中药饮片鹿血晶对巨噬细胞的免疫调节作用研究

目的:探讨鹿血晶(DBC)对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7的免疫调节作用及其可能机制。方法:CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术及免疫荧光法检测巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬能力;qRT-PCR法检测炎症因子iNOS、IL-1β、IL-6的mRNA表达水平;ELISA法检测培养基上清中iNOS、IL-1β、IL-6含量;Western blot法检测转染NF-κB信号通路蛋白表达。结果:鹿血晶能够提高LPS刺激下的RAW 264.7细胞活力(P0.05);鹿血晶能抑制LPS刺激下RAW 264.7细胞的炎症因子表达和释放(P0.05);鹿血晶能够抑制LPS刺激下RAW 264.7细胞内磷酸化IKK-α/β和磷酸化P65蛋白的表达;鹿血晶促进RAW 264.7细胞对大肠杆菌的吞噬能力(P0.05)。结论:鹿血晶能够增强巨噬细胞吞噬大肠杆菌的能力,并且在不影响细胞活力的同时作用于NF-κB信号通路,抑制炎症状态下巨噬细胞炎症因子的表达与释放。     

Sesn2通过激活mTOR信号通路调节LPS诱导的巨噬细胞M1极化和炎症反应

目的：探讨sestrin 2 (Sesn2)在巨噬细胞中的功能及其通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路对巨噬细胞极化和炎症的影响。方法：用小干扰RNA构建Sesn2沉默（si-Sesn2）的RAW264.7小鼠巨噬细胞胞株,通过脂多糖（LPS）处理RAW264.7细胞建立体外炎症模型。RT-qPCR评估白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、CD86和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的mRNA水平;ELISA检测培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平;流式细胞术确定CD86标记的M1型巨噬细胞百分比;Western blot分析mTOR、p70核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）和真核翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)的蛋白表达水平。结果：在LPS诱导的体外炎症模型中,Sesn2在RAW264.7细胞中的表达上调,IL-1β、IL-6、TNF-α以及M1型巨噬细胞标志物CD86和iNOS的表达显著增加,伴随mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表达水平的升高。而si-Sesn2进一步促进了上述效应,但这些变化可通过雷帕霉素预处理减轻。结论：S...     

CpG-c41对TLR9信号通路的干扰作用及其机制探究

目的探讨Cp G-c41分子对TLR9信号通路的干扰作用及其机制。方法获取小鼠骨髓巨噬细胞,M-CSF刺激使骨髓细胞向单核巨噬细胞分化,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测诱导成功的巨噬细胞的比例;培养Raw264.7细胞,ELISA法检测Cp G-c41分子对TLR9激动剂Cp G-1826刺激小鼠来源骨髓巨噬细胞和Raw264.7细胞诱发的炎症因子TNF-α和IL-6的影响;Western blot检测Cp G-c41对TLR9-My D88依赖型信号通路中磷酸化NF-κB蛋白表达的影响;ELISA法检测非Cp G-ODN分子对Cp G-1826刺激Raw264.7细胞诱发的炎症因子TNF-α和IL-6的影响;免疫荧光检测Cp G-c41与TLR9的共定位情况以及Cp G-c41对Cp G-1826与TLR9结合的影响。结果 Cp G-c41抑制Cp G-1826诱导的炎症因子TNF-α和IL-6的释放(P0.01);Cp G-c41抑制TLR9信号通路中NF-κB的磷酸化表达;非Cp G-ODN不影响Cp G-1826诱导TLR9释放TNF-α和IL-6;Cp G-c41通过与TLR9竞争性结合抑制Cp G-1826与TLR9识别。结论 Cp G-c41通过竞争性结合TLR9干扰TLR9-My D88信号通路的活化。     

胆红素对脂多糖引起的腹膜炎及腹腔免疫细胞功能的影响

目的探讨胆红素(bilirubin)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的腹膜炎中腹腔炎性因子分泌,以及腹膜巨噬细胞和Raw264.7细胞功能的影响。方法构建LPS诱导的小鼠腹膜炎模型,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠腹腔灌洗液上清液中炎性因子(IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6)的含量;分离培养小鼠腹膜巨噬细胞并进行分组处理,培养Raw264.7细胞进行分组处理。采用MTT法检测不同处理的腹膜巨噬细胞与Raw264.7细胞的活性;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测不同处理的腹膜巨噬细胞与Raw264.7细胞中Nlrp3和IL-1βmRNA的表达情况;免疫印迹法(Western blot)检测不同处理的腹膜巨噬细胞中Nlrp3、IL-1β和caspase-1蛋白表达,Raw264.7细胞中Nlrp3、IL-1β、IκBα和p-p65蛋白表达,以及Raw264.7胞质与胞核中p50、p65和p-p65蛋白表达水平;免疫荧光染色检测p-p65蛋白在不同处理的Raw264.7细胞胞质与胞核中的表达情况。结果在LPS诱导的小鼠腹膜炎模型中,注射胆红素的小鼠腹腔灌洗液中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的含量明显降低。10μmol/L胆红素处理腹膜巨噬细胞后对细胞活性无影响;10μmol/L胆红素预处理可以显著抑制脂多糖诱导的腹膜巨噬细胞中Nlrp3、IL-1βmRNA和Nlrp3、IL-1β、caspase-1蛋白的表达。5μmol/L、10μmol/L胆红素处理Raw264.7细胞后对细胞活性无影响;胆红素呈剂量依赖性地抑制脂多糖诱导的Raw264.7细胞中Nlrp3、IL-1βmRNA和蛋白表达水平,并抑制IκBα蛋白表达降低与p-p65蛋白表达升高;10μmol/L胆红素预处理抑制了脂多糖诱导的Raw264.7细胞核中p50、p65和p-p65蛋白表达升高以及p-p65从细胞质向细胞核的转移。结论胆红素可抑制脂多糖引起小鼠腹膜炎中腹腔灌洗液中炎性因子的分泌,并抑制腹膜巨噬细胞和Raw264.7细胞中Nlrp3炎性体活化,该作用可能是通过抑制NF-κB通路激活实现的。     

甲基转移酶样蛋白3(METTL3)通过NF-κB信号通路促进小鼠巨噬细胞活化和炎症反应

目的研究参与腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰(m~6A)的甲基转移酶样蛋白3(METTL3)在巨噬细胞活化中的作用。方法体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,并以1μg/mL脂多糖(LPS)刺激0、 2、 4、 6 h,检测METTL3的表达情况。设计合成的针对小鼠METTL3的小干扰RNA(siRNA)敲低METTL3的表达,通过实时定量PCR和Western blot法检测干扰效率;利用siRNA下调METTL3表达48 h后,以1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞,采用实时定量PCR检测白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、 IL-12、IL-1β的mRNA水平, Western blot法检测核因子κB (NF-κB)信号通路中p65和磷酸化p65蛋白水平。结果 LPS刺激后RAW264.7细胞METTL3的表达上调,设计合成的METTL3 siRNA能有效敲低METTL3的水平。敲低METTL3后,巨噬细胞LPS刺激诱导表达的IL-6、 IL-12、 TNF-α和IL-1β显著降低,同时伴有NF-κВ信号通路p65蛋白的磷酸化水平降低。结论 METTL3通过激活NF-κВ信号通路促进LPS刺激的巨噬细胞活化和炎症反应。     

三百棒通过调控TLR4/NF-κB信号通路对脂多糖诱导的RAW264.7细胞极化的影响

目的：探讨三百棒醇提物(TAAE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7极化趋向以及其对炎症反应的影响。方法：用LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型。CCK-8法检测细胞活力;ELISA检测细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)的水平;Griess法检测细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的分泌情况;荧光染色双标法观察巨噬细胞的极化状态;免疫荧光染色检测NF-κB定位及表达;Transwell检测TAAE对RAW264.7细胞迁移和趋化性的影响;RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB和TLR4的mRNA水平;Western blot检测iNOS、COX-2、TLR4、NF-κB、p-NF-κB、IκBα和p-IκBα蛋白水平。使用TLR4通路抑制剂TAK-242进一步验证TAAE对TLR4/NF-κB信号通路的影响。结果：与模型组相比较,TAAE降低LPS诱导的炎症模型RAW264.7细胞中M1型促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)及NO水平,促使M2型抑炎因子(IL-10和Arg-1)分泌...     

下调Bcl-2家族蛋白促进MTB感染的小鼠巨噬细胞系凋亡

目的探讨Mcl-1shRNA靶向下调Mcl-1的表达后,Bcl-2家族蛋白对不同毒力结核杆菌感染的小鼠Raw264.7巨噬细胞凋亡的调控作用。方法用XJ-MTB、H37Rv、H37Ra和卡介苗(BCG)感染小鼠Raw264.7巨噬细胞,并用Mcl-1 shRNA作用于感染的巨噬细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2家族蛋白Mcl-1和Bax的表达;实时荧光定量PCR检测Mcl-1、Bcl-2、Bax、caspase-3与细胞色素C mRNA的表达。结果 1)不同毒力的MTB感染可诱导小鼠Raw264.7巨噬细胞的凋亡,靶向下调Mcl-1的表达可显著提高XJ-MTB和H37Rv感染的宿主巨噬细胞的凋亡率。2)XJ-MTB和H37Rv感染可显著上调Bcl-2家族抗凋亡成员Mcl-1与Bcl-2的表达,应用Mcl-1 shRNA沉默Mcl-1基因后Mcl-1与Bcl-2水平显著下降,同时增高Bax的表达。3)不同毒力的MTB感染小鼠Raw264.7巨噬细胞后caspase-3和细胞色素C表达升高,靶向下调Mcl-1可以进一步上调感染组caspase-3和细胞色素C的表达。结论 MTB感染后小鼠Raw264.7巨噬细胞中Bcl-2家族蛋白与基因的表达水平与菌株毒力相关,应用Mcl-1shRNA下调Mcl-1的表达可以促进宿主巨噬细胞的凋亡。     

洛美利嗪调控小鼠巨噬细胞极化的机制研究

目的:探究洛美利嗪对小鼠巨噬细胞M1型和M2型极化的调控作用及分子机制。方法:采用RTqPCR及Western blot实验检测洛美利嗪对小鼠骨髓来源的巨噬细胞和Raw 264.7小鼠巨噬细胞M1和M2型极化的影响;Western blot实验检测洛美利嗪对调控巨噬细胞极化的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κB(NF-κB)和信号转导及转录激活因子6(STAT6)信号通路的影响。结果:洛美利嗪能够显著抑制脂多糖(LPS)诱导的M1型巨噬细胞炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和IL-1β的产生(P0.01),且剂量依赖性地降低M1型极化标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达(P0.05),同时促进IL-4诱导的M2型巨噬细胞标志物几丁质酶3样蛋白3(CHI3L3/Ym-1)、Fizz-1(found in inflammatory zone-1)和精氨酸酶1(Arg-1)的mRNA和蛋白表达(P0.05)。洛美利嗪能够剂量依赖性地抑制MAPK信号通路中p38 MAPK、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶1/2(JNK1/2)的磷酸化以及NF-κB信号通路中NF-κB p65的磷酸化,并促进核因子κB抑制因子α(IκBα)的表达(P0.05),进而介导巨噬细胞极化。结论:洛美利嗪可以通过调控MAPK和NF-κB信号通路进而剂量依赖性地抑制小鼠巨噬细胞M1型极化,同时洛美利嗪还可以显著促进M2型极化。     

土荆皮乙酸对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应及M1表型偏移的抑制作用

目的初步探讨土荆皮乙酸(PLAB)对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞抗炎作用及影响M1表型偏移的分子机制。方法 LPS诱导RAW264.7细胞建立体外炎症模型,给予0.5μmol/L PLAB和1μmol/L过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)阻滞剂GW9662处理。流式细胞术检测细胞周期变化,实时定量PCR检测PPARγ和M1型巨噬细胞标志物白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达,Western blot法检测核因子κB(NF-κB)信号通路相关信号分子水平。结果 PLAB能够明显降低LPS诱导RAW264.7细胞的IL-1β、TNF-α的mRNA水平,上调PPARγ的mRNA水平。下调NF-κB p65、p NF-κB p65、IKKα、IKKβ、p IKKα/β、IκBα、p IκBα的蛋白水平,使RAW264.7细胞阻滞在G0和G2期。GW9662可以抵抗PLAB的抗炎作用。结论 PLAB抑制LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应并抑制巨噬细胞向M1表型偏移,与影响细胞周期分布、调控NF-κB/PPARγ通路有关。     

链球菌蛋白对RAW264.7小鼠巨噬细胞免疫学活性的调节作用

目的:探讨链球菌蛋白对RAW264.7小鼠巨噬细胞免疫活性调节及其相关作用机制.方法:不同浓度的链球菌蛋白与RAW264.7小鼠巨噬细胞共同作用后,采用MTT 法检测细胞的增殖活化;吞噬中性红试验观察巨噬细胞的吞噬功能;生物化学法检测巨噬细胞上清液中TNF-α和IL-6 的含量;RT-PCR法检测细胞中TNF-α、IL-6和Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)的mRNA表达情况;流式细胞术检测细胞表面TLR2和TLR4的表达强度.结果:链球菌蛋白对巨噬细胞的生长增殖和吞噬功能有较强的刺激作用(P<0.05),促进TNF-α和IL-6的表达和分泌(P<0.05),并可上调巨噬细胞表面模式识别受体TLR2和TLR4的表达(P<0.05).结论:链球菌蛋白通过刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖,增强细胞吞噬活性以及诱导细胞因子的产生等发挥其免疫调节作用.     

TREM-1促进巨噬细胞的迁移并参与脂多糖诱导的小鼠心肌功能障碍

目的探讨髓系细胞触发受体-l(triggering receptor expressed oil myeloid cells-1,TREM-1)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠心肌功能障碍的作用以及对巨噬细胞RAW264.7迁移的影响。方法将健康C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组、LPS组、LPS+LP17组、LPS+TAK-242组并进行相应处理,6 h后超声心电图检测小鼠心功能指标,12 h取心肌组织HE染色观察病理改变,免疫组化染色观察巨噬细胞表面分子F4/80阳性表达,ELISA检测血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及IFN-γ的表达情况,实时荧光定量PCR检测TREM-1、BNP以及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的mRNA水平;培养巨噬细胞RAW264.7,将细胞随机分为正常组、LPS组、LP17+LPS组、TAK-242+LPS组并进行对应处理,实时荧光定量PCR检测TREM-1与TLR4的mRNA水平,ELISA检测细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及IFN-γ的表达情况,Transwell小室观测RAW264.7细胞迁移情况,蛋白免疫印迹检测RAW264.7中TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白水平。结果与对照组相比,超声心电图检测结果显示LPS组小鼠的EF与FS下降,LVD增大,IVS减小,LVPW变薄,变化均显著(P0.05),实时荧光定量PCR结果显示TREM-1 mRNA与BNP mRNA表达水平上升(P0.05),免疫组化染色法显示F4/80有大量阳性表达(P0.01),ELISA检测显示炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的含量增加(P0.05),实时荧光定量PCR检测也表明这些炎性因子mRNA水平升高(P0.05);与LPS组小鼠相比,注射TREM-1抑制剂LP17使EF、FS上升,有效抑制了LVD增大、IVS减小以及LVPW变薄的现象(P0.05),TREM-1 mRNA与BNP mRNA表达水平均降低(P0.05),心肌损伤减轻,F4/80阳性表达减少(P0.01),炎症因子水平也明显下降(P0.05),与注射TLR4抑制剂TAK-242的效果一致。与对照组相比,LPS诱导RAW264.7细胞后,细胞中TREM-1 mRNA与TLR4 mRNA水平升高(P0.05),炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的含量增加(P0.05),细胞大量迁移(P0.01),细胞中TLR4、MyD88、NF-κBp65、p-IκBα蛋白水平升高(P0.05);与LPS组相比,TREM-1抑制剂LP17预处理后再给予LPS诱导,细胞中TREM-1 mRNA与TLR4 mRNA水平降低(P0.05),炎症因子的含量下降(P0.05),RAW264.7细胞迁移被抑制(P0.01),TLR4、MyD88、NF-κBp65、p-IκBα蛋白水平也明显降低(P0.05)。结论给小鼠注射TREM-1抑制剂可有效减轻LPS诱导的心肌功能障碍,抑制RAW264.7细胞TREM-1表达可抑制细胞的迁移,TLR4/NF-κB途径可能参与了这一过程。     

乌骨藤提取物通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制黑色素瘤细胞的活力并诱导细胞凋亡

目的:探究乌骨藤提取物(Marsdenia tenacissima extract,MTE)对黑色素瘤细胞活力及凋亡的作用及机制。方法:用不同浓度(0、50、100和200 mg/L) MTE处理小鼠皮肤黑色素瘤B16-F10细胞24 h或不同浓度MTE处理不同时间(0、24、48、72和96 h),MTT法检测细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞增殖、凋亡和PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达,同时检测通路激动剂胰岛素样生长因子1(IGF-1)处理细胞后p-PI3K及细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达。结果:根据预实验结果,选择MTE作用时间为72 h。MTE浓度为100 mg/L和200 mg/L时能明显抑制B16-F10细胞活力及增殖相关蛋白Ki67和PCNA的表达,并且还可诱导B16-F10细胞凋亡,提高凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白水平;同时,MTE还可显著降低p-PI3K、p-AKT和mTOR的蛋白水平;此外,激动剂IGF-1可明显减弱MTE抑制细胞活力及诱导细胞凋亡的作用。结论:MTE可通过下调PI3K/AKT/mTOR通路活性抑制黑色素瘤细胞活力,诱导细胞凋亡。     

IL-8对OX-LDL诱导的RAW264.7株作用的研究

目的探讨白细胞介素8（IL-8）对OX-LDL诱导的小鼠单核巨噬细胞264.7细胞株（RAW264.7）的作用。方法以IL-8作用于OX-LDL诱导RAW264.7细胞株,48 h后收集细胞和上清培养液,分别用流式细胞仪检测细胞表位CD14、CD34、CD86及其早、晚期凋亡率;用RT-PCR法检测细胞内IL-8 mRNA的表达水平;用Western bot检测IL-8 mRNA表达蛋白的量;用ELISA方法检测上清液IL-1β、IL-10的量。结果与对照组相比,实验组的CD14、CD34表位表达及晚期凋亡明显增多（P〈0.05）,而对CD86、早期凋亡影响不明显（P〉0.05）,IL-8 mRNA及其表达的蛋白量明显升高,上清培养液中IL-1β增多（P〈0.05）,IL-10减少（P〈0.05）。结论 IL-8致动脉粥样硬化（AS）作用可能是部分通过上调单核巨噬细胞表面CD14、CD34表位表达,促进IL-8 mRNA及其表达蛋白的量,促进IL-1β、抑制IL-10的分泌,并促进其晚期凋亡,参与AS的炎症反应。     

α-硫辛酸降低脂多糖诱导的Raw264.7细胞TNF-α的分泌

目的观察α-硫辛酸(ALA)对脂多糖(LPS)在体外诱导的Raw264.7细胞TNF-α释放及机制。方法用ALA或者ALA联合ERK或NF-κB的抑制剂或者激活剂预处理2 h,再用LPS(1 mg/L)体外刺激巨噬细胞Raw264.7;采用MTT法检测ALA对Raw264.7细胞活力影响,利用ELISA方法对Raw264.7释放在培养上清中的细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)的浓度,及用Western blot方法检测T-p ERK、p ERK和NF-κB的表达。结果 ALA可抑制LPS诱导的Raw264.7细胞TNF-α表达(P0.05),用ALA联合ERK或NF-κB的激活剂预处理后可减弱ALA产生的抑制效果(P0.05)。同时ALA抑制LPS诱导的Raw264.7细胞p ERK和NF-κB的表达(P0.05),用ALA联合ERK或NF-κB的抑制剂预处理后可加强ALA产生的抑制效果(P0.05)。结论 ALA可能通过抑制LPS诱导的Raw264.7细胞的ERK和NF-κB信号通路来抑制TNF-α释放。     

TP53BP2/ASPP2通过p53非依赖性方式激活mTOR通路抑制HepG2人肝癌细胞自噬

目的研究肿瘤蛋白p53结合蛋白2/p53凋亡刺激蛋白2(TP53BP2/ASPP2)对HepG2人肝癌细胞自噬的调节作用和机制。方法通过腺病毒、慢病毒感染HepG2细胞上调或下调细胞中ASPP2的表达, HepG2细胞继续在不含胎牛血清的培养基中培养24 h,通过Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 beclin1、 P62、自噬相关基因5(ATG5)、 ATG7和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白mTOR、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、真核转录起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、磷酸化的4EBP1(p-4EBP1)、核糖体蛋白S6、磷酸化的S6(p-S6)、核糖体S6激酶B1(RPS6KB1/p70S6K)、磷酸化的p70S6K(p-p70S6K)的蛋白表达,荧光显微镜检测细胞表达的绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(GFP-LC3)融合蛋白。同时,使用慢病毒感染不表达p53的Hep3B细胞,敲低细胞中的ASPP2水平, Western blot法检测Hep3B细胞ASPP2和mTOR通路相关蛋白mTOR、 p-mTOR、 4EBP1、 p-4EBP1、 S6、 p-S6、 RPS6KB1/p70S6K、 p-p70S6K的蛋白表达。结果当ASPP2的表达上调时, mTOR复合物1(mTORC1)通路被激活,并且自噬相关蛋白的表达和自噬体的数量减少。在下调ASPP2表达后, mTORC1通路受到抑制,自噬相关蛋白的表达水平和自噬体的数量增加。在p53表达沉默的Hep3B细胞中,当ASPP2下调后, mTORC1途径仍然受到抑制。结论 ASPP2以p53非依赖性方式激活mTOR通路抑制HepG2人肝癌细胞自噬。     

炎症状态下NF-κB-mTOR通路及转录因子RUNX1调控肾小管上皮细胞DC-SIGN表达研究

探讨炎症状态下NF-κB通路、mTOR通路以及转录因子RUNX1对肾小管上皮细胞DC-SIGN表达调控。体外培养肾小管上皮细胞株(HK-2)并经TNF-α刺激,分别给予NF-κB抑制剂(BAY 11-7082)和mTOR抑制剂(Rapamycin)干预。采用免疫印迹试验和实时定量PCR法检测HK-2细胞DC-SIGN表达;免疫印迹试验检测mTOR的磷酸化水平。用上述经TNF-α刺激的HK-2以及建立的肾炎损伤小鼠模型,以实时定量PCR法检测HK-2细胞以及分离的模型鼠肾小管上皮细胞中RUNX1表达。进一步利用HK-2构建过表达RUNX1稳定转染细胞株并经TNF-α刺激,实时定量PCR法检测RUNX1和DC-SIGN表达。结果显示,HK-2经TNF-α刺激模拟炎症状态下,可促进mTOR磷酸化并诱导DC-SIGN表达;NF-κB抑制剂和mTOR抑制剂均能抑制HK-2细胞的DC-SIGN表达,NF-κB抑制剂亦可抑制mTOR的磷酸化。还发现炎症因素刺激下,人和小鼠肾小管上皮细胞体内体外均明显表达RUNX1,且过表达RUNX1的HK-2细胞稳转株显著表达DCSIGN,并在TNF-α刺激下可进一步上调DC-SIGN表达。本研究表明,肾脏微炎症状态下,NF-κB-mTOR通路以及转录因子RUNX1均参与了肾小管上皮细胞DC-SIGN的表达调控。提示此过程中,NF-κB通路作为mTOR上游通路,通过激活后者参与DC-SIGN表达,而转录因子RUNX1可能是启动DC-SIGN表达的关键调控因素。     

白藜芦醇抑制脂多糖诱导破骨前体细胞Raw264.7的激活

目的探讨白藜芦醇(Res)对脂多糖(LPS)诱导的破骨前体细胞Raw 264.7细胞系释放炎性细胞因子的抑制作用。方法采用LPS刺激Raw 264.7细胞构建炎症模型,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定细胞,采用MTT检测Res对Raw 264.7细胞的毒性影响,免疫荧光双标以及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测不同浓度Res(1μmol/L和5μmol/L)对细胞炎性因子:肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)与细胞炎性蛋白酶:诱导型一氧化氮合酶(i NOS)和环氧合酶-2(COX-2)、炎性信号蛋白核因子-κB(NF-κB)蛋白与mRNA的表达变化。结果不同浓度的Res(1μmol/L和5μmol/L)在翻译水平和转录水平上明显抑制了LPS诱导的细胞炎性蛋白酶i NOS和COX-2表达,同时了抑制细胞炎性因子IL-1β与炎性信号蛋白NF-κB的上调。结论 Res可能通过NF-κB调控LPS诱导的Raw 264.7细胞炎性细胞因子的释放进而抑制破骨前体细胞的激活,进而具有抗骨质疏松的作用。     

组蛋白的制备及其对巨噬细胞的影响

 目的： 用不同方法制备组蛋白并观察组蛋白在体外对巨噬细胞活力及细胞因子释放的影响。
方法： 用基因克隆的方法构建组蛋白H3和H4的原核表达质粒,分别表达和纯化带谷胱甘肽S-转移酶（GST）和组氨酸（His）标签的组蛋白（GST-H3、GST-H4、His-H3和His-H4）;用高盐法提取真核细胞（RAW264.7和293F细胞）组蛋白;用上述不同来源组蛋白（7.5~50 mg/L）刺激巨噬细胞4 h,利用MTT和流式细胞术检测巨噬细胞活力;用液相芯片方法检测不同来源组蛋白对巨噬细胞释放在培养上清中的细胞因子白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的浓度。
结果： His-H3/H4和真核细胞来源的组蛋白明显降低细胞活性,诱导RAW264.7细胞发生晚期凋亡和坏死;不同来源组蛋白对RAW264.7细胞释放IL-6和TNF-α均有不同程度的促进作用。
结论： 原核表达His-H3、His-H4及真核细胞提取的组蛋白均可抑制巨噬细胞活力,诱导巨噬细胞发生晚期凋亡和坏死。组蛋白可能通过促进炎症细胞因子的释放参与了炎症反应过程。     

N-乙酰半胱氨酸酰胺对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症的保护作用及机制研究北大核心CSCD

目的研究N-乙酰半胱氨酸酰胺(NACA)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症的保护作用及作用机制,为NACA治疗脓毒症提供理论依据。方法CCΚ-8法检测NACA和N-乙酰半胱氨酸(NAC)对RAW264.7细胞活力的影响;采用ELISA检测NACA和NAC对LPS诱导的RAW264.7细胞上清中TNF-α和IL-6水平;qRT-PCR检测NACA对LPS诱导的RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、ATF4、CHOP的mRNA表达的影响;Western blot检测NACA对LPS诱导的RAW264.7细胞中TLR4/NF-κB及PERΚ/ATF4/CHOP信号通路中关键蛋白表达的影响。结果0.1~5 mmol/L的NACA和NAC对RAW264.7细胞活力无明显的影响(P>0.05)。1 mmol/L和5 mmol/L的NACA和NAC可显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞上清中TNF-α和IL-6的水平(P<0.01),且NACA的降低效果优于统计量的NAC。1 mmol/L和5 mmol/L的NACA也可显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、ATF4、CHOP mRNA的表达(P<0.05、P<0.01)。Western blot结果表明,1 mmol/L和5 mmol/L的NACA可显著降低TLR4、p-IκB、p-65、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、Bip和CHOP蛋白的表达(P<0.05、P<0.01)。结论NACA可能通过TLR4/NF-κB及PERΚ/ATF4/CHOP信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,为NACA治疗脓毒症的抗炎性药物筛选提供了实验依据。     

中药牛膝提取物抗肿瘤活性的初步研究

目的　探讨中药牛膝提取物的抗肿瘤活性及其作用机制。方法　MTT法检测细胞抑制率;流式细胞仪分析细胞周期及凋亡情况;分别用生物化学法和ELISA法检测巨噬细胞因子TNF α和IL- 6的表达;用RT -PCR法检测巨噬细胞因子IL 6mRNA表达。结果　牛膝提取物在体外对两种肿瘤细胞株的增殖具有明显抑制作用,量效、时效关系显著(P <0 .0 1) ,细胞周期停滞于G0 G1 期,诱导细胞凋亡可能是其发生作用的机制之一;牛膝提取物虽然在体外不能促进小鼠脾细胞的生长增殖,但对巨噬细胞的吞噬功能却有较强的刺激作用(P <0 .0 1) ,并可促进细胞因子TNF -α和IL- 6的产生以及IL- 6mRNA的表达。结论　该提取物具有抗肿瘤作用,不仅对免疫功能没有抑制作用,而且可以通过延缓肿瘤细胞周期、诱导凋亡、增强巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用及分泌细胞因子如TNF- α、IL -6等参与其抗肿瘤机制。