缺氧时三氧化二砷对人肝癌细胞株BEL-7402生长及凋亡的影响及机制

目的:探讨不同浓度三氧化二砷(As_2O_3)对人肝癌细胞株BEL-7402生长及凋亡的影响及机制.方法:应用化学缺氧剂二氯化钴(CoCl_2)诱导人肝癌细胞BEL-7402缺氧.不同浓度As_2O_3对BEL-7402进行干预后,应用MTT法测定缺氧条件下的生长抑制作用:应用电镜,激光共聚焦显微镜及流式细胞术观察其对细胞凋亡的影响;应用逆转录聚合酶链式反应检测缺氧诱导因子HIF-1α,耐药基因mdrl的表达水平.结果:As_2O_3具有抑制人肝癌细胞株BEL-7402缺氧条件下生长的作用,并呈剂量-效应依赖性;4.0μmol/L AS_2O_3干预48h后,缺氧条件下的细胞呈现典型的凋亡形态学特征;缺氧时,0.5-4.0μmol/L As_2O_3下调HIF-1α,mdrl基因表达水平,其中4.0μmol/L AS_2O_3组作用最强,基因相对表达量分别为HIF-1α0.60±0.07,mdrl 0.59±0.09.各剂量组As_2O_3作用后与缺氧对照组比较差异有显著性(P<0.01).结论:不同浓度的As_2O_3在由CoCl_2诱导的化学缺氧奈件下能够抑制人肝癌细胞BEL-7402的生长及诱导凋亡,其机制可能与As_2O3下调HIF-1α、mdrl的基因表达水平有关.     

三氧化二砷诱导小细胞肺癌细胞凋亡及p53、bcl-2基因表达的研究

目的：研究三氧化二砷（As2O3）诱导小细胞肺癌细胞凋亡及其机制。方法：采用末端脱氧核苷酰转移（TUNEL）法检测细胞凋亡，免疫组织化学（SABC）法分析As2O3对小细胞肺癌细胞（NeI-H细胞）p53、bcl-2基因蛋白表达的影响。结果：As2O30.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L作用72h，NeI-H细胞均可呈现凋亡所特有的亚G1峰，凋亡比率随药物作用浓度增加和作用时间延长而增高。实验组p53基因蛋白表达较对照组明显增多，药物浓度越高表达越多（P=0.001）；bcl-2基因蛋白表达较对照组明显减少，药物作用浓度越高表达越少（P=0.001）。结论：As2O3抗肿瘤作用主要是通过诱导细胞凋亡实现的，其机制与上调p53基因表达及下调bcl-2基因表达有密切关系。     

亚砷酸诱导人食管癌细胞株EC109细胞p15INK4B基因的表达

目的：研究亚砷酸(As_2O_3)对人食管癌EC109细胞株细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p15~(INK4B)(p15)基因表达的影响．方法：终浓度2μmol/L的As_2O_3加入食管癌EC109细胞系,采用甲基化特异PCR(MSP)检测食管癌EC109细胞系中p15基因甲基化,采用RT-PCR和Western blot方法检测As_2O_3处理前后p15的mRNA和蛋白质水平的表达情况．用Scion Image软件测量条带灰度值,P15蛋白与ACTB条带的灰度比进行半定量分析．结果：EC109细胞p15基因发生高甲基化,p15基因不表达．As_2O_3作用后p15基因甲基化程度明显下降,As_2O_3作用72,48,24 h组和未加药组之间差异均有统计学意义(37．11±3．62,50．92±5．47,72．07±7．53 vs 97．23±9．80,P＜0．05)．As_2O_3作用24 h后出现p15 mRNA表达,随As_2O_3作用时间延p15 mRNA表达逐渐增强,各个时间组之间比较,除了未加药组和加药24 h组之间及加药24 h组和加药48 h组之间差异无统计学意义外,其余各个时间组之间差异有统计学意义(0．72±0．07 vs 0．58±0．06 vs 0．48±0．07 vs 0．41±0．08,P＜0．05)．As_2O_3作用24 h后P15蛋白出现表达,2μmol/L作用24-72 h中P15蛋白条带灰度逐渐增强,As_2O_3作用72,48,24 h组和未加药组之间差异均有统计学意义(0．51±0．02 vs 0．21±0．01 vs 0．16±0．02 vs 0．06±0．01,P＜0．05),说明其表达随As_2O_3作用时间延长而逐渐增强．结论：As_2O_3可使食管癌EC109细胞p15基因去甲基化,使p15基因表达上调,从而抑制细胞周期进程．     

葛根素调控p38信号通路对H_2O_2诱导心肌细胞凋亡的影响

目的探讨葛根素调控p38信号通路对H_2O_2诱导心肌细胞凋亡的影响。方法葛根素处理大鼠H9c2心肌细胞,分为对照组(细胞无特殊处理)、H_2O_2组(200μmol/L H_2O_2干预细胞)和葛根素+H_2O_2组(250μmol/L葛根素和200μmol/L H_2O_2干预细胞),SB203580作为p38信号通路抑制剂,各组细胞处理24 h,通过流式细胞仪检测各组凋亡率;Western印迹检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(酶切caspase3)、p53、p-p38的蛋白表达。结果与对照组比较,H_2O_2组细胞凋亡率显著升高,酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表达均显著升高(P0.05);与H_2O_2组比较,葛根素+H_2O_2组凋亡率显著降低,酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表达均显著降低(P0.05);与葛根素+H_2O_2组比较,葛根素+H_2O_2+SB203580组细胞凋亡率显著降低,酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表达均显著降低(P0.05)。结论葛根素可通过抑制p38信号通路及下调酶切caspase3和p53表达降低H_2O_2诱导的心肌细胞凋亡。     

三氧化二砷联合白藜芦醇对肺癌细胞侵袭、迁移的影响及机制

目的探索三氧化二砷(As_2O_3)联合白藜芦醇对肺癌细胞A549侵袭、迁移的影响及可能作用机制。方法采用不同浓度白藜芦醇(15、30、60、120μmol/L)作用于体外培养的A549细胞中,四甲基偶氮唑盐(MTT)实验检测细胞增殖。60μmol/L白藜芦醇和10μmol/L As_2O_3单独或联合处理细胞,实验分为对照组、As_2O_310μmol/L组、白藜芦醇60μmol/L组、As_2O_3+白藜芦醇组;细胞划痕实验和Transwell小室法检测细胞的迁移、侵袭,采用免疫印迹法(Western blot)检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、波形蛋白(Vimentin)、钙黏蛋白E(E-cadherin)水平。结果不同浓度白藜芦醇(15、30、60、120μmol/L)显著抑制细胞的增殖(P0.05),且具有浓度依赖性,白藜芦醇的半数抑制浓度(IC50)为58.367μmol/L。与对照组相比,60μmol/L白藜芦醇和10μmol/L As_2O_3单独使用均可显著抑制细胞的迁移、侵袭能力(P0.05),显著下调MMP-2、MMP-9、Vimentin蛋白水平(P0.05),上调E-cadherin蛋白水平(P0.05),联合使用的效果高于单独使用。结论 As_2O_3和白藜芦醇联合使用可增加二者抑制肺癌细胞侵袭、迁移的能力,可能与调控细胞中MMPs水平、抑制细胞基质的降解和上皮间充质转化过程有关。     

柠檬酸钠与三氧化二砷联合应用对胃癌SGC-7901细胞的作用

目的探讨柠檬酸钠(sodium citrate,CT)与三氧化二砷(As_2O_3,,AS)联合应用对胃癌SGC-7901细胞凋亡及作用机制。方法用sodium citrate(终浓度为5 mmol/L,CT5)和As_2O_3(终浓度依次为5 μmol/L,AS5)处理体外传代培养的胃癌SGC-7901细胞株。应用DAPI细胞核染色和流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化;RT-PCR法观察抗凋亡相关基因bcl-2表达的变化。结果 sodium citrate与As_2O_3联合应用相对于单用sodium citrate或As_2O_3可显著提高诱导胃癌细胞凋亡率(P0.05);与空白组相比,用药后G_0/G_1期细胞比例下降,G_2/M期细胞比例上升,细胞周期阻滞于G_2/M期,抗凋亡基因bcl-2表达明显下降。结论 sodium citrate与As_2O_3联合应用具有协同抗胃癌细胞的作用,其机制可能与细胞周期阻滞、增强诱导胃癌细胞凋亡以及调控凋亡相关基因的表达有关。     

5F诱导肺癌A549细胞G2期阻滞及细胞凋亡并伴随p53上调及Survivin下调

目的调查ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(简称5F)对肺癌细胞的影响及机制。方法在不同时间段以5F(0～80μg/ml)处理肺癌A549细胞。采用MTT方法检测细胞毒性。采用碘化丙啶(PI)染色检测细胞周期。采用Annexin V/PI染色检测细胞凋亡。采用免疫印迹检测p53及Survivin蛋白水平。结果 5F以浓度依赖及时间依赖方式抑制A549细胞增殖。5F诱导A549细胞发生G2期阻滞及细胞凋亡。此外,5F处理还导致了A549细胞p53上调及Survivin下调。结论 5F可能通过激活p53及抑制Survivin诱导A549细胞发生G2期阻滞及细胞凋亡。     

三氧化二砷治疗慢性粒细胞性白血病的实验与临床研究

目的:观察三氧化二砷(As_2O_3)对免疫表型FIK1~+CD34~-的慢性粒细胞白血病(CML)干细胞增殖的影响,并初步探讨As_2O_3使CML患者能中断酪氨酸激酶抑制剂治疗的可行性。方法:分离CML患者骨髓细胞中FIK1~+CD34~-CML干细胞,检测As_2O_3对其细胞周期、凋亡及P53基因表达的影响,并观察应用伊马替尼后已获得完全细胞遗传学缓解的CML患者,单用As_2O_3注射液6周期后,其疗效及不良反应。结果:As_2O_3能抑制免疫表型为FIK1~+CD34~-的CML干细胞增殖(P0.05),可使其G0/G1期增加,S期降低,并可诱导凋亡。FIK1~+CD34~-CML干细胞经适当浓度的As_2O_3处理后,P53基因表达可显著提高。6例患者单用As_2O_3仍保持完全细胞遗传学缓解,且不良反应轻微,经对症处理后均可缓解。结论:As_2O_3对CML患者的治疗有一定效果,且无明显毒副作用,为使CML患者能中断酪氨酸激酶抑制剂的治疗提供了新的研究方向。     

三氧化二砷对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡影响的体外研究

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞的凋亡异常,以及三氧化二砷(As_2O_3)对体外培养RA的滑膜细胞凋亡的诱导作用.方法 用光镜、电镜、流式细胞仪检测As_2O_3对体外培养的RA滑膜细胞凋亡的诱导作用,As_2O_3,作用于RA滑膜后酶联免疫吸附试验(ELISA)检测凋亡过程中细胞色素C的变化,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Caspase-3.Bel-2 mRNA表达,采用单因素方差分析和LSD-t检验、Dunnet-t检验进行统计学处理.结果 流式细胞仪检测发现不同浓度的As_2O_3作用后,滑膜细胞的凋亡较空白对照组(NC)增加[NC(0.95±0.87)%,RA(0.21±0.12)%,P<0.05],呈一定的剂量依赖性,尤其以80 μmol/L药物浓度最为明显.凋亡早期(6 h)细胞色素C水平升高80 μmol/L组升高明显[NC(0.34±0.27),80 μmol/L组(32.04±1.62),P<0.05];不同浓度的As_2O_3作用后细胞中Caspase-3 mRNA表达显著增强[NC(0.144±0.022),RA(0.323±0.047),(0.824±0.109),(1.213±0.196),P<0.05],Bcl-2的mRNA表达显著减弱[NC(1.08±0.23),RA(0.94±0.15),(0.46±0.08),(0.22±0.06),P<0.05].结论 RA患者滑膜细胞凋亡较健康埘照减少,As_2O_3通过升高细胞色素c及Caspase-3,抑制Bcl-2诱导RA滑膜细胞凋亡.     

MI-219和阿霉素联合处理对卵巢癌耐药细胞A2780/ADM增殖的抑制作用

目的探讨MDM2抑制剂MI-219与抗癌药物阿霉素(ADM)联合应用对卵巢癌耐药细胞株A2780/ADM增殖的抑制作用。方法通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检查不同浓度MI-219 (5. 000μmol/L、2. 500μmol/L、1. 250μmol/L和0. 625μmol/L)对A2780/ADM细胞株增殖的抑制作用,以无毒(0. 625μmol/L)和低毒(1. 250μmol/L)剂量的MI-219与ADM联合处理A2780/ADM细胞,观察细胞增殖率变化;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞凋亡水平,通过Western印迹法检测细胞p53、MDM2、XIAP、Caspase3和Caspase9蛋白水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)分析胞质Cytochrome C释放水平。结果联合处理组细胞增殖率明显低于对照组和ADM单独处理组(P0. 01),细胞凋亡率则显著高于对照组和ADM单独处理组(P0. 05);联合处理组细胞MDM2、XIAP水平降低,活化型p53、Caspase3和Caspase9水平明显升高,同时,胞质Cytochrome C释放水平亦显著高于对照组和ADM单独处理组(P0. 01)。结论 MDM2抑制剂MI-219能增加ADM对卵巢癌耐药细胞株A2780/ADM诱导的凋亡,其机制可能是通过下调MDM2进而增加p53和降低凋亡抑制因子XIAP表达而发挥作用的。     

嗜肺军团菌htpA基因的克隆及其原核表达

目的克隆并检测嗜肺军团菌htpA基因在原核系统中表达情况,为进一步研究HtpA蛋白的免疫性能作必要的准备。方法采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得军团菌热休克蛋白A基因htpA,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGhtpA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,转化宿主菌大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了291bp完整的htpA基因,构建了原核表达重组质粒pGhtpA,并检测到约36kDa的GST-htpA融合蛋白质表达条带。结论成功克隆了嗜肺军团菌htpA基因并使HtpA蛋白在原核表达系统中得到了有效的表达,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

乙型肝炎病毒S基因经显微注射导入SMMC-7721细胞核内的表达

目的探讨细胞核显微注射导入外源基因的方法,观察HBV-S基因导入人肝癌细胞株SMMC-7721后的表达及其稳定性.方法将含有HBV-S片段的质粒pCR3.1-S线性化,通过显微注射仪直接注入培养的SMMC-7721细胞核内,G418筛选后,经EIA和免疫荧光法分别检测细胞培养上清和细胞内HBsAg的表达.结果每注射100～150个细胞可筛选出一个阳性克隆,3个阳性克隆经扩大培养后,其中1个克隆的培养上清经EIA法检测HBsAg阳性,免疫荧光显示细胞膜及细胞质均有HBsAg表达,并持续6 mo以上.结论HBV-S基因经显微注射导入SMMC-7721细胞后获得持续稳定的表达.     

基因芯片在痘病毒对宿主基因转录调控中的应用

痘病毒(Poxvirus)是病毒颗粒最大的一类 DNA 病毒,结构复杂;感染人和动物后常引起局部或全身化脓性皮肤损害,给畜牧业带来严重的经济损失同时也威胁着人类健康。痘病毒可通过多种策略调控宿主基因的转录进而影响其免疫应答。基因芯片通过对宿主细胞在病毒感染前后基因表达谱的检测,为病毒的致病机制及病毒感染对宿主的调控机制的研究提供了便利手段。本文综述了有关基因芯片在痘病毒研究中的应用。     

戚中田.DT/VEGF系统对胃癌细胞的杀伤效应

目的 研究DT390基因与VFGF及其外显子7基因融合后对胃癌细胞的杀伤作用,探索毒素融合基因治疗胃癌的有效途径。方法 构建携带DT390-VEGFl65或DT390-VEGFexon7融合基因的真核表达载体,用脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901,观察胃癌细胞的形态变化。结果 5μg真核表达构建物转染5x105个胃癌细胞/孔(24孔板)96h后发现,转毒素融合基因的细胞90％死亡,而对照细胞形态正常。结论融合基因可以在胃癌细胞中表达并发挥杀伤肿瘤的作用。     

E1A基因对人肺腺癌细胞增殖和细胞周期的影响

目的 探讨E1A基因对人肺腺癌细胞增殖的抑制作用与细胞周期的关系及作用机制。方法 利用细胞增殖曲线和裸小鼠体内致瘤性实验研究E1A基因对人肺腺癌细胞增殖的影响,采用流式细胞术分析人肺腺癌细胞周期,以蛋白印迹方法分析P16、P21、P53和cyclin B1水平变化。结果 转染E1A基因后,人肺腺癌细胞（Anip973-E1A）生长缓慢,体内致瘤性降低。Anip973-E1A细胞周期出现明显的S期抑制和G2/M阻滞,周期调控蛋白P16、P21、P53水平无明显变化,但cyclin B1表达明显下降。结论 E1A基因能显著抑制人肺腺癌细胞的体内外增殖,降低周期蛋白cyclin B1的表达,使细胞周期阻滞于G2/M,这可能与A1A基因抑制作用有关。     

Concomitant angioimmunoblastic T‐cell lymphoma and low grade B‐cell lymphoproliferative disorder

The presence of a rearranged immunoglobulin gene, in addition to the expected T‐cell receptor gene rearrangement, is a frequent, albeit poorly understood, finding in the setting of angioimmunoblastic lymphadenopathy. A case of an angioimmunoblastic T‐cell lymphoma is presented, where this apparently paradoxical dual gene rearrangement could be ascribed to the coexistence of an occult B‐cell lymphoproliferative disorder.     

腈水解酶2基因沉默细胞模型的制备

目的为腈水解酶2（NIT2）基因研究奠定基础。方法采用siRNA质粒转染技术制备NIT2基因沉默细胞模型,用筛网方法从大鼠肾脏中提取出肾小球用于培养原代系膜细胞,将NIT2靶序列构建pGU6/GFP/Neo质粒中（siNIT2质粒）,采用JETPRIME脂质体转染法将质粒转染入原代系膜细胞中,48h后荧光显微镜观察转染效率,利用SYBR GREEN 1定量PCR法检测NIT2基因表达,琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物。结果荧光显微镜下转染阳性率可达50%,定量PCR结果示siNIT2质粒转染后NIT2 mRNA显著降低,琼脂糖电泳结果示PCR产物无明显杂带。结论 siRNA质粒转染法可抑制原代系膜细胞NIT2基因的表达;为NIT2基因功能研究奠定了基础。     

bcl-2反义寡核苷酸与VP16协同抑制小细胞肺癌细胞增殖的研究

目的 研究bcl-2反义寡核苷酸与足叶乙甙（VPl6）联用对小细胞肺癌细胞NCI—H69增殖的影响。方法 通过脂质体将不同寡核苷酸导入NCI—H69细胞中，分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组4组。Western Blot法检测细胞bcl-2蛋白的表达。不同浓度的VP16作用于4组转染后的细胞，MTT法测定细胞存活分数。结果 4组细胞中。与空白对照组相比较，反义寡核苷酸组的bcl-2蛋白表达明显受到抑制。bcl-2反义寡核苷酸转染细胞与VP16作用后，反义寡核苷酸组细胞在各个浓度的存活分数均低于对照组，且有统计学意义（P〈0．01）。结论 bcl-2反义寡核苷酸与VP16能协同抑制小细胞肺癌细胞的增殖。