RAD51相关蛋白1在宫颈癌组织中的表达及通过TGF-β/Smad 通路 参与调控人宫颈癌细胞的增殖和凋亡*

目的：探讨RAD51相关蛋白1（RAD51AP1）通过调节转化生长因子β（TGF-β）/Smad 信号通路对人宫颈 癌细胞（SiHa）增殖和凋亡的影响。方法：收集2018 年7 月至2021 年3 月间南阳市中心医院51 例宫颈癌组织与 癌旁组织标本,免疫组织化学法检测宫颈癌组织RAD51AP1蛋白表达。筛选RAD51AP1高表达宫颈癌细胞系, 体外培养SiHa 细胞,分为对照组、si-RAD51AP1 组（ 转染si-RAD51AP1 质粒）、si-NC 组（ 转染si-NC 质粒）、 抑制剂组（TGF-β/Smad 通路抑制剂LY2109761）、si-RAD51AP1+ 激活剂组（ 转染si-RAD51AP1 质粒+TGF-β/ Smad 通路激活剂人重组TGF-β1）。采用MTT法与平板克隆形成实验检测各组SiHa 细胞增殖;流式细胞术检测 细胞凋亡;实时荧光定量PCR法检测细胞中RAD51AP1、TGF-β1 mRNA 水平;免疫印迹检测细胞中RAD51AP1 蛋白、TGF-β/Smad 通路相关蛋白及增殖、凋亡相关蛋白表达。结果：RAD51AP1在宫颈癌组织与SiHa 细胞系中 均显著高表达;抑制RAD51AP1表达或抑制TGF-β/Smad 通路后,细胞增殖活性、细胞克隆形成率及cyclin D1、 TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3 蛋白表达水平显著减低,细胞凋亡率、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3 蛋白 表达水平显著升高,而抑制RAD51AP1表达基础上使用TGF-β/Smad 通路激活剂后,可部分逆转上述变化。结 论：RAD51AP1在宫颈癌中表达上调,抑制RAD51AP1表达可通过抑制TGF-β/Smad 通路而抑制宫颈癌细胞增殖, 促进细胞凋亡。     

过表达TGF-β1可抑制人宫颈癌细胞系C-33A增殖和促进凋亡

目的研究TGF-β1基因转染对人宫颈癌细胞系(C-33A)增殖和凋亡的影响。方法取增殖状态良好的宫颈癌细胞C-33A,用基因转染的方法建立TGF-β1过表达质粒,用RT-PCR和Western blot法分别检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达及其Bcl-2和Bax的表达;用MTT实验、Transwell小室迁移实验和流式细胞术分别检测细胞的增殖率、迁移率及凋亡率。结果 TGF-β1 mRNA和蛋白在宫颈癌C-33A细胞中的表达低于其他细胞(P0. 05); TGF-β1抑制Bcl-2的表达(P0. 05)、促进Bax的表达(P0. 05);过表达TGF-β1细胞的增殖与迁移速度低于其他细胞(P0. 05),但凋亡速度高于其他细胞(P0. 05),且这种降低与升高均呈时间依赖性。结论过表达的TGF-β1可明显抑制宫颈癌细胞的增殖和促进凋亡。     

锌指蛋白12过表达促进甲状腺癌细胞的增殖并抑制其凋亡

目的探讨SMAD-相互作用锌指蛋白12(ZCCHC12)对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法采用Western blot检测30例甲状腺癌患者癌组织和癌旁组织中ZCCHC12的蛋白表达及细胞中cleaved caspase-3、caspase-9、BMP-2、p-SMAD1、SMAD1和ID3的蛋白表达。ZCCHC12过表达质粒pcDNA3.1-ZCCHC12或抑制质粒ZCCHC12 siRNA转染甲状腺癌细胞系CGTH W-3和FTC-133。MTT法检测细胞增殖。流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 ZCCHC12的表达在甲状腺癌组织较癌旁组织中显著增加(P0.05)。ZCCHC12过表达显著增强了CGTH W-3和FTC-133的细胞增殖、降低了细胞凋亡、抑制了凋亡蛋白cleaved caspase-3和caspase-9的表达并升高了BMP-2、p-SMAD1和ID3的蛋白表达(P0.05)。ZCCHC12抑制质粒则与过表达质粒作用相反。结论 ZCCHC12通过调控BMPs/SMAD通路增强甲状腺癌细胞CGTH W-3和FTC-133的增殖并抑制其凋亡。     

UNC5A基因过表达对膀胱癌T24细胞增殖、转移的影响及其机制探讨

【摘要】　目的　探究UNC5A 基因过表达对膀胱癌T24 细胞增殖、转移及Wnt/ β-catenin 信号通路的影响。方法　选取T24 细胞, 转染UNC5A-pcDNA 和pcDNA-NC, 将细胞随机分为Control 组、pcDNA-NC 组和UNC5A-pcDNA 组。RT-PCR 检测UNC5A mRNA 表达水平; 克隆形成实验检测细胞克隆形成率; 流式细胞术检测细胞凋亡率; Transwell 检测细胞侵袭细胞数; Western 印迹检测UNC5A、Wnt1、β-catenin 蛋白表达水平; 加入Wnt/ β-catenin 信号通路激活剂LiCl 检测各组细胞增殖、凋亡、侵袭情况。结果　与Control 组比较, UNC5A-pcDNA 组UNC5A mRNA 和蛋白表达水平升高(P< 0. 05), 克隆形成率降低(P< 0. 05), 细胞凋亡率升高(P<0. 05), 侵袭细胞数降低(P<0. 05), Wnt1、β-catenin 蛋白表达水平降低(P< 0. 05)。加入Wnt/ β-catenin 信号通路激活剂LiCl 则能逆转过表达UNC5A 对T24 细胞增殖、侵袭的抑制作用, 凋亡促进作用。结论UNC5A 基因过表达可能通过抑制Wnt/ β-catenin 信号通路的活化抑制T24 细胞增殖、侵袭, 并诱导细胞凋亡。     

CXCL1通过调控JAK2/STAT3信号通路促进宫颈癌细胞增殖和转移

目的 探究CXCL1在宫颈癌中的表达及对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法 使用GEPIA在线数据库分析CXCL1在宫颈癌组织和正常组织中的表达水平，分析其与宫颈癌患者总生存期的关系。qRT-PCR检测CXCL1 mRNA在宫颈癌细胞(C-33A和Hela细胞系)和正常宫颈上皮细胞系(HcerEpic细胞系)中的表达。将CXCL1过表达质粒转染进宫颈癌细胞系中，CCK-8法检测CXCL2对宫颈癌细胞增殖的影响，TUNEL实验检测CXCL1对宫颈癌细胞凋亡的影响，Transwell实验检测CXCL1对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响，Western blot实验检测CXCL2对宫颈癌细胞系中p-JAK2和p-STAT3蛋白表达的影响。结果 CXCL1在宫颈癌组织中的表达水平显著高于正常组织，且高表达CXCL1与宫颈癌患者总生存期较低有关。高表达CXCL1可显著促进宫颈癌细胞增殖，迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡；促进p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达。结论 CXCL1通过调控JAK2/STAT3信号通路促进宫颈癌细胞增殖和转移，并抑制细胞凋亡。     

miR-27a-3p靶向SnoN抑制高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT的作用

目的研究miR-27a-3p对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT的影响并探讨其机制。方法运用qRT-PCR检测HK2细胞中miR-27a-3p的表达;将HG+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、HG+anti-miR-27a-3p组(转染anti-miR-27a-3p)、HG+pcDNA组(转染pcDNA)、HG+pcDNA-SnoN组(转染pcDNA-SnoN),均用脂质体转染至HK2细胞,并用D-葡萄糖(30mmol/L)处理48 h;Western blot检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、SnoN、TGF-β1、p-Smad2的蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果与低糖对照组相比,HG组细胞中miR-27a-3p显著升高,SnoN显著降低,Ecadherin、p-Smad2显著降低,N-cadherin、TGF-β1表达显著升高,(P0.05);抑制miR-27a-3p、过表达SnoN均可上调Ecadherin,下调N-cadherin,抑制HK2细胞EMT;SnoN是miR-27a-3p的靶点。过表达SnoN可下调TGF-β1,上调p-Smad2,失活TGF-1信号通路。结论 miR-27a-3p可抑制高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT,其机制可能与靶向SnoN失活TGF-β1信号通路有关,将可为糖尿病肾病的治疗提供依据。     

miR-30c抑制宫颈癌细胞恶性表型的分子机制研究

目的:探讨微小RNA(miR)-30c过表达抑制宫颈癌细胞恶性表型的分子机制。方法:运用Lipofectamine 2000转染法将pGenesil-1-miR-30 c质粒转染宫颈癌细胞系C33A、HeLa、SiHa和CaSki,以转染p-Geresil-1的细胞为阴性对照;运用TaqMan real-time PCR检测各组细胞中miR-30c的表达水平;采用MTT法、集落形成实验、Transwell法、Annexin V-FITC及流式细胞术分别测定细胞活力抑制率、集落形成能力、迁移率及凋亡率;Western blot检测Bax、Bcl-2、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-13和金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)的蛋白表达水平。结果:转染p Genesil-1-miR-30c质粒的宫颈癌细胞系中miR-30c表达水平均显著高于阴性对照组(P0.01);过表达miR-30 c的宫颈癌细胞活力抑制率显著高于阴性对照组(P0.05),细胞集落形成率和迁移率显著低于阴性对照组(P0.05);流式细胞术检测结果显示,miR-30c过表达的宫颈癌细胞凋亡率显著高于对照组(P0.05);Western blot结果显示miR-30 c过表达促进Bax和TIMP-1蛋白的表达,而抑制Bcl-2和MMP-13蛋白的表达(P0.05或P0.01)。结论 :miR-30 c过表达抑制宫颈癌细胞活力和迁移,诱导宫颈癌细胞凋亡,其机制与激活细胞凋亡通路及抑制MMP-13表达有关。     

PDCD5通过Wnt/β-catenin通路抑制肾细胞癌侵袭转移及其机制研究

目的探讨肾细胞癌(RCC)患者PDCD5的表达水平及其参与调控RCC侵袭与转移的可能机制。方法利用免疫组化检测RCC标本与癌旁组织中PDCD5的蛋白表达水平,同时分析PDCD5与疾病分期、预后的相关性;利用transwell及划痕实验检测PDCD5对肾癌细胞系A498侵袭与转移的影响;利用Western blot检测A498细胞转染PDCD5后MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin及Wnt/β-catenin通路的变化。结果 (1)与癌旁组织相比,RCC标本中PDCD5明显下调(P0.001),且与疾病分期及预后正相关;(2)PDCD5明显抑制了肾癌细胞系A498的转移与侵袭能力(P0.01);(3)PDCD5通过抑制A498细胞系中MMP2、MMP9及N-cadherin的表达水平,增强E-cadherin的表达水平调控EMT转化,同时Wnt/β-catenin通路关键蛋白下调。结论 PDCD5通过调控Wnt/β-catenin通路影响肾细胞癌EMT转化,负性调控了RCC病人的侵袭与转移进程。     

TGF-β1通过激活NOX4/ROS通路促进宫颈癌细胞的侵袭和迁移

目的探讨转化生长因子β1/尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶/活性氧(TGF-β1/NOX4/ROS)信号通路在宫颈癌细胞侵袭和迁移中的作用。方法采用5 ng/mL TGF-β1处理培养的SiHa、 CaSki、 HeLa、 C4-I和C33A宫颈癌细胞4 h或8 h, 2′, 7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色结合流式细胞术检测处理前后SiHa、 CaSki、 HeLa、 C4-I和C33A宫颈癌细胞ROS水平;转染NOX4小干扰RNA(NOX4-siRNA)或加入NOX4信号通路抑制剂二亚苯基碘氯化物(DPI), Western blot法检测宫颈癌HeLa细胞NOX4蛋白水平, Transwell~(TM)侵袭和迁移实验检测TGF-β1对宫颈癌细胞侵袭和迁移能力的影响。结果 TGF-β1显著上调HPV阳性SiHa、 CaSki、 HeLa和C4-I宫颈癌细胞NOX4蛋白表达,促进ROS产生,并增强宫颈癌细胞的侵袭和迁移性;敲低NOX4基因或使用NOX4通路抑制剂DPI可逆转这种作用。结论 TGF-β1激活NOX4/ROS信号通路增强宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。     

SCUBE2过表达通过Wnt/β-catenin抑制结直肠癌细胞上皮-间质转化

目的:研究信号肽-CUB-EGF结构域蛋白2(SCUBE2)对结直肠癌细胞上皮-间质转化(EMT)的影响及可能的分子机制。方法:首先,用real-time PCR与Western blot法检测人结直肠癌HCT116细胞和正常人结直肠上皮FHC细胞SCUBE2的表达;HCT116细胞转染GV144-SCUBE2质粒过表达SCUBE2后,MTT、Transwell和流式细胞术分别检测其对细胞活力、迁移和凋亡的影响。转染GV144-SCUBE2质粒6 h后加入10μg/L重组转化生长因子(TGF)-β1蛋白继续培养48 h,real-time PCR或者Western blot法检测EMT标志物[E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snail]、β-catenin、c-Myc和细胞周期蛋白(cyclin)D1的表达。随后,在HCT116细胞中使用Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂(Li Cl)或抑制剂XAV93920并加入TGF-β1且过表达SCUBE2,检测Wnt/β-catenin通路激活或阻断后对HCT116细胞EMT的影响。结果:HCT116细胞中SCUBE2的表达明显低于FHC细胞;过表达SCUBE2能够抑制HCT116细胞的活力与迁移,但是对其凋亡影响不大;SCUBE2增加了E-cadherin的表达,降低了TGF-β1诱导的vimentin、Snail、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表达,XAV93920增强了SCUBE2对EMT的影响,而Li Cl阻碍SCUBE2对EMT的影响。结论:过表达SCUBE2能够抑制结直肠癌细胞的生长与迁移,抑制其EMT的发生,这一过程可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥作用的。     

上调miRNA145对肝癌细胞的作用及其机制研究

目的:探讨微小RNA145(miRNA145)对肝癌细胞生长、凋亡及侵袭转移的影响。方法:实验将Hep G2细胞随机设置为3组:空白对照组、空质粒组及转染组,转染后real-time PCR法检测验证各组细胞miRNA145及N-钙黏蛋白(N-cadherin)mRNA的表达,并用Western blot检测miRNA145目标蛋白N-钙黏蛋白的表达,MTS增殖实验检测各组细胞的生长情况,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡率,Transwell法检测各组细胞的侵袭转移能力。结果:Real-time PCR结果证实转染组细胞miRNA145表达比空质粒组和空白对照组细胞明显增多(P0.05),同时N-钙黏蛋白的表达在转染组细胞中显著减少(P0.05);经Western blot结果证实,转染组细胞中N-钙黏蛋白表达比空质粒组和空白对照组细胞明显减少(P0.05);转染组细胞活性在转染后第2天、第3天均明显下降,70.04%的细胞周期停止在G1期,转染后Hep G2细胞凋亡率明显增高,细胞的侵袭转移能力下降,差异均有统计学意义。结论:上调miRNA145表达能有效抑制肝癌细胞的细胞周期进展和侵袭转移,促进细胞凋亡。     

miR-21 通过靶向TIMP3 调控黑色素瘤细胞的免疫抑制

目的:探讨微小RNA-21(miR-21)是否通过调节金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)的表达影响黑色素瘤细胞分泌免疫抑制因子。方法:实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测黑色素瘤组织和细胞中miR-21的表达水平。脂质体介导的细胞转染法上调或下调黑色素瘤A375细胞中miR-21的表达。ELISA检测细胞培养上清液中IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量。双荧光素酶报告基因实验检测miR-21与TIMP3靶向关系。Western blot检测细胞中TIMP3蛋白表达水平。结果:黑色素瘤组织和不同黑色素瘤细胞株中miR-21的表达量较癌旁组织和正常黑色素细胞明显降低(P0.05)。在A375细胞中转染miR-21 mimic后,细胞中miR-21表达量显著上升,分泌的免疫抑制因子IL-10、TGF-β和VEGF的含量显著升高(P0.05)。转染miR-21 inhibitor后,细胞中miR-21表达量显著降低,分泌的免疫抑制因子IL-10、TGF-β和VEGF的含量显著降低(P0.05)。生物信息学软件预测miR-21和TIMP3存在靶向结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证了miR-21和TIMP3靶向结合关系,miR-21能够负向调节TIMP3蛋白的表达。结论:miR-21能够靶向调控TIMP3的表达影响黑色素瘤细胞分泌的免疫抑制因子IL-10、TGF-β和VEGF的含量。     

RNA干扰HAS2基因表达对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞生物学特性及免疫因子的影响

目的:探讨透明质酸合成酶2(HAS2)基因在多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠表达及RNA干扰其表达对卵巢颗粒细胞活力、凋亡及免疫抑制因子TGF-β1和VEGF表达的影响。方法:建立DHEA致雌性SD大鼠PCOS模型,Western blot检测PCOS大鼠卵巢组织中HAS2的蛋白表达;培养原代PCOS大鼠卵巢颗粒细胞,将合成的靶向抑制HAS2表达的siRNA转染到细胞中,Western blot检测转染效果及转染后48 h各组细胞中免疫抑制因子TGF-β1、VEGF和NF-κB信号通路相关蛋白的表达。CCK8及流式细胞仪分别检测细胞活力和凋亡率。结果:HAS2在PCOS大鼠卵巢组织中高表达,转染si-HAS2的大鼠卵巢颗粒细胞中HAS2的表达显著低于NC组和对照组(P 0. 05);与NC组比较,si-HAS2组细胞活力显著降低,凋亡率增加,TGF-β1、VEGF及NF-κB信号通路p-NF-κB、p-IκBα和下游cyclin D1、survivin的蛋白表达均显著降低(P 0. 05)。结论:HAS2在PCOS大鼠卵巢组织中高表达,抑制大鼠卵巢颗粒细胞中HAS2表达可降低细胞活力,诱导细胞凋亡,下调免疫抑制因子TGF-β1、VEGF及NF-κB信号通路表达。     

LAMA4通过TGF-β1/SMAD路径调控肝癌细胞免疫逃逸因子及促进肝癌细胞凋亡

目的探讨LAMA4调控TGF-β1/SMAD Western blot检测LAMA4在肝癌细胞Huh7和HepG2及正常肝细胞L02中的表达;MMT法和流式细胞技术检测LAMA4和TGF-β1/SMAD信号传导途径对Huh7细胞增殖和凋亡的影响;RT-qPCR和Western blot检测LAMA4对TGF-β1/SMAD信号转导通路和细胞免疫因子TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的影响。结果 RT-qPCR和Western blot检测结果显示:LAMA4在肝癌细胞Huh7和HepG2中mRNA表达显著上调;LAMA4在肝癌细胞Huh7和HepG2中蛋白表达显著上调;沉默LAMA4使TGF-β1和SMAD4表达显著上调,SMAD6、IFN-γ和TNF-α的含量显著降低,过表达LAMA4则结果相反;MMT法和流式细胞技术检测结果显示:敲低LAMA4可使Huh7细胞活力下降,细胞凋亡率增加,而过表达LAMA4则结果相反;Ly364947干扰TGF-β1/SMAD信号传导路径后,Huh7细胞的活力增加,细胞凋亡率显著下降,IFN-γ和TNF-α的含量显著升高,TGF-β1显著降低,且Ly364947可部分逆转沉默LAMA4对肝癌细胞Huh7的免疫逃逸因子和凋亡的调控作用。结论 LAMA4可通过调控TGF-β1/SMAD信号传导途径影响肝癌细胞免疫逃逸和凋亡。     

Pyrin重组蛋白通过TGF-β1/SMAD及Jagged1/Notch1信号通路减轻慢性支气管哮喘小鼠气道炎症及气道重塑

目的探讨pyrin重组蛋白是否通过抑制转化生长因子β1(TGF-β1)/SMAD及Jagged1/Notch1信号通路缓解卵清蛋白(OVA)诱导的慢性哮喘小鼠气道炎症及气道重塑。方法选取雄性BALB/c小鼠32只,分为4组,每组8只。分别为对照组、 OVA模型组、 pyrin重组蛋白治疗组(100μg/kg)、地塞米松(DEX)治疗组(1 mg/kg)。ELISA测定各组小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子的表达, HE染色观察小鼠支气管炎症浸润情况,过碘酸雪夫反应(PAS)染色观察杯状细胞数量变化, Masson染色观察胶原纤维沉积,免疫组织化学染色法观察α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、 TGF-β1和Notch1蛋白在肺组织中表达分布情况, Western blot法检测肺组织中α-SMA、上皮钙黏素(E-cadherin)、 TGF-β1、 SMAD2/3、 SMAD7、 Jagged1、 Notch1、 Hes1蛋白水平。结果 Pyrin重组蛋白能够改善OVA诱导的支气管哮喘小鼠气道炎症反应,抑制杯状细胞的增生及胶原纤维沉积,降低BALF中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、 IL-4、 IL-13含量,抑制肺组织中TGF-β1、 SMAD2/3、 Jagged1、 Notch1、 Hes1、α-SMA的蛋白表达。结论 Pyrin重组蛋白通过下调TGF-β1/SMAD及Jagged1/Notch1信号通路减轻哮喘小鼠气道炎症及气道重塑。     

RNA干扰抑制乙酰肝素酶对肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 探讨抑制乙酰肝素酶表达对人肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 构建靶向人乙酰肝素酶基因短发夹状双链RNA(shRNA)真核表达质粒(pshRNA-Hpa),用脂质体将其转入A549细胞,建立稳定转染细胞株系,经逆转录.PCR和Western blot法检测转染效率后,分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Transwell侵袭实验和流式细胞术(AnnexinV-FITC/PI双染法)检测其对A549细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.采用Western blot法检测转染后磷酸化蛋白激酶B(PKB/Akt-Ser473)的表达.结果 转染pshRNA-Hpa的A549细胞乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达明显低于未处理A549细胞,抑制率分别为54.09%和48.26%,细胞增殖速度减缓,侵袭能力降低,流式细胞术显示早期细胞凋亡率达(12.53±0.34)%,较空白对照组、空载体转染细胞组和阴性对照组明显增加(P＜0.01).同阴性对照质粒相比,转染pshRNA-Hpa的A549细胞Akt-Ser473的磷酸化水平降低52.15%.结论 靶向乙酰肝素酶重组shRNA质粒pshRNA-Hpa能有效抑制A549细胞乙酰肝素酶的表达,并可能通过下调磷酸化蛋白激酶B途径抑制细胞的增殖侵袭、促进细胞的凋亡.     

HMGA2在胃癌细胞上皮-间充质转化中的作用

目的:探讨HMGA2在胃癌细胞上皮-间充质转化(EMT)中的作用及机制。方法:采用Western blot和RT-qPCR实验检测不同分化程度的人胃癌细胞株MKN45、MKN28和SGC7901以及人永生化胃黏膜上皮细胞株GES-1中HMGA2的表达水平;采用脂质体转染法将pcDNA3.0-HMGA2质粒转染至MKN28细胞中,将si-HMGA2干扰片段转染至MKN45细胞中,并采用Western blot和RT-qPCR实验检测转染效率;CCK-8实验检测HMGA2上调对MKN28细胞活力的影响以及HMGA2下调对MKN45细胞活力的影响;采用细胞迁移和侵袭实验检测HMGA2上调对MKN28细胞迁移和侵袭能力的影响;采用Western blot和RT-qPCR实验检测HMGA2过表达对MKN28细胞EMT相关标志蛋白上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表达的影响以及敲减HMGA2表达对MKN45细胞E-cadherin、N-cadherin和vimentin表达的影响;采用RT-qPCR实验检测过表达HMGA2的MKN28细胞Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达的变化。结果:HMGA2在不同分化程度的胃癌细胞中的表达水平是不同的(P0.05)。上调MKN28细胞HMGA2的表达水平能够抑制细胞活力(P0.05);而在MKN45细胞中下调HMGA2的表达水平能够增强细胞活力(P0.05)。上调MKN28细胞HMGA2的表达水平能够促进细胞的迁移和侵袭能力(P0.05),且E-cadherin表达降低,N-cadherin和vimentin表达升高(P0.05);敲减HMGA2在MKN45细胞的表达水平使E-cadherin表达升高,而N-cadherin和vimentin表达降低(P0.05)。上调MKN28细胞中HMGA2的表达水平,细胞内Wnt/β-catenin通路的β-catenin及其下游分子c-Myc和cyclin D1的mRNA表达水平显著增加(P0.05)。结论:HMGA2与胃癌细胞迁移和侵袭能力密切相关,并且能够通过激活细胞内Wnt/β-catenin通路,促进胃癌细胞EMT。     

大黄素阻断SMAD2/3信号通路抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移

目的 探讨大黄素对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)增殖、迁移的影响。方法 体外培养HPASMC,取对数生长期的细胞,分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1联合大黄素处理组。采用CCK-8法检测HPASMC活性,Transwell^TM小室实验和划痕实验检测HPASMC迁移能力;免疫荧光实验检测骨桥蛋白(OPN)、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,Western blot法检测HPASMC的OPN、PCNA的蛋白水平及SMAD家族成员2(SMAD2)和SMAD3的磷酸化水平。结果 与对照组相比,TGF-β1处理组的OPN、PCNA蛋白表达增加,HPASMC增殖和迁移能力增强,SMAD2、SMAD3的磷酸化增强。与TGF-β1组相比,TGF-β1联合大黄素处理组HPASMC的增殖和迁移能力降低,OPN、PCNA蛋白表达减少,SMAD2、SMAD3蛋白磷酸化明显降低。结论 大黄素可抑制HPASMC中TGF-β1上调OPN、PCNA蛋白的表达,抑制TGF-β1诱导的PASMC增殖和迁移,可能与抑制SMAD2/3信号通路有关。     

过表达整合素连接激酶肺癌A549细胞的建立及生物学活性

目的:建立稳定过表达整合素连接激酶(ILK)的肺癌A549细胞模型,探讨ILK过表达对肺癌A549细胞生物学活性的影响。方法:以RT-PCR法扩增人ILK基因,构建pEGFP-ILK重组质粒。经酶切及测序鉴定后,将pEGFP-ILK质粒用脂质体转染肺癌A549细胞,G418压力筛选出稳定转染细胞克隆并扩大培养(A549/pEGFP-ILK组),设pEGFP-C1空质粒转染A549细胞(A549/pEGFP-C1组)及空白A549细胞对照组。用荧光显微镜观察EGFP-ILK融合蛋白的表达及细胞内定位,RT-PCR法检测各组细胞中ILK mRNA的转录水平,Western blot法检测各组细胞中ILK蛋白表达水平,MTT比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况,HE染色观察细胞形态变化。结果:酶切及测序证实,pEGFP-ILK重组质粒构建成功。该质粒转染A549细胞、并经G418压力筛选后,获得了表达绿色荧光蛋白的稳定转染株,ILK基因表达产物主要定位于细胞质内。与对照组相比,A549/pEGFP-ILK细胞ILK的mRNA及蛋白表达水平明显升高,其过表达率分别为218.18%和245.45%(P<0.05);过表达ILK的A549细胞增殖活力显著增强(P<0.05);凋亡水平被显著抑制(P<0.05);过表达ILK的A549细胞的核分裂相增多。结论:成功建立过表达ILK肺癌细胞模型,ILK过表达可促进癌细胞增殖、抗凋亡及核分裂相增多。     

膜联蛋白A5过表达对宫颈癌细胞系SiHa细胞凋亡的影响

目的:构建膜联蛋白A5的重组表达质粒,转染宫颈癌细胞使其过表达后检测宫颈癌细胞的凋亡情况.方法:PcR法从pJLA503膜联蛋白A5中获得膜联蛋白A5基因;磷酸钙共沉淀法转染宫颈癌细胞系SiHa细胞,免疫印迹法和免疫组织化学ABC法检测了细胞中膜联蛋白A5蛋白的过表达;对过表达膜联蛋白A5的细胞采用免疫荧光法检测其细胞凋亡情况.结果:重组质粒中膜联蛋白A5基因序列正确;转染重组质粒后的SiHa细胞过表达膜联蛋白A5蛋白;过表达膜联蛋白A5的SiHa细胞凋亡显著增多.结论:膜联蛋白A5可促进宫颈癌细胞系SiHa细胞的凋亡.