胸腺素α1二聚体蛋白的克隆、表达、纯化及其生物学活性检测

目的：获得具有生物学活性的重组人胸腺素α1二聚体蛋白.方法：人工合成胸腺素α1二聚体基因,并将该基因克隆入原核表达载体pET-22b（＋）中.转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达重组Tα1②蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析以及生物学活性检测.结果：Tα1②Mr约为6.3×10^3,与理论值一致.成功纯化了Tα1②蛋白,该蛋白具有与T1抗体特异性的结合能力并能刺激小鼠T淋巴细胞增殖.结论：成功地克隆、表达和纯化Tα1②蛋白;重组Tα1②具有与化学合成Tα1相同的功能并有更高的生物学活性.     

重组胸腺素α1的克隆、表达与纯化

目的利用基因工程方法表达重组胸腺素α1 (Tα1),并进行纯化、鉴定. 方法使用大肠杆菌偏爱密码子,人工合成Ref蛋白(T7噬菌体蛋白)和Tα1的融合基因,并克隆在表达载体pBV220中,转化E.coliDH5α,温度诱导表达,表达的重组蛋白Ref- Tα1经CM-Sepharose FF阳离子柱进行纯化,Western-blot进行鉴定. 结果获得了纯化的重组蛋白Ref-Tα1,相对分子质量约为15 000. 结论用融合基因的方法表达小分子多肽是一种可行的方法,Ref- Tα1的成功表达为进一步研究其生物学活性奠定了基础.     

重组胸腺素α1的分离纯化和活性测定

目的：利用融合表达载体pThioHisA的重组质粒pThioHisA-Tα1④,转化大肠杆菌TOP10得到的工程菌,来分离纯化表达的胸腺素α1（thymosin alpha1,Tα1),方法将高效表达融合蛋白的工程菌用菌胞破碎器裂解,经80℃热处理,离心上清采用Q－SepharoseFF阴离子交换色色谱纯化Tα1单体,应用SDS－PAGE,2L－Tricine-SDS-PAGE和HPLC进行鉴定。结果SDS－PAGE分析表明菌体表达的融合蛋白牛菌体总蛋白的400g.kg^-1,经2L－Tricine-SDS-PAGE分析证实,融合蛋白可裂解出Tα1单体,裂解物经简单的离子色谱可以纯化出Tα1单体,HPLC鉴定纯化的Tα1纯度可达950g.kg^-1以上,利用^3H-TdR进行的生物活性测定表明,在致有丝分裂原ConA存在的条件下,融合蛋白和Tα1单体均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力,与化学合成的Tα1相比具有相似的生活性。结论该方法是分离纯化Tα1简便易行,经济有效的方法,同时也为Tα1的分离纯化和大规模的开发生产奠定了基础。     

胸腺素α1基因串联体的构建

0 引言胸腺素α1(Thymosin alpha 1, Tα1)是从胸腺素组分5(TF5)中分离纯化出的热稳定酸性多肽[1],由28个氨基酸组成,Mr为3108. 它是一种具有多种生物学活性的免疫调节剂,已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症和免疫缺陷的研究中. 虽然胸腺素α1有着广泛的应用前景,但由于其基因过短,很难利用基因工程方法实现直接表达,所以目前多是化学合成产品[2],价格比较昂贵,应用的推广受到限制. 为了探索胸腺素α1多聚体的可能的生物学活性及其基因的体外表达,我们利用随机退火与PCR技术相结合的方法构建了胸腺素α1的多串体基因,并成功克隆,从而为进一步研究奠定了基础.     

人胸腺素α1原核表达重组体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：以基因工程方法获得人胸腺素α1（Tα1）多肽产品。方法：通过PCR扩增人工合成模板的方法获得人Tα1基因，然后将其克隆入原核细胞表达载体pGEMEX1，用重组体转化大肠杆菌，并从mRNA和蛋白质水平检测重组体在大肠杆菌中的表达情况。结果：构建人Tα1克隆重组体pUC18-Tα1，经序列分析证实对码、序列无误；成功构建了人Tα1原核细胞表达重组体pGEMEX1-Tα1;从mRNA水平证实pGEMEX1-Tα1在大肠杆菌JM109（DE3）中能够转录；转化大肠杆菌JM109（DE3），经IPTG诱导，能产生-36kD左右的融合蛋白。结论：构建成功重组体pGEMEX1-Tα1，并在大肠杆菌中得以表达。     

胸腺素A1基因串联体的构建

0　引言　胸腺素 α1(Thymosin alpha1,Tα1)是从胸腺素组分 5 (TF5 )中分离纯化出的热稳定酸性多肽 [1 ] ,由 2 8个氨基酸组成 ,Mr为 310 8.它是一种具有多种生物学活性的免疫调节剂 ,已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症和免疫缺陷的研究中 .虽然胸腺素 α1有着广泛的应用前景 ,但由于其基因过短 ,很难利用基因工程方法实现直接表达 ,所以目前多是化学合成产品 [2 ] ,价格比较昂贵 ,应用的推广受到限制 .为了探索胸腺素α1多聚体的可能的生物学活性及其基因的体外表达 ,我们利用随机退火与 PCR技术相结合的方法构建了胸腺素α1的多串体基因 …     

人FLT3配体的克隆、表达与纯化

目的 克隆人FLT3配体（Flt3Ligand,FL)基因，并在大肠杆菌中对FL进行表达、纯化。方法 分离人外周血单个核细胞，提取总RNA，采用R T－巢式PCR扩增人FLT3配体胞外段基因，以双脱氧终止法进行DNA序列分析；将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-B;处重组质粒pRSET-B-FL转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导后，收集细菌、菌体裂解后，利用常压离子交换色谱的方法对表达蛋白进行纯化，并进行SDS－PAGE及Westernblot检测。结果 从人外周血单个核细胞中克隆得到长462bp的FL基因，测序正确；经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定证实，FL成功地克隆到表达载体pRSET-B;构建的表达载体pRSET-B-FL在大肠杆菌中表达出Mr24000的融合蛋白，经常压离子交换色谱化后的融合蛋白的纯度达到90％，该融合蛋白具有FL抗原特性。结论 成功地克隆并表达了FL基因，并对融合蛋白进行了初步纯化 ，为大规模获得FL创造了条件。     

重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测

目的：利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素β4（Tβ4）并对其进行纯化和鉴定．方法：使用大肠杆菌偏爱密码子合成人Tβ4全长基因，构建了Tβ4的二串联体基因（Tβ4②），将其克隆入表达载体pET-22b（＋）中，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，IPTG诱导表达后，经盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白，采用免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对重组蛋白进行鉴定．结果：获得了纯化的重组Tβ4②蛋白，并具有生物学活性．结论：成功构建、表达和纯化了Tβ4②，为其功能研究奠定基础．     

重组胸腺素α1 pMAL-C2x- Tα1/TB1工程菌的构建与表达

目的构建表达重组胸腺素α1(Tα1)的pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL-C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白(MBP-Tα1),采用Westernblot对MBP-Tα1进行鉴定。结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP-Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6%,分子量约为45×103。结论工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌Tipα重组蛋白的表达?纯化及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌(H.polyri,HP)的Tipα基因,构建含有Tipα的重组载体,在大肠杆菌表达并纯化以获得Tipα蛋白。方法:从HP的26695菌株扩增位于HP0596的Tipα基因,将Tipα基因与pET28a载体(His标签)同时经BamHI和XhoI酶切、纯化及连接后,构建含有Tipα的重组载体pET28a-Tipα,重组载体转化至大肠杆菌并表达,表达产物以Ni-NTA亲和层析纯化,Western blot进一步鉴定。结果:克隆Tipα基因,经测序证实与Genbank对比,二者同源性为100%。大肠杆菌表达产物,纯化后SDS-PAGE显示相对分子量为23 ku。Western blot证实纯化产物与抗Tipα抗体特异性结合。结论:成功克隆并表达出HP的Tipα蛋白,为进一步研究Tipα的功能奠定基础。     

胸腺素α1临床应用进展

胸腺素α1(Tα1)是由28个氨基酸组成的高活性人工合成的小分子多肽,纯度极高,是一种生物反应调节物,具有双向免疫调节机制,在机体内发挥着多种生物活性作用.现综述其在临床的应用进展.     

人α1胸腺素基因克隆及表达载体的构建

目的：为人α1胸腺素基因的蛋白质表达奠定基础。方法：用Trizol法提取人α1胸腺素RNA反转录成CD17NA,以已知胸腺素基因为模板,在编码区上游和下游分别设计合成一对含有EcoRI和BamHI酶切位点的寡聚核甘引物扩增Tα1克隆到PUC19载体中,双酶切后回收连接到表达大肠杆菌DH25中表达。以碱裂解法提取重组质粒双脱氧链法序列测定。结果：成功构建了Tα1克隆重组体PUC19-Tα1,经序列分析证实对码序列无误。结论：Tα1在DH25中表达成功。     

重组人TGF-β1融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的: 构建人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的原核表达载体,表达并纯化GST-hTGFβ1. 方法: 应用RT-PCR获得人TGF-β1的基因片段,成功构建人TGF-β1原核表达载体,诱导表达人TGF-β1与GST的融合蛋白;应用亲和层析法纯化重组融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析. 结果: 成功构建了人TGF-β1重组融合表达质粒pGEX-4T-1-TGF-β1, 表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约为39×103处出现了一条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TGF-β1抗体特异性的结合能力. 结论: 成功构建了人TGF-β1基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物,为下一步的人TGF-β1自体疫苗的研制奠定了基础.     

人源胸腺素α原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达

目的克隆人胸腺素α原/白介素2融合基因,构建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达。方法采用RT-PCR方法,从人白血病细胞和人T淋巴细胞中分别扩增得到胸腺素α原/白介素2基因,利用基因重组技术将融合基因片段重组于pET42a原核表达载体上,构建成pET42a-PI。经酶切、测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导蛋白表达。表达产物经离子交换和分子筛纯化后进行Western blot分析,通过人外周血单核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行了初步的活性测定。结果凝胶电泳显示PCR产物的长度约750 bp,测序结果表明,扩增片段与预期序列一致。重组菌在IPTG诱导下表达相对分子质量为28 kDa的蛋白,纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率,表明具有一定活性。结论成功克隆和构建了人胸腺素α原/白介素2融合基因的原核表达载体,并在原核表达系统中得到有效表达。     

hUNC93-B1基因的克隆、表达纯化及抗体制备

目的:构建人hUNC93-B1基因的原核表达载体,诱导其表达并纯化该蛋白,制备特异性高效价抗体. 方法:设计针对hUNC93-B1基因的特异性引物,通过PCR的方法扩增目的基因,克隆入pMD-18T载体,测序全部正确后亚克隆入原核表达载体pRSET-A. 将构建的载体导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达. 经SDS-PAGE电泳鉴定后用镍柱纯化融合蛋白. 与免疫佐剂联用,免疫家兔制备特异性抗体. 结果:PCR扩增得到长度为1808 bp的片断,结果与GenBank中人hUNC93-B1的基因序列完全一致,成功构建了原核表达载体hUNC93-B1-pRSET-A. 导入大肠杆菌后经诱导得到一条约Mr 72 000的新蛋白条带. 免疫家兔后获得了1:64 000的高效价特异性抗人hUNC93-B1血清. 结论:成功地克隆了人hUNC93-B1基因,使其编码的蛋白质在原核细胞中顺利表达,并纯化出该种蛋白. 制备了特异性抗体,为研究hUNC93-B1基因与人类心血管疾病的关系提供依据.     

一种新的胸腺素α原cDNA

我们克隆了有中国人特征的胸腺素α原全长ｃＤＮＡ,并进行测度分析。方法从健康中心人ＰＢＭＣＰｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ中采用ＲＴ－ＰＣＲ法克隆ｈｕＰＴＭＡαｃＤＮＡ,酶切鉴定,序列分析,结果经测序后发现该基因是一个国外的高加索人种胸腺素α原有８６．４％,同源性的新基因。结论从中国人中新发现了一个ｈｕＰＴＭＡα基因,并于日前被美国ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ ｏｆ ｂＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹｉＮ     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

重组人PD-1IgV融合蛋白的克隆、表达、纯化及生物学活性检测

目的:获得具有生物学活性的重组人PD-1IgV(rhPD-1IgV)蛋白.方法:人工合成PD-1IgV基因,并将该基因克隆入原核表达载体pQE-30中.转化宿主细胞大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达重组融合rhPD-1IgV蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:rhPD-1IgV的Mr约为15×103,与根据其氨基酸组成计算的理论值一致.成功纯化了rhPD-1IgV蛋白,并对其进行了复性和浓缩,且复性后的蛋白可与其配体B7-H1结合,显示出良好的结合活性.结论:成功地克隆、表达和纯化了rhPD-1IgV蛋白.     

α-OGG1与ACO2蛋白的表达纯化及其相互作用鉴定

[目的]原核表达纯化获得可溶性α-OGG1,ACO2蛋白并初步鉴定其相互作用.[方法]将α-OGG1,ACO2基因构建到pGEX-4T-2-TEV和pET-28a-TEV表达载体上,转化至BL21(DE3)大肠杆菌.IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni柱和GST柱亲和层析法纯化目标融合蛋白;采用SDS-PAGE检测表达产物;采用GST-Pulldown方法鉴定蛋白与蛋白的相互作用;采用双质粒共转化,表达纯化α-OGG1,ACO2蛋白复合体.[结果]成功克隆并构建了α-OGG1及其N-半段、C-半段基因和ACO2基因的原核表达载体,并转化至大肠杆菌表达.通过Ni柱和GST柱亲和层析法得到可溶性表达的6×His_α-OGG1(1-326)和GST_ACO2(29-780)蛋白,SDS-PAGE检测结果表明2个蛋白条带均与理论大小相符.GSTPulldown实验结果证实α-OGG1与ACO2直接相互作用.通过共转化、表达纯化得到了α-OGG1与ACO2的复合物.[结论]采用原核表达和亲和层析纯化得到了可溶性6×His_α-OGG1,GST_ACO2融合蛋白及两者的复合体,并初步证实α-OGG1与ACO2存在直接相互作用.