霍乱毒素B亚单位的研究进展

现代生物技术的飞速发展 ,使传统的疫苗生产方式发生了根本的变化 ,疫苗研究领域变得异常活跃 ,人们越来越重视多肽衍生疫苗及疫苗佐剂的发展 ,融合蛋白作为外源抗原决定簇载体的研究也方兴未艾。将相关抗原融合到合适的载体蛋白上具有毒性小、表达和纯化相对容易的特点 ,同时可将融合的多肽以确定的构型引入免疫系统之中。霍乱毒素B亚单位 (CTB)因其独特的生理功能 ,近年来已成为国内国外研究的热点 ,将它作为载体蛋白和免疫佐剂产生了很多新的免疫疫苗。1　霍乱毒素、霍乱毒素B亚单位霍乱毒素 (choleratoxin ,CT)由两个亚单位组成 ,即…     

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。     

用含霍乱毒素A2/B的载体在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原P30

目的：克隆并表达含有弓形虫P30抗原及霍乱毒素A2／B亚基基因的原核表达载体，为弓形虫疫苗的研究奠定基础。方法：应用PCR方法扩增出P30基因片段后，克隆入含有霍乱毒素A2／B亚基基因的表达质粒pUAB024，在大肠杆菌JM109(DE3)中表达融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳及Western blotting进行检测鉴定。结果：电泳证明质粒构建正确，SDS-PAGE显示经IPTG诱导可以产生特异性条带，Western blotting进一步证实该条带为P30-CTA2／B融合蛋白。结论：表达载体pUAB024-P30可有效表达特异性的融合弓形虫抗原蛋白P30-CTA2B。     

激素抵抗型哮喘中糖皮质激素受体β亚单位的表达

支气管哮喘的本质是气道慢性炎症，糖皮质激素是目前临床上治疗哮喘的首选药物。但部分哮喘患者对激素治疗不敏感，称为糖皮质激素抵抗型哮喘。近年来，大量证据表明激素抵抗型哮喘与糖皮质激素受体结构和功能的改变有关。尤其是受体β亚单位的异常表达成为研究的热点。为进一步探讨激素抵抗型哮喘的发病机制，现将糖皮质激素受体β亚单位的表达在激素抵抗型哮喘中的意义作一综述。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

目的 通过对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hipylori)尿素酶B亚单位在大肠杆菌中表达的研究，探索其免疫反应性。方法 用高保真PCR方法扩增H.pylori ureB基因，并定向克隆人pNEB193中，然后经酶切回收后插入原核表达载体pMAL-C2X进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果 特异PCR和酶切鉴定证实融合基因ureB克隆人表达载体，SDS-PAGE结果显示ureB在大肠杆菌中以融合蛋白形式MBP-ureB高效表达，约占细胞总蛋白量的26.7%。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清发生特异反应。结论 成功构建了高效表达H.pylori ureB的重组菌，为Hp基因工程疫苗的进一步研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位的编码基因(ureB)的克隆和序列分析，为H．pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法应用PCR方法获得国内分离H．pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H．pylori的ureB基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到1．71kb的ureB基因片段，特异PCR可扩增出ureB基因片段，证实H．pylori ureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离H．pylori MEL-HP27的ureB基因全长1710bp( Genbank收录号：AY295085)，编码由569个氨基酸残基组成的肽链，ureB基因序列与GenBank公布的H．pylori相应基因同源性高达96．08％～98．30％，氨基酸序列同源性在98．77％．99．82％之间。结论 成功克隆了MEL-HP27菌株的ureB基因，其核苷酸序列与国际参考株NCTC11637的同源性为97．67％。     

产志贺毒素大肠杆菌O138 stx2e基因的克隆与序列分析

目的构建产志贺毒素大肠杆菌O138stx2e基因重组质粒,并比较不同型Stx之间的区别。方法根据GenBank发表的stx2e序列设计了一对特异性引物,用PCR的方法扩增从临床分离到的产志贺毒素大肠杆菌O138的stx2e基因,将其克隆到pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切和PCR鉴定,而后进行测序。并利用DNASIS序列分析软件对GenBank报道的O22菌株和噬菌体P27的stx2e和O138菌株的stx2e基因序列进行了比较分析,并对O138的stx2e氨基酸残基序列与stx1、stx2和O22菌株stx2e序列进行比较。结果所克隆的O138的stx2e与O22菌株和噬菌体P27的stx2e在碱基序列上同源性达到996%,O138的Stx2e与O22的Stx2e在氨基酸水平上其序列完全相同。Stx2e与stx2的同源性在85%以上,而stx2e与stx1的同源性只有42%左右。结论克隆了stx2e基因,为研究stx2e的结构和功能奠定了基础。     

大肠杆菌O157VT2 B亚基基因的克隆与表达

目的对大肠杆菌O157VT2毒素B亚基基因进行克隆、表达与鉴定,为VT2毒素的抗原、抗体大规模制备及疾病的预防、诊断和疫苗研究打下基础。方法设计寡核苷酸引物,利用PCR技术从出血性大肠杆菌O157的染色体基因组中扩增出VT2毒素B亚基基因,连接到表达载体pET-28a以构建重组质粒。将重组质粒转入表达宿主菌BL21感受态细胞,通过IPTG诱导进行表达,对表达蛋白进行SDSPAGE电泳分析和Western检测。结果用PCR方法扩增出了预期大小的VT2B亚基基因,克隆得到重组质粒pET28aVT2B,转化后宿主菌成功表达分子量为8kD的目的蛋白,用特异抗体经Western检测该条带为阳性反应。结论目的基因成功克隆到宿主菌内,目的蛋白得到高效表达,最佳诱导时间为4h,目的蛋白表达量可达总蛋白量45.72%。     

肝性脑病大鼠GABA-A受体亚单位mRNA的表达

本研究采用原位杂交方法探讨肝性脑病模型大鼠GABA-A受体亚单位α1、β1、γ2的mRNA在各脑区的表达，以期从更深的层面探讨肝性脑病的发生机制。     

端粒酶催化亚单位在原发性肝癌中表达的临床意义

用端粒酶催化亚单位(hTRT)原位杂交检测，探讨hTRT作为原发性肝癌早期诊断、估计预后指标的可能。     

通用引物检测志贺毒素和紧密素多个基因亚型

目的旨在建立同时检测stx2和intimin两个基因多个变型的双重PCR快速检测技术,更好满足实验室和临床检测的需求。方法以stx2主要的6个亚型和intimin主要的27个基因亚型为靶序列,设计引物,建立双重PCR方法,分析其敏感性、特异性,并检测模拟制备的阳性样品。结果stx2-intimin双重PCR扩增片段分别为388bp和609bp,检测大肠杆菌纯培养物最低限介于10～100cFu／mL,增菌样品最低检测限介于1～10CFU／g,特异性检测intimin和stx2的多个亚型。结论Stx2-Intimin二重PCR技术灵敏、特异、通用和高效。     

Recombinant hybrid protein, Shiga toxin and granulocyte macrophage colony stimulating factor effectively induce apoptosis of colon cancer cells

AIM: To investigate the selective cytotoxic effect of constructed hybrid protein on cells expressing granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor. METHODS: HepG2 (human hepatoma) and LS174T (colon carcinoma) were used in this study. The fused gene was induced with 0.02% of arabinose for 4 h and the expressed protein was detected by Western blotting. The chimeric protein expressed in E.coli was checked for its cytotoxic activity on these cells and apoptosis was measured by comet assay and nuclear staining. RESULTS: The chimeric protein was found to be cytotoxic to the colon cancer cell line expressing GM-CSFRs, but not to HepG2 lacking these receptors. Maximum activity was observed at the concentration of 40 ng/mL after 24 h incubation. The IC50 was 20±3.5 ng/mL. CONCLUSION: Selective cytotoxic effect of the hybrid protein on the colon cancer cell line expressing GM-CSF receptors (GM-CSFRs) receptor and apoptosis can be observed in this cell line. The hybrid protein can be considered as a therapeutic agent.     

小鼠巨噬细胞Ipr1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠Ipr1(intracellular pathogen resistance 1)基因真核表达载体。方法从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pMD19-Tsimple载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复后将Ipr1基因亚克隆于原核真核双系统表达质粒pQE-TriSystem中得到pQE-TriSystem-Ipr1,用脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,RT-PCR鉴定Ipr1基因的表达。结果从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组质粒pQE-TriSystem-Ipr1,转染RAW264.7细胞经RT-PCR扩增出Ipr1基因相应大小的DNA片段。结论成功调取小鼠Ipr1基因并成功构建含Ipr1基因的真核表达载体,为进一步研究Ipr1基因的功能奠定基础。     

HBV A83点变异真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

研究A83点突变的生物学意义。采用分子生物学方法，设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增乙型肝炎病毒（HBV）ayw亚型的PcP10标准株中的Pre-C/C片段（1814-2452），经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后，在T4DNA连接酶的作用下连于EB病毒真核表达载体。利用定点突变技术对连接载体进行1896点的定点诱变，经错配PCR-RFLP和测序分析。确定突变的克隆，提取突变前后的质粒转染HepG2细胞。突变后在Pre-1C/C第28位氨基酸形成终止密码。HBVA83点突变真核表达载体的构建为体外研究该点突变对HBeAg表达的影响以及HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染的致病机理奠定基础。     

不同启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体构建

目的分别构建CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子驱动反式丁型肝炎病毒核酶（HDV核酶）的逆转录病毒表达载体。在这些载体中,HDV核酶设计为靶向HBV基因序列PreS2和C区。方法用PCR技术分别扩增CMV、U2和U3启动子,并连入pMD18-T载体。合成靶向PreS2和C区HDV核酶并利用SalⅠ和H indⅢ的酶切位点分别连入逆转录病毒表达载体pLEGFP（pLEGFP-R z）。然后利用BamHⅠ和SalⅠ的酶切位点分别把CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子连入重组载体pLEGFP-R z。所有的重组载体经PCR和酶切的方法验证。结果成功地构建了分别含有6种启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体。结论这些重组载体的构建为筛选高效表达核酶的启动子奠定基础。同时这些重组载体也可用于进一步研究HDV核酶抑制HBV复制的效率。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7Ⅱ型志贺毒素的纯化及功能鉴定

目的 亲和层析纯化肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7Ⅱ型志贺毒素,并鉴定其生物学功能.方法 用抗-Ⅱ型志贺毒素分子A亚单位的抗体S1D8耦联至柱填料Sepharose 4B,制备亲和层析柱.纯化EHEC O157:H7菌体分泌的毒素分子,分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和Western印迹法鉴定毒素分子纯度和特异度,将纯化毒素倍比稀释,观察其对Vero细胞和小鼠的毒性作用,计算其对细胞半数致死量(CD50)和对小鼠的全数致死量(LD100);观察抗毒素血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用.结果 通过亲和层析从EHEC O157:H7培养物中成功纯化Ⅱ型志贺毒素.SDS-PAGE显示,其A、B亚单位的相对分子质量分别为32 000和7 500,纯化的毒素分子可分别与Ⅱ型志贺毒素A、B亚单位特异性的单抗结合;对Vero细胞和小鼠均存在致死作用,其CD50和LD100分别为20 ng/L和5 ng,小鼠体内抗毒素血清对毒素可有效中和.结论 成功纯化Ⅱ型志贺毒素,并证实其在细胞和动物模型中的毒性作用.