人羊膜负载猪角朊细胞重建表皮的形态学研究

目的 采用细胞组织工程技术，将人羊膜（Human amniotic membrane,HAM）负载培养猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物，并观察猪角朊细胞在HAM上生长增殖的形态特点。方法 将贵州小香猪的角朊细胞原代培养，传代扩增后，接种于HAM基质面，逐日于倒置显微镜下观察角朊细胞的生长增殖变化情况，并于培养3－15d进行光镜、电镜观察，检测角朊细胞在HAM上的生长情况。结果 接种后30min内就明显见到角朊细胞在HAM上贴附，24h内大部分贴附生长，3d形成单层完全覆盖HAM。结论 HAM是角朊细胞在体外培养的良好载体，对角朊细胞有明显的促增殖作用。     

人工皮肤培养模型的建立

模拟体内生理条件,采用细胞三维培养技术将角朊细胞接种在一活性真皮替代物（即成纤维细胞胶原凝胶）上,然后行气液界面培养,使角朊细胞的一些正常生长和分化的特殊提以再现,从而形成一种能应用于临床的人工皮肤。而且这一培养模型使角朊细胞、成纤维细胞和细胞外基质构成了一有机的整体,因而也是研究表皮分化、其表皮间相互关系的良好模型。     

人白细胞介素2基因转染角朊细胞稳定表达的检测

目的 观察人白细胞介素２（ＩＬ－２）基因皮肤角朊细胞中的稳定表达及分泌情况。方法 ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导法转染，以Ｇ４１８筛选出阳性克隆并做扩大培养用ＤＮＡ斑点杂交，ＲＮＡ斑点杂交，细胞铺片原位杂交，免疫组织化学，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交分析及噻唑蓝（ＭＴＴ）法检测外源基因在角朊细胞内的表达及分泌情况。结果 ＤＮＡ斑点杂交ＲＮＡ斑点杂交，原位杂交和免疫组织化学以均显著转染组有阳性信号，Ｗｅｓ     

SD大鼠角朊细胞分离培养及鉴定

目的 探讨SD大鼠角朊细胞的分离培养技术并鉴定,观察细胞生长情况.方法 采用中性蛋白酶(DispaseⅡ)和胰蛋白酶分离角朊细胞,加入含有10％胎牛血清的角质化细胞专用培养基(keratinocyte serum free,K-SFM)培养.用免疫组化法和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法进行鉴定.结果 角朊细胞生长缓慢,原代培养第5天开始出现细胞克隆,核大而圆,培养11天连成片,培养24天长满单层,细胞传代培养比较困难,很难贴壁,经摸索在培养第15天,细胞长满80％左右时即可传代,但一般传3代后就不能再传.大鼠角朊细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)染色,细胞质呈棕褐色,提示培养的细胞CK19阳性.大鼠角朊细胞标志RT-PCR检测整合素β1、CK14(cytokeratin 14)、CK10(cytokeratin 10)的mRNA表达均阳性.结论 用两种酶分离获得的大鼠角朊细胞活性好,降低成纤维细胞污染,用K-SFM培养基培养的细胞经鉴定具有角朊细胞特性,为皮肤组织工程的研究提供良好的种子细胞方面的实验数据.     

宫颈HPV亚临床感染的病理形态特点及其与HPV亚型的相关性

目的：探讨宫颈人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）亚临床感染的病理变化与ＨＰＶ亚型的关系。方法：观察分析１０２例宫颈ＨＰＶ亚临床感染的病理特点,其中５８例同时取宫颈脱落细胞及分泌物,采用ＰＣＲ方法检测ＨＰＶ６／１１及ＨＰＶ１６／１８,将２组结果进行对比分析。结果：宫颈ＨＰＶ亚临床感染的病理改变不完全等同于临床型尖锐湿疣,除表现Ⅰ型诊断性挖空细胞（４１．２％）外,另可见异型性明显的Ⅱ型非典型性挖空细胞（５８．８％）。宫颈ＨＰＶ感染同时合并ＣＩＮ４２便（４１．２％）,３１例ＨＰＶ感染伴ＣＩＮ２－３病变中有２６例（８３．９％）含Ⅱ型挖空细胞。３６例含Ⅱ型挖空细胞的病变中有３１例（８６．１％）ＨＰＶ１６／１８阳性。结论：Ⅱ型挖空细胞与高危型ＨＰＶ１６／１８及ＣＩＮ２－３密切相关,当出现Ⅱ型挖空细胞时提示ＨＰＶ１６／１８感染的可能性     

茶多酚对原代培养的大鼠皮肤角朊细胞和成纤维细胞生长的 …

目的 探讨茶我酚对原代培养的皮肤角朊细胞和成纤维细胞生长作用的影响。方法 利用原代２的两种主要的皮肤细胞－－角朊细胞和成纤维细胞,采用丙酮酸比色法、ＴＢＡ比色法和ＤＴＮＢ（双硫代对硝基苯甲酸）法测定细胞２的上清液胞浆酶（ＬＤＨ）释放情况,脂质氧化产物（ＭＤＡ）、谷胱甘这氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）,并测定培养细胞的生长情况,对茶多酚在皮肤中可能起到的作用进行评价。结果 在加入茶多酚后不同时间地多数发现     

获取SD仔鼠角朊细胞和真皮成纤维细胞6种方法比较

目的 :探讨如何以简便快捷的方法获得大量最佳生长状态的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞 .方法 :用 2 .5 g·L -1 胰酶、35 g·L -1 热溶素和 9.0× 1 0 3 U·L-1 Dispase分别在不同条件下处理皮肤标本 ,观察表皮与真皮的分离情况 ,并分别培养角朊细胞和真皮成纤维细胞 ,观察比较细胞的贴壁率和克隆形成率 ,通过MTT和BrdU检测观察细胞的生长状态 ,并分别用不同方法获得的细胞构建组织工程皮肤 .结果 :在各种条件下 ,Dispase处理组获得的细胞数量、细胞贴壁率和克隆形成率均优于其他消化液处理组 ,细胞纯度高 ,生长状态良好 ;用其他方法获得的细胞生长状态相似 ,都可成功构建组织工程皮肤 .结论 :使用9.0× 1 0 3 U·L-1 Dispase可以简便快捷的获得大量生长状态良好的角朊细胞和真皮成纤维细胞 ,以作为皮肤组织工程的种子细胞 ,合适的消化方法、时间和温度可以最大限度保持原代细胞的活力     

巢式PCR检测关节炎患者血清人细小病毒B19DNA

目的：探讨关节炎患者人细小病毒Ｂ１９（ＨＰＶＢ１９）的感染情况以及ＨＰＶＢ１９感染与类风湿性关节炎（ＲＡ）的相关性．方法：应用巢式ＰＣＲ方法对７４例单发或多发性关节炎患者以及对照组５０例非病毒感染相关性疾病、正常健康献血员及正常健康儿童血清进行ＨＰＶＢ１９－ＤＮＡ检测．结果：①病例组ＨＰＶＢ１９－ＤＮＡ阳性１５例（２０．３％）,其中６例为ＲＡ患者（４０％）,对照组阳性１例（２％）,相差非常显著（Ｐ     

用PCR技术检测皮肤表皮肿瘤组织HPV DNA

应用多对引物ＰＣＲ方法检测５８例皮肤人表皮肿瘤（Ｂｏｗｅｎ‘ｓ病１７例，Ｑｕｅｙｒａｔ增殖性红斑５例，鲍温样丘疹病１６例，皮肤鳞状细胞癌２０例）石蜡包埋组织中ＨＰＶ６，１１，１６及１８ＤＮＡ。Ｂｏｗｎｅ’ｓ病ＨＰＶ１ＤＮＡ２例（２／１７）阳性Ｑｕｅｙｒａｔ增殖性红斑ＨＰＶ１６ＤＮＡ１例（１／５）阳性，鲍温样丘疹病ＨＰＶ１６ＤＮＡ９例（９／１６）阳性，皮阳鳞状细胞癌ＨＰＶＤＮＡ２０例均阴性，提示鲍温     

应用胶原蛋白构建组织工程皮肤的实验研究

目的 探讨以胶原蛋白为支架构建组织工程皮肤的体外培养理想方法.方法 体外分离、培养、鉴定角朊细胞和成纤维细胞;利用本室自制胶原蛋白,制备胶原凝胶和胶原海绵两种组织工程支架;在成功构建人工真皮的基础上,种植角朊细胞,构建人工复合皮肤,并进行组织学及免疫组化检查.结果 制备的胶原海绵孔径平均100～150μm,孔隙率89%,组织相容性良好;两种皮肤替代物免疫组化染色显示Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(Laminin)阳性,HE染色可见均具有表皮和真皮双层结构,厚度约3mm,在形态结构上与正常皮肤相似.结论 培养的人角朊细胞和成纤维细胞种植于胶原蛋白支架上气-液界面培养可构建出具有类似天然皮肤结构的组织工程皮肤.     

神经细胞体外分离培养的比较研究

目的：对神经元分离、培养的不同实验方法进行比较研究。方法：取成年小鼠和新生小鼠的脑皮质或全脑组织，经胰蛋白酶消化分离后，分别在普通RPMI-1640培养基、含阿糖胞苷的培养基、含Neurol Medium和B27的培养基3种不同条件下进行培养，观察神经元的生长情况。结果：采用普通RPMI-1640培养基培养的神经元被胶质细胞掩盖，形态不典型，神经元比例小；用含阿糖胞苷的培养基培养的神经元所含比例较高，但形态不太典型；用含Neurol Medium和M27的培养基培养的神经元形态典型，生长良好。结论：采用含Neurol Medium和M27的培养基可以从的乳鼠的全脑组织中培养出形态典型，生长良好，较为纯净的神经元，方法简便，得率高，这为进一步深入探讨其功能奠定了良好基础。     

针对CTGF的siRNA对高糖诱导小鼠足细胞nephrin、podocin减少的影响

目的 探讨结缔组织生长因子(CTGF)在高糖诱导小鼠足细胞nephrin、podocin表达减少中的作用,及针对CTGF基因的siRNA对其影响.方法 将体外培养的小鼠足细胞分为6组:(1)正常对照组,1640培养基含D-葡萄糖1 g/L;(2)等渗对照组,1640培养基合D-葡萄糖lg/L,甘露醇3.5 g,L;(3)高糖组,1640培养基含D.葡萄糖4.5 g,L;(4)高糖+空白对照组:细胞转染空白质粒后于舍D-葡萄糖4.5 g/L中的1640培养基中培养;(5)高糖+阴性对照组:细胞转染含无关序列的重组质粒后于含D-葡萄糖4.5 g/L中的1640培养基中培养;(6)高糖+干扰组:细胞转染针对CTGF的siRNA表达质粒后于含D-葡萄糖4.5g/L中的1640培养基中培养.应用Reahime PCR检测nephrin、podocin、CTGFmRNA水平,Western blot检测CTGF,nephrin、podocin蛋白表达水平.结果 高糖可诱导CTGF mRNA及蛋白表达增加,下调足细胞的nephrin、podocin mRNA及蛋白水平,而通过特异性siRNA抑制CTGFmRNA表达后,CTGF表达减少,同时伴有细胞nephrin、podocin表达升高.结论 CTGF是高糖诱导小鼠足细胞损伤的重要介质,高糖可通过CTGF诱导nephrin,podocin表达减少.针对CTGF的siRNA能明显改善这种损伤,为DN发病机制的研究提供新的实验依据.     

NK细胞功能亚群：“NKh1和NKh2”的初步验证

目的 证实NK细胞存在与T细胞类似的Th1/Th2两类亚群。方法 从健康人外周血分离纯化NK细胞,利用促漂移和RT－PCR的技术,检测外周血静止的NK细胞及在不同极化条件下培养的NK细胞表达I和II类细胞因子的情况。结果 采用补体裂解法＋单抗铺皿法分离纯化15例人外周血NK细胞,TR－PCR方法检测NK细胞表达的两类因子,发现外周血静止NK细胞因子的表达较强,主要是IFNγ,Ⅱ类细胞因子中主要是IL－10、IL－13、IL－13。在促Th1极化条件下,NK细胞中表达的I类细胞因子I类细胞因子IFNγ明显增强,Ⅱ类细胞因子表达减强,而在促Th2极化状态下,NK细胞表达的IFNγ水平下降,Ⅱ类细胞因子的表达水平升高。静止和Ⅱ类细胞因子状态下NK细胞均表达极低水平或不表达IL－4。结论 NK细胞根据其产生的细胞因子可以分化为两个亚群。暂命名为NKh1和NKh2。外周血静止的NK细胞主要以NKh1表型为主,两个亚群均表达较高水平的IFNγ,这与NK细胞的杀伤功能是密切相关的。     

人皮肤角质形成细胞的制备及体外培养

目的 探讨人皮肤角质形成细胞制备及体外培养的方法.方法 皮肤标本用胰酶、胰酶＋分离酶（dispase酶）2种方法消化,并分别以DMEM培养基、RPMI 1640培养基、限制性角质形成细胞无血清培养基（KC-FSM培养基）培养,MTT法通过比色分析测定培养48 h、72 h后细胞的光密度值（D值）,以判断不同培养基对角质形成细胞增殖的影响.结果 胰酶＋分离酶消化可获得较纯的原代角质形成细胞,细胞在限制性KC-FSM培养基中生长良好,培养48 h、72 h后测得的D值显著高于DMEM培养基和RPMI 1640培养基（P＜0.05）.结论 胰酶＋分离酶消化、限制性KC-FSM培养基体外培养是制备和培养人皮肤角质形成细胞的好方法.     

RPMI1640培养液在阴道滴虫培养中的应用

目的：评价１６４０培养液在阴道滴虫体外培养中的应用效果。方法；在ＲＰＭＩ１６４０培养液中加入其它在份，配制成新的阴道滴虫培养基。观察其对阴道滴虫的培养效果，并与ＣＰＬＭ培养基作比较。结果：滴虫在两种培养基中的增殖倍数有显著性差异。在临床标本中分离方面与ＣＰＬＭ培养基无明显差异，但在保种时间上比ＣＰＬＭ培养基较长。结论：ＲＰＭＩ１６４０培养液应用于阴道滴虫培养中效果良好。     

胶原酶灌注法制备小鼠肝细胞

目的:建立体外培养小鼠肝细胞的实验体系。方法:采用两步原位胶原酶灌注法分离小鼠肝细胞,在RPM I1640培养液中培养。结果:用胶原酶灌注法分离的小鼠肝细胞活率可达90%以上,产量平均为2.8×107,完全满足实验要求。肝细胞在RPM I1640培养液中2 h即可贴壁,48 h内细胞贴壁充分,伸展良好,1周后死细胞增多。结论:胶原酶灌注法成功制备出小鼠肝细胞。     

大肠癌原代细胞培养方法的探索

目的：探讨肿块大体类型、分化程度、取材位置以及不同培养方法等因素对大肠癌原代细胞培养成功率的影响,寻求一种简便而高效的大肠癌原代细胞培养方法。方法：分别对选材不同的人大肠癌细胞进行胶原酶消化法、组织块法培养,并比较不同培养基、细胞培养方法和细胞纯化方法对大肠癌细胞原代培养结果的影响,倒置显微镜下观察原代细胞的生长情况,免疫细胞化学法检测细胞表面标记物的表达情况。结果：肿块增生型肿瘤标本污染较少,肿瘤中心部位取材的肿瘤细胞活性好（2例培养出满意细胞均为肿块增生型中央深部取材获得）。低分化级别肿瘤短期生长可表现出明显活力,细胞数多于中分化,但长期生长结果未发现细胞数明显增多。2例培养出肿瘤细胞并顺利传代,1例分化为Broder Ⅱ级,1例分化为Ⅲ级。采用RPMI1640培养基,培养瓶瓶底用鼠尾胶原包被,加入适量生长激素,用组织块培养法进行原代培养,胰酶消化法纯化细胞,简便且效果好。免疫细胞化学检测培养的细胞来源于上皮组织。结论：肿块型肿瘤的中心部位、分化较差的肿瘤细胞活性好。大肠癌细胞原代培养,用组织块培养法和胰酶消化法纯化,采用RPMI 1640培养基,培养瓶瓶底用鼠尾胶原包被并加入适量生长激素,效果较好。     

恶性胸水培养肿瘤细胞失败原因分析

目的目前在肿瘤化疗体外药敏及生物免疫治疗中很重要的一个步骤是获取原代肿瘤细胞,通过对培养失败的原因分析,揭示肺部肿瘤细胞原代培养中应注意的问题,以便今后选择正确的培养方法,避免再走弯路.方法无菌条件下取恶性胸水沉渣接种于RPMI Medium 1640,观察细胞生长情况.结果 15例标本培养观察约10 d能见到大量成纤维细胞生长,8例标本曾见到肿瘤细胞生长,但继续培养后肿瘤细胞死亡.8例未见到肿瘤细胞生长.结论胸水采集量不足,沉淀后细胞数量少是失败的最主要因素;未及时送培养;未行冷藏送检;未及时清除成纤维细胞均为失败的重要原因.     

体外培养恒河猴外周血单核巨噬细胞的研究

目的：建立一种简单、经济、高效地培养恒河猴外周血单核巨噬细胞（monocyte-derived macrophage,MDM）的方法。方法：用肝素钠抗凝管采集健康成年中国恒河猴（Macaca mulatta）全血,密度梯度离心法分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）。同时用无抗凝剂采血管采集同一只猴外周血,自凝后分离血清。将猴PBMCs置于CELLBIND Surface的96孔（0.8×106个细胞/孔）或48孔培养板（3×106个细胞/孔）中,用含不同百分比的猴自体血清或胎牛血清（fetal calf serum,FCS）的RPMI 1640培养液培养24h后洗弃未贴壁细胞,加入含有猴自体血清或FCS的新鲜培养基继续培养7天后观察细胞形态学。分化良好的猴单核巨噬细胞贴壁能力强,占据板底大部分区域。胞体形态多样,多数呈长梭形。用巨噬细胞标记受体（CD14）抗体染色判断细胞纯度。并用细菌内毒素（LPS）刺激分化的巨噬细胞,检测巨噬细胞炎性因子的表达。此外,用猴艾滋病毒（SIVmac17E-Br、SIVmac251）和人-猴嵌合体艾滋病毒（SHIV KU-1）感染分化良好的猴巨噬细胞,检测病毒在猴巨噬细胞中的复制。结果：在含2%猴自体血清的RPMI 1640培养条件下,大多数（>85%）猴单核细胞能在24h内贴壁,体外分化5-7天后,猴巨噬细胞纯度大于96%。相比而言,含较高浓度（4%,8%或10%）猴自体血清或FCS的RPMI 1640 培养基对猴单核细胞的贴壁和分化作用较差。分化良好的猴巨噬细胞对LPS刺激敏感,可产生多种巨噬细胞炎性因子。此外,这些细胞对SIV或SHIV均易感,产生感染性病毒。结论：含2%猴自体血清的RPMI 1640培养基适于原代猴单核细胞的贴壁和分化。该方法简单、花费少,无需生长因子,且分化效果好,是培养猴艾滋病毒及开展相关免疫学实验的重要手段。     

原代人胚肺、肾细胞成功培养方法的改进

目的：培养出广泛适合于基础与临床研究的原代人胚肺、人胚肾细胞。方法：分别用不同的培养基及不同浓度的血清,以改进的方法对原代人胚肺、肾细胞进行培养。结果：经水囊引产的３月大小的胚胎肺及肾,用ＭＥＭ及１６４０加上２０％的牛血清,对细胞的贴附及增殖十分有利,细胞生长状态良好。结论：经改进后的对人胚肺细胞和人胚肾细胞的原代培养,用含２０％的小牛血清的ＭＥＭ和１６４０的培养液对细胞的生长极为有利。