HBx基因的真核表达及其对肝癌细胞系HepG2细胞表型的影响

目的为了探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系,构建HBV X基因(hep-atitis B virus X gene,HBx)真核表达载体及其肝癌(HCC)细胞系HepG2瞬转模型,并检测HBx对HepG2细胞表型的影响。方法以pCMV-HBx为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pcDNA3.1-Flag真核表达载体中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx,转染至HepG2细胞;Western印迹法检测细胞中HBx蛋白的表达水平;5-溴尿苷(5-溴脱氧尿嘧啶核苷,5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记法检测转染HBx后细胞DNA合成变化;细胞周期检测试剂盒(CycleTESTTMPLUS DNA Reagent Kit)检测转染HBx后细胞周期的变化;AnnexinⅤ-APC/7-AAD法检测转染HBx后细胞凋亡情况。结果重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该载体的HepG2细胞可检测到HBx蛋白的表达;与转染空质粒pcDNA3.1-Flag的细胞相比,细胞增殖能力增强,而细胞凋亡比率下降。结论成功构建了HBx基因真核表达载体,并研究了HBx对细胞表型的影响,为进一步探索HBx参与HBV引发HCC的分子机制奠定了基础。     

近日节律基因Period2对紫外线损伤NIH3T3细胞的影响

目的 探讨Period2(Per2)基因对紫外线损伤NIH3T3细胞的影响.方法 将Per2基因插入pcDNA 3.1,构建Per2基因的真核表达质粒,采用脂质体包裹法转导入NIH3T3细胞内.以紫外灯照射Per2基因过表达(pcDNA 3.1-Per2)的NIH3T3细胞、pcDNA 3.1空白组(pcDNA 3.1-vector)细胞和空白对照组细胞;通过流式细胞术和克隆形成试验检测稳定转染Per2阳性表达的NIH3T3细胞的凋亡、生长情况;采用单细胞凝胶电泳技术检测Per2过表达对DNA损伤后修复的影响.结果 紫外线照射后Per2阳性表达的NIH3T3细胞较其对照组细胞增殖速度快、凋亡率减少,单细胞凝胶电泳实验表明紫外线照射后,各组细胞均表现出明显的DNA损伤,但是pcDNA 3.1-Per2转染组均较pcDNA 3.1-vector及空白对照组细胞的彗星细胞出现率和拖尾细胞DNA迁移长度低.结论 节律基因Per2能抑制紫外线对细胞的损伤,其机制可能与Per2促进DNA修复作用有关.     

12C6+重离子诱导可溶性TRAIL表达增强及其抗肿瘤作用的实验研究

目的构建可被辐射诱导激活的表达载体pEgr-sTRAIL,研究其体外瞬时转染联合不同剂量的^12C^6＋离子辐照对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖活性的影响。方法SOEing PCR法克隆可溶性TRAIL基因,测序正确后连入pcDNA3.1-Egr质粒,构建pEgr-sTRAIL表达载体;采用GeneCompanionTM聚阳离子转染试剂体外瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞;接受不同剂量的^12C^6＋照射后,RT-PCR法检测目的基因 mRNA水平的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,克隆形成实验检测细胞增殖存活。结果成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-sTRAIL;瞬时转染联合^12C^6＋离子照射可在mRNA水平上诱导sTRAIL表达增强;随照射剂量的增加,转染pEgr-sTRAIL的HeLa细胞凋亡率明显增加,克隆形成率明显下降。结论^12C^6＋离子可诱导重组质粒pEgr-sTRAIL在被转染的HeLa细胞中表达增高,体外基因-^12C^6＋离子联合治疗可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

Twist过表达在人腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的探讨twist在人腹膜间皮细胞(HPMCs)转分化中的作用。方法取HPMCs细胞,分别用50mmol/L右旋葡萄糖(高糖组)和5.6mmol/L右旋葡萄糖(对照组)刺激48h,采用Western blotting检测twist、E-钙黏素(E-cadherin)、成纤维细胞特异性蛋白1(Fsp1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。另采用质粒pcDNA3.1-twist(pcDNA3.1-twist组)和空载体pcDNA3.1(空载体组)分别转染常规培养的HPMCs,使HPMCs过表达twist后,采用qRT-PCR、Western blotting方法检测twist、E-cadherin、Fsp1和α-SMA mRNA及蛋白的表达情况。再采用质粒twist小干扰RNA(阳性转染组)和空载体pcDNA3.1(空载体组)分别转染50mmol/LD-葡萄糖培养48h后的HPMCs细胞,另选择未转染质粒的细胞作为亲本细胞组,采用Western blotting检测twist下调后,E-cadher-in、Fsp1、α-SMA蛋白水平的表达情况。结果与对照组相比,高糖组twist、Fsp1和α-SMA蛋白表达明显增加,E-cadherin表达减弱(P<0.05)。与空载体组相比,HPMCs过表达twist后,pcDNA3.1-twist组E-cadherin mRNA及蛋白表达减弱,Fsp1和α-SMA mRNA及蛋白表达增强(P<0.05)。用小干扰RNA使twist沉默后,与亲本细胞组及空载体相比,E-cadherin蛋白表达增加,Fsp1和α-SMA蛋白表达减弱(P<0.05)。结论 Twist过表达促进了HPMCs的转分化。     

人角化细胞生长因子-1的克隆及其在骨髓基质细胞中的表达

目的 从人胚肺成纤维细胞中克隆人角化细胞生长因子-1（KGF-1）编码区序列,构建真核荧光表达载体.方法 从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录 PCR获取KGF-1 cDNA编码区序列,将其与pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,测序鉴定.将pIRES2-EGFP/KGF-1瞬时转染骨髓基质细胞（marrow stroma cells,MSCs）48 h后,免疫荧光法检测骨髓基质细胞是否存在KGF-1蛋白的表达.结果 构建的重组质粒pIRES2-EGFP/KGF-1经序列分析示与国外文献报道一致.KGF-1免疫荧光法激光共聚焦检测结果证实,pIRES2-EGFP/KGF-1转染骨髓基质细胞后,存在KGF-1蛋白的表达,定位于细胞浆内.结论 成功构建重组真核荧光表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,初步探讨了该基因在骨髓基质细胞中的表达,为其在皮肤组织工程的运用奠定了基础.     

干扰素-α转染HepG2细胞内下调表达基因的筛选

目的 筛选干扰素-α真核表达质粒转染HepG2细胞后细胞内表达下调的基因,以进一步探讨干扰素-α作用的分子生物学机制.方法 将pcDNA3.1(-)-IFN-α以及pcDNA3.1(-)空载体分别转染肝母细胞瘤HepG2细胞系,用抑制性消减杂交技术筛选pcDNA3.1(-)-IFN-α转染HepG2细胞内表达下调的基因.以pcDNA3.1(-)转染组细胞作为tester,pcDNA3.1(-)-IFN-α转染组作为driver,建立消减文库,随机挑选阳性克隆,测序并进行序列比对,得到下调表达的基因.应用RT-PCR技术,进一步证明IFN-α对Hsp90的下调表达作用关系.结果 成功构建了IFN-α真核表达质粒转染HepG2细胞后表达下调的cDNA消减文库.从文库中随机挑选克隆,测序并进行生物信息学分析后,得到下调表达的基因有:铁蛋白,热休克蛋白90,S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1,真核翻译延伸因子1β,信号序列受体β(SSR2),组织因子路径抑制子,RAD23同源物B.RT-PCR进一步表明,IFN-α真核表达质粒转染的HepG2细胞内Hsp90 mRNA表达水平下调.结论 应用SSH技术成功构建了pcDNA3.1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞内表达下调的cDNA消减文库,并筛选出下调表达基因,半定量RT-PCR表明IFN-α对Hsp90 mRNA具有下调表达作用.为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据.     

近日节律基因Per2对人肺癌细胞生长的抑制作用

目的 研究近日节律基因Per2对肺癌细胞(A549)生长的抑制作用及其机制.方法 将pcDNA3.1(+)-Per2转导入A549细胞内,过表达Per2,以空质粒pcDNA3.1(+)为对照.采用MTT和细胞平板集落形成实验检测肺癌细胞的生长情况;通过流式细胞技术观察细胞的凋亡.结果 近日节律基因Per2能够抑制A549细胞的生长和增殖,诱导细胞凋亡.结论 近日节律基因Per2能够抑制肺癌细胞的生长,其机制可能涉及诱导肿瘤细胞的凋亡.     

嗜肺军团菌PAL、HSP60抗原基因在真核细胞中表达的实验研究

目的 研究嗜肺军团菌PAL、HSP60抗原基因在真核细胞中的表达,为嗜肺军团菌DNA疫苗的研制提供实验依据.方法 将本室已构建的重组质粒pcDNA3.1-PAL和重组质粒pcDNA3.1-HSP60分别及混合转染NIH3T3细胞,通过免疫荧光和RT-PCR检测其瞬时表达和稳定表达产物.结果 重组质粒pcDNA3.1-PAL、pcDNA3.1-HSP60以及混合pcDNA3.1-PAL 和pcDNA3.1-HSP60转染NIH3T3细胞后均获得了有效表达.结论 本研究结果为嗜肺军团菌核酸疫苗的进一步研究奠定了基础.     

阿片受体δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建带FLAG标签的大鼠δ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(δ-FLAG-pIRES2δEGFP),并实现其在CHO细胞中的表达.方法 以含大鼠全长δ阿片受体基因的δ-pMD20-T载体为模板,设计引物并行PCR扩增,在δ基因C端引入FLAG标签,AT克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切连接入pIRES2-EGFP中,将获得的δ-FLAG-pIRES2-EGFP载体转染CHO细胞,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹法检测δ-FLAG的表达.结果 测序及酶切结果表明获得了带FLAG标签的δ基因,成功构建δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光.应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的 基因表达.结论 成功构建了δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,并在CHO细胞中实现了高效表达.     

干扰HERG钾通道表达可抑制成神经细胞瘤细胞增殖

目的：采用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术抑制HERG基因的表达，探讨HERG基因编码钾通道对人成神经细胞瘤细胞（SH-SY5Y）存活及增殖的影响。方法：构建发卡状RNA干扰质粒（shRNA-HERG）转染SH-SY5Y细胞，再分别使用半定量RT-PCR和Western印迹方法观察shRNA-HERG对SH-SY5Y细胞中HERG基因mRNA及其编码蛋白表达的干扰效果。利用SH-SY5Y细胞的生长曲线和集落形成实验，观察转染shRNA-HERG质粒对SH-SY5Y细胞存活及增殖能力的影响。结果：转染shRNA-HERG干扰质粒后，SH—SY5Y细胞中HERG基因的mRNA水平及其编码的钾通道蛋白表达水平显著下降。与对照组相比，shRNA—HERG使SH-SY5Y细胞生长曲线明显下压，细胞倍增时间延长136．8％。集落形成实验结果显示，无论接种细胞数为50，100或200，shRNA-HERG组克隆形成率均显著下降，与shRNA-control组和未干扰组相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：所构建的shRNA-HERG表达质粒能有效抑制HERG基因编码钾通道蛋白的表达，明显抑制SH-SY5Y细胞的生长和增殖。     

Optimization of the system of medical service of students of Cadet Schools of the Ministry of Defense of the Russian Federation

One of the factors of the successful military career guidance Cadet schools students is preserving and promoting their health. Medical support of children and adolescents aged 10-17 years should include the full range of medical and preventive measures defined for this group. The state of providing outpatient care for pupils at the Cadet School in St. Petersburg was studied. These results show that full medical care in accordance with the standards can be based only on children's health clinics. It is important that the organization of medical support pupils cadet schools should be cooperate with civilian health care.     

带状疱疹83例误诊原因分析

带状疱疹是由水痘—带状疱疾病毒引起的皮肤科常见疾病。其主要的病理损害,一是受累神经的严重炎症性浸润,继而导致受侵犯神经节内神经细胞变性、坏死;二是皮肤的水泡。迅速抑制神经节和相应的感觉神经纤维的充血、水肿和坏死,防止粘连形成,达到迅速镇痛、改善皮损,缩短病程及防止后遗症的发生是治疗的关键。因而,尽早明确诊断,     

Estimation of accumulated dose of radiation by method of ESR-spectrometry of dental enamel of mammals

ESR-spectrometry was used to investigate radiation-induced paramagnetic centers in enamel of mammals: carnivores (polar bear and fox), ungulates (reindeer, European bison, moose), and man. Values at half the microwave power saturation of the radiation signal, P_1/2, evaluated at room temperature, was found to range from 16 to 26 mW for animals and man. A new approach to discrimination of the radiation induced signal from the total ESR spectrum of reindeer enamel is proposed. ‘Dose-response’ dependencies of enamel of different species mammals were measured within the dose range from 0.48 up to 10.08 Gy. Estimations of ‘radiosensitivity’ enamel of carnivores and ungulates showed good agreement with radiosensitivity enamel of man by ESR method.     

Analysis of the results of the international comparison of activity measurements of a solution of Fe

The results of an international comparison of activity measurements of a solution of ⁵⁵Fe organized by the BIPM in 2005 are reported and analysed. This exercise, which follows the procedures of the CIPM mutual recognition arrangement to update older comparisons, is a renewal of the comparison organized by the BIPM that took place in 1978. A EUROMET comparison was organized in 1996 specifically to compare activity measurements of a ⁵⁵Fe solution by means of liquid-scintillation techniques. Results of these three comparisons are presented and discussed in this paper.

The radionuclide solution was provided by the NPL, which also distributed the samples to the participants. The activity of the ampoules was measured by 16 laboratories using 12 methods producing 25 results. Some general considerations on uncertainty assessments pertaining to the different techniques used are drawn. The outcome of four different estimators is compared from which the presence of at least one outlier can be confirmed. Further measurements should be made to try to reduce the discrepancy between the results. To date the outcome of the present comparison does not show an improvement to that of the 1996 comparison.     

Evaluation of the results of various technics of non-surgical therapy of varicocele

A new method of non-surgical treatment of varicocele syndrome is described: it consists in sclerotherapy of spermatic vein by trans-femoral percutaneous catheterization with balloon-catheters. In 8 cases venous thrombosis has been induced by direct electric clotting. The techniques and a 6 months follow-up are discussed. It is pointed out that this procedure should be considered as the method of choice for tubular lesions and sub-fertility prophylaxis in young people and in childhood.     

延迟性脾破裂误漏诊原因分析

目的探讨延迟性脾破裂误漏诊原因和预防措施.方法回顾性分析总结12例延迟性脾破裂中的诊断和误漏诊的经验与教训.结果本组延迟性脾破裂的误漏诊5例(41.66%).对多发伤与脾破裂并存可能认识不足,外伤史轻微或伤员隐瞒外伤史,缺乏腹痛-缓解-突然再腹痛的典型病史,缺乏“对冲性脾破裂”力学分析和整体化诊断思路等为其误漏诊的主要原因.结论详细的外伤史和全面系统检查,重视腹以外多发伤掩盖腹内脏器伤及延迟性脾破裂可能.确立外伤-腹内脏器伤-脾破裂整体化诊断思路.不间断地辅以B超检查脾形态学变化和腹内有无积液,腹腔穿刺确定有无血腹、X线胸腹部检查观察左侧胸肋角和膈肌运动情况、必要时CT检查以尽早发现脾包膜下血肿,降低延迟性脾破裂误漏诊率.