遗传先天性眼球震颤(XL-CIN)家系进行候选致病基因FRMD7突变筛查。方法采集家系成员外周血5 ml,提取基因组DNA;以4个家系的先证者基因组DNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增FRMD7基因的全部外显子及其外显子-内含子拼接部的序列,DNA直接测序筛查突变位点;一旦发现突变致病性位点,则采用DNA双向测序方法在其他家系成员进行疾病与致病突变共分离分析,以及进一步确认突变,将患者的FRMD7基因外显子8和10的扩增产物克隆至TA克隆载体测序。结果 4个XL-CIN家系皆为X染色体连锁显性遗传伴外显不全,其中2个家系携带FRMD7基因已知致病性突变:XL-CIN 02家系存在c.G886C/GGT>CGT(p.G296R)错义突变,位于FRMD7基因外显子8;XL-CIN 03家系存在c.C910T/CGA>TGA(p.R304X)无义突变,位于外显子10。结论 FRMD7 G296R和R304X是导致XL-CIN 02和XL-CIN 03家系致病的主要原因。     

华人遗传性混合息肉病综合征BMPR1A基因种系突变检测

【目的】探讨遗传性混合息肉病综合征华人家系中BMPR1A基因是否存在种系突变。【方法】34个家系成员外周血提取基因组DNA，利用聚合酶链式反应分别扩增BMPR1A基因全部外显子，进行DNA测序与突变分析，对突变外显子PCR扩增产物作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。【结果】家系12和2所有发病成员BMPR1A基因2号外显子位于codon23处缺失11个碱基(AAAGTCAGAAA)，同时2号外显子PCR扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳也发现异常迁移条带，而家系中正常成员的检测未发现这一突变。【结论】两华人HMPS家系中BMPR1A基因缺失突变与疾病共遗传，该基因极可能是HMPS华人家系的致病基因。     

3个遗传性对称性色素异常症家系中DSRAD基因的突变

目的:检测国内3个遗传性对称性色素异常症家系中DSRAD基因的突变.方法:PCR扩增3个家系中成员DSRAD基因的全部外显子,并行DNA测序.以100例无关正常人作对照.结果:PCR结合DNA测序发现3个家系中患者均存在DSRAD基因的异常:家系A中第3220位碱基发生了C→T的杂合突变,对应1074位的精氨酸被半胱氨酸替代;家系B与家系C中发现的突变相同,为第3325位碱基发生了G→T的杂合突变,对应1109位的天冬氨酸被酪氨酸替代.家系中未患病者及无关正常人未发现相应突变.结论:此3个遗传性对称性色素异常症家系中存在DSRAD基因的特异性突变,突变可能使蛋白功能缺陷,导致临床上出现皮肤色素异常.     

伴听觉症状的家族性颞叶外侧癫痫的临床特点及LGI1基因突变检测

目的 研究伴听觉症状的常染色体显性遗传颞叶外侧癫痫(ADLTE)一家系相关基因富亮氨酸胶质瘤失活基因1(LGll)的突变,探讨该综合征的临床特征及基因基础.方法 对该家系进行详细的病史询问和遗传学调查,采集患者和家属血液,按受累同胞对配对法对LGIl基因的8个外显子分别设计引物,用聚合酶链反应(PCR)结合DNA测序,检测该家系中有无LGIl基因外显子突变.结果 家系中所有患者符合国际抗癫痫联盟2001年新癫痫综合征标准中ADLTE典型表现,头颅MRI正常,PCR结合DNA序列分析LGIl基因8个外显子未发现突变.结论 该家系临床表现与ADLTE相同,但其发病不是由已知的LGIl基因外显子突变所致.     

杂合子导致CADASIL病患者家系NOTCH3基因突变

目的 研究一伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）患者家系NOTCH3基因突变,探讨突变分析方法在遗传性CADASIL疾病筛查和诊断中的应用。方法 收集该家系8位成员（5例患者,3例正常个体）外周血标本,提取基因组DNA。采用PCR扩增NOTCH3基因突变热点区域,DNA直接测序检测扩增产物,寻找该家系致病的突变基因。结果 NOTCH3基因第4外显子内存在一杂合的错义突变（c.421C＞T）,导致141位精氨酸（Arg）被半胱氨酸（Cys）替代。该家系中患者均携带该突变基因,而家系中正常个体未发现此突变基因。结论 杂合的错义突变（c.421C＞T）与该CADASIL家系中患者表型共分离,为引起该家系的致病基因突变。     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。