补骨脂素对成骨细胞核因子-κB受体激活配体和骨保护素表达的影响

目的研究补骨脂素(psoralen,PSO)对体外培养的小鼠成骨细胞(OB)分化及核因子-κB受体激活配体(receptor activator of nuclearfactor-κB ligand,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响。方法取第1代BALB/c小鼠颅盖骨成骨细胞,将PSO以0.1、1、10μmol/L3种浓度分别加入新生大鼠颅骨成骨细胞培养液中,MTT法观察各组药物对成骨细胞的增殖作用并绘制细胞生长曲线;用PNPP法测定成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;RT-PCR法检测成骨细胞OPG和RANKL的转录水平。结果细胞生长曲线显示各组成骨细胞数量均随时间延长而增加,中、高浓度PSO能显著提高成骨细胞的ALP活性,促进OPG、RANKL的表达(P<0.05),OPG/RANKL升高(P<0.05)。结论低浓度PSO(0.1μmol/L)对骨更新作用不明显,而中、高浓度PSO(1、10μmol/L)能通过上调OPG、RANKL mRNA表达及OPG/RANKL比例,促进成骨细胞的生成功能,增强骨更新。     

氟对小鼠成骨细胞增殖与分化及骨保护蛋白和核因子κβ受体活化因子配体mRNA 表达的影响

目的 观察氟对体外培养的小鼠成骨细胞增殖、分化、骨保护蛋白(OPG)mRNA及核因子κβ受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达的影响.方法 取出生1～2 d昆明小鼠颅盖骨,分离成骨细胞后进行传代培养.按培养液中加入不同浓度氟化钠(NaF)将成骨细胞分为0(对照)、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3 mol/L组,分别在培养72 h或120 h后检测氟对成骨细胞增殖、分化(碱性磷酸酶,ALP)的影响;提取成骨细胞总mRNA,采用RT-PCR方法分析成骨细胞OPG mRNA、RANKL mRNA表达,并进行半定量分析.组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验.结果 培养72 h后,成骨细胞增殖组间比较差异有统计学意义(F=13.806,P<0.05);与对照组(0.434±0.010)比较,10-7～10-4mol/L组成骨细胞增殖明显增加(0.448±0.010、0.453±0.013、0.454±0.016、0.449±0.018,P均<0.05),10-3 mol/L组成骨细胞增殖降低(0.401±0.009,P<0.05).成骨细胞ALP活性组问比较差异有统计学意义(F=9.021,P<0.05);其中10-7～10-5 mol/L组[(2.447±0.756)×106、(2.603±0.183)×106、(2.687±0.886)×106 U/L]ALP活性明显高于对照组[(1.677±0.682)×106U/L,P<0.05或<0.01];10-4mol/L组[(1.479±0.366)×106 U/L]ALP活性明显低于对照组(P<0.05).OPG mRNA表达组间比较差异有统计学意义(F=11.299,P<0.05);与对照组(11000±0.000)比较,10-7～10-4 mol/L组表达增强(1.058±0.027、1.053 ±0.026、1.088±0.055、1.069±0.008,P<0.05或<0.01),10-3mol/L组表达降低(0.941±0.029,P<0.05).成骨细胞RANKL mRNA表达组间比较差异无统计学意义(F=1.311,P>0.05).RANKL mRNA/OPG mRNA比值,在104～10-5mol/L组逐渐降低,10-4、10-3mol/L组升高,但组间比较差异无统计学意义(F=1.376,P>0.05).结论 氟对小鼠成骨细胞增殖、分化呈双向调节作用,表现为低剂量刺激而高剂量抑制.低剂量染氟可能通过增加成骨细胞OPG的表达来抑制破骨细胞的分化和成熟,抑制骨吸收;而高剂量可能通过降低OPG的表达来促进破骨细胞的分化、成熟,促进骨吸收.

Abstract：

Objective To investigate the effect of sodium fluoride(NaF) on proliferation, differentiation and the mRNA expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor κβ ligand (RAN KL) of mouse osteoblasts. Methods Osteoblasts were isolated from calvarias of Kunming mice born in 1 - 2 d and cultured. Various concentrations of NaF(0, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4, 10-3mol/L) were added to the culture medium, the proliferation and activity of alkaline phosphatase(ALP) was determined after 72 h or 120 h. The expression of OPG mRNA and RANKL mRNA was analyzed by semi-quantification RT-PCR. Difference among groups was analyzed by One-Way AN0VA. Difference between two groups was analyzed by LSD-t test. Results There was significant difference in cell proliferation among groups after 72 h(F = 13.806, P < 0.05). Compared with control group(0.434 ± 0.010) , the proliferation was significantly induced in 10-7 - 10-4 mol/L groups treated osteoblasts (0.448 ± 0.010, 0.453 ± 0.013, 0.454 ± 0.016, 0.449 ± 0.018, all P< 0.05), and was significantly suppressed in 10-3 mol/L group(0.401 ± 0.009, P < 0.05). There was statistic difference in the activity of ALP among groups(F = 9.021, P < 0.05). Compared with control group (1.677 ± 0.682), the activity of ALP significantly increased in 10-7 - 10-5 mol/L groups[ (2.447 ± 0.756) × 106, (2603 ± 0.183) × 106, (2.687 ± 0.886) × 106 U/L, P < 0.05 or P < 0.01 ] and significantly decreased in 10-4 mol/L group[ (1.479 ± 0.366) × 106 U/L, P < 0.05 ]. There was significant difference in the expression of OPG mRNA among groups(F = 11.299, P< 0.05). Compared with control group (1.000 ± 0.000), the expression of OPG mRNA was significantly increased in 10-7 - 10-4 mol/L groups( 1.058 ± 0.027, 1.053 ± 0.026, 1.088 ± 0.055, 1.069 ± 0.008, P < 0.05 or P < 0.01) , while significantly decreased in 10-3 mol/L group (0.941 ± 0.029, P< 0.05). There was no difference in RANKL mRNA expression among groups (F= 1.311, P> 0.05). The ratio of RANKL/OPG decreased with increasing doses of fluoride and increased in 10-4, 10-3 mol/L groups, but there was no difference between groups(F = 1.376, P> 0.05). Conclusions A biphasic pattern of proliferation and differentiation has been induced in mouse osteoblasts, which manifests stimulation effect in low doses and suppression in higher doses. Low doses of sodium fluoride suppress differentiation and maturation of osteoblasts by increasing expression of OPG mRNA, while high doses of sodium fluoride enhance differentiation and maturation of osteoblasts by decreasing expression of OPG mRNA.     

地塞米松对大鼠成骨细胞功能及蛋白激酶B磷酸化的影响

目的研究地塞米松(dexamethasone,Dex)对大鼠成骨细胞功能及Akt磷酸化的影响。方法取新生SD大鼠颅骨体外分离培养的成骨细胞,根据地塞米松作用浓度分为对照组(0 mol/L Dex)、10~(-8)mol/L Dex组、10~(-7)mol/L Dex组、10~(-6)mol/L Dex组干预24 h;应用Akt激动剂SC79进一步验证地塞米松对成骨细胞增生和功能的影响,分为对照组(0 mol/L Dex,0 mol/L SC79)、SC79组(0 mol/L Dex,10μmol/L SC79)、Dex组(10~(-6)mol/L Dex,0 mol/L SC79)、SC79+Dex组(10μmol/L SC79,10~(-6)mol/L Dex)干预24 h。培养结束后,运用Cell Counting Kit-8法检测细胞增生活力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测成骨细胞上清液中ALP的含量,Western blot法检测成骨细胞中ALP、Akt、p-Akt蛋白表达。结果 (1)与对照组相比,10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L Dex组的细胞增生活性均明显下降(A值分别为0.742±0.022、0.598±0.028、0.570±0.025),差异有统计学意义(P0.05)。10~(-8)mol/L地塞米松对成骨细胞增生抑制不明显(P0.05);(2)除10~(-8)mol/L Dex组外,10~(-7)mol/L Dex组、10~(-6)mol/L Dex组上清液中ALP含量均显著低于对照组(ALP活性值分别为0.316±0.015、0.313±0.013、0.351±0.028),差异有统计学意义(P0.05);(3)在10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L地塞米松作用下,成骨细胞p-Akt蛋白表达较对照组分别减少16.9%、34.9%、62.5%,差异有统计学意义(均P0.05),ALP蛋白分别减少16.2%、24.8%、69.3%,其中10~(-7)mol/L Dex组、10~(-6)mol/L Dex组与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);(4)与对照组相比,10μmol/L SC79刺激p-Akt蛋白的表达,对ALP蛋白的表达具有促进作用(P0.05);与Dex组相比,SC79+Dex组成骨细胞增生活力及ALP活性明显升高,p-Akt、ALP蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论高浓度地塞米松可以抑制成骨细胞增生和ALP的表达,其作用机制可能与下调Akt磷酸化有关。     

氟化物对成骨细胞增殖和分化的影响

目的研究不同浓度氟化物对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化的影响.方法经酶消化法从24h新生Wister乳鼠颅盖骨分离得到的成骨细胞经不同浓度的氟化钠(NaF)作用后,采用MTT法检测细胞增殖;PNPP法测定碱性磷酸酶(ALP)活性;放射免疫法测定培养液中骨钙素(BGP)含量.结果低浓度NaF(10-7mol/L～10-5mol/L)可刺激细胞增殖;高浓度NaF(10-4mol/L～10-3mol/L)则抑制细胞增殖.NaF对成骨细胞分化的影响则呈多样性.ALP的活性改变基本与细胞增殖率的变化相同,即各浓度NaF均促进细胞骨钙素分泌,与对照组相比有统计学意义.结论氟化物对成骨细胞的增殖及早期分化呈双向调节,即小剂量促进,大剂量抑制.但对其晚期分化呈一致性,即促进作用.     

罗格列酮联合甘精胰岛素对前成骨细胞的影响

将小鼠MC3T3-E1成骨样细胞传代培养后分为8组:正常对照组(NC);成骨诱导对照组(OI);罗格列酮5μmol/L组(R5);罗格列酮10μmol/L组(R10);甘精胰岛素10-7mol/L组(G10-7);甘精胰岛素10-8mol/L组(G10-8);罗格列酮5μmol/L+甘精胰岛素10-8mol/L组(R5+G10-8)及罗格列酮10μmol/L+甘精胰岛素10-7mol/L组(R10+G10-7)。分别测定MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性及增殖能力。结果与正常对照组比较,R10组能抑制前成骨细胞的增殖。而R10+Q108组与R10组相比,能对抗罗格列酮的抑制细胞增殖的作用,使细胞数目增加,P0.05。与正常对照组比较,OI组能刺激前成骨细胞分泌碱性磷酸酶,与正常对照组相比,2个浓度的罗格列酮与甘精胰岛素均减少了ALP的活性。而且罗格列酮组ALP活性的下降比甘精胰岛素组明显。高浓度联合用药组ALP活性也明显低于对照组,但是联合用药组ALP活性值比罗格列酮单药组高,R5+G10-8组ALP活性值和R5组相比,(P0.05)。结论:罗格列酮能抑制前成骨细胞增殖,甘精胰岛素能对抗罗格列酮抑制细胞增殖的作用;罗格列酮与甘精胰岛素均可抑制前成骨细胞分化,甘精胰岛素与罗格列酮联用,能对抗罗格列酮抑制前成骨细胞分化的作用。     

PPARγ2内源性配体15d-PGJ_2对成骨细胞骨代谢相关基因表达的影响

目的研究不同浓度15d-PGJ_2对大鼠成骨细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)及骨代谢相关基因核因子-κB活化受体配体(RANKL)、碱性磷酸酶(ALP)及骨保护素(OPG)mRNA表达水平的变化,探讨PPARγ2内源性配体15d-PGJ_2对成骨细胞骨代谢相关基因表达的影响。方法体外培养大鼠成骨细胞,加入不同浓度15d-PGJ_2(0、10、20、30μmol/L)干预24小时后,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测成骨细胞PPARγ2、RANKL、ALP及OPG mRNA表达水平,比较不同浓度15d-PGJ_2对成骨细胞骨代谢相关基因mRNA表达的影响。结果不同浓度15d-PGJ_2呈剂量依赖性下调RANKL、ALP及OPG mRNA的表达水平,而呈剂量依赖性上调PPARγ2 mRNA的表达水平,组间比较差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论 15d-PGJ_2可能通过激活PPARγ2转录活性抑制成骨基因mRNA的表达,参与增龄相关的骨质疏松的发病过程。     

鱼腥草素对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响

目的研究不同浓度鱼腥草素对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响,旨在为未来抑制成骨细胞增殖的治疗提供参考。方法在新生SD大鼠颅骨成骨细胞培养液中分别加入0(空白对照组)、1、10、20、30、40μmol/L浓度的鱼腥草素,采用细胞计数试剂盒(CCK)-8测定不同浓度鱼腥草素对大鼠成骨细胞的增殖能力,采用茜素红染色法评价矿化结节情况,采用Western印迹法测定碱性磷酸酶蛋白(ALP)表达活性。结果经CCK-8法检测成骨细胞增殖结果显示,鱼腥草素作用2、7 d后,空白对照组、1、10、20、30、40μmol/L组吸光度值随着浓度增加均呈下降趋势,各时点各组吸光度值差异有统计学意义(P0.05);成骨诱导培养7、14 d后,茜素红染色结果显示,10、20μmol/L组矿化结节数多于其他各组,40μmol/L组培养各时点矿化结节数最少,后由少至多依次为空白对照组、30μmol/L组、1μmol/L组,组间差异有统计学意义(P0.05);各时间点,10、20μmol/L组ALP活性最高,30、40μmol/L组ALP活性抑制,随培养时间延长,这种活性促进与抑制的情况继续增强,组间差异有统计学意义(P0.05)。结论鱼腥草素对成骨细胞增殖、分化、矿化有抑制功效,可调节骨代谢,可能对骨质疏松的防治有积极意义。     

去铁酮对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1生物学活性的影响

目的研究铁螯合剂去铁酮(deferiprone,DFP)体外对成骨细胞增生、分化以及细胞铁代谢的影响。方法体外培养小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1,在10 mmo L/Lβ-甘油磷酸和50μg/m L抗坏血酸的诱导下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(25、50、100μmol/L)DFP干预,用CCK-8法检测细胞的增生,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性试剂盒检测细胞ALP活性,实时定量PCR检测细胞膜转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)mRNA的表达。结果 MC3T3-E1细胞增生结果显示,DMSO溶剂组、对照组(0μmol/L)和DFP 25、50、100μmol/L组A值分别为1.36±1.10、1.41±0.09、0.78±0.06、0.68±0.03、0.46±0.01;ALP活性检测结果显示,对照组(0μmol/L)和DFP 25、50、100μmol/L组ALP活性值分别为0.83±0.05、0.75±0.04、0.64±0.03、0.51±0.03;TfR mRNA表达检测结果显示,对照组(0μmol/L)和DFP 25、50、100μmol/L组表达比分别为1、1.16±0.05、1.32±0.06、2.30±0.11。MC3T3-E1细胞的增生、ALP活性随DFP干预浓度的增加呈剂量依赖性下降(P0.05),TfR mRNA的表达随DFP干预浓度的增加呈剂量依赖性上升(P0.05)。结论 DFP可能通过螯合成骨细胞内的铁离子抑制其增生、分化。     

氟调控成骨细胞内质网应激信号通路对细胞增殖凋亡分化的影响

目的探讨氟调控成骨细胞内质网应激信号通路对细胞增殖凋亡分化的影响。方法培养成骨细胞MC3T3-E1,0、1、2、4、8、16、32、64 mg F-/L组9个不同的氟浓度处理成骨细胞MC3T3-E1 2、7、14 d后,每个时间段设置对照组,CCK8检测细胞的增殖;2、8、20 mg F-/L处理细胞,流式细胞仪检测不同浓度氟对成骨细胞MC3T3-E1凋亡的影响;qRT-PCR检测细胞中与分化相关的基因的表达;Western blot检测内质网应激信号通路相关蛋白的表达。结果低浓度氟(2、4mg F-/L)和中浓度氟(8 mg F-/L)显著增强细胞的增殖(P0.05),高浓度氟(16 mg F-/L)显著降低细胞的增殖(P0.05);2、8、20 mg F-/L处理成骨细胞MC3T3-E1,细胞凋亡率显著高于0 mg F-/L(P0.01),且随着浓度的增加凋亡率变大;2 mg F-/L促进细胞内ALP、OCN、Runx2和Osterix的mRNA表达,20 mg F-/L则抑制上述因子的mRNA表达(P0.01);2、8、20 mg F-/L处理MC3T3-E1细胞中Xbp1、AFT4、Bip和PERK的蛋白表达量都高于0 mg F-/L,其中2 mg F-/L处理细胞中Xbp1和AFT4蛋白表达最多(P0.01),8 mg F-/L处理细胞中PERK的蛋白表达量最多(P0.01),20 mg F-/L处理细胞中Bip蛋白表达量最多(P0.01)。结论低浓度氟促进成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化,高浓度则抑制,细胞凋亡率随氟浓度增加而增加,不同氟浓度处理促进成骨细胞中内质网应激信号通路相关蛋白的表达。     

地塞米松对体外人骨髓基质细胞增殖及成骨分化的影响

目的观察地塞米松对骨髓基质细胞(MSCs)增殖及成骨分化的影响。方法以离心法分离培养MSCs,分别以10~(-9)、10~(-8)和10~(-7) mol/L地塞米松对细胞进行干预,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)测细胞增殖率；测细胞质碱性磷酸酶(ALP)含量；利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术在转录水平检测成骨细胞标记物骨桥蛋白(OPN)mRNA的表达。结果地塞米松干预8 d后,各干预组的吸光度值均低于对照组,10~(-8)和10~(-7) mol/L地塞米松组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0．05)；地塞米松干预12 d后,各干预组细胞质ALP含量呈浓度依赖性增加,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0．05)；地塞米松干预12 d后,各干预组均有OPN mRNA表达,且随浓度增加表达增强。结论地塞米松对体外MSCs增殖有抑制作用,但对MSCs成骨分化有促进作用。     

地拉罗司对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1生物学活性的影响

目的探讨铁鳌合剂地拉罗司(deferasirox,DFS)体外对成骨细胞增生、分化、矿化和细胞内铁离子的影响。方法小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1在37℃条件下体外培养,在10 mmol/Lβ-甘油磷酸和50 mg/L抗坏血酸的诱导作用下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(10、20、40μmol/L)DFS干预,用CCK-8法检测细胞的增生,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性试剂盒检测细胞ALP活性,Von kossa染色法行细胞钙结节染色,实时定量PCR检测细胞膜转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)mRNA的表达。结果 MC3T3-E1细胞增生结果显示,DMSO溶剂组、对照组(0μmol/L)、10、20、40μmol/L组A值分别为1.41±0.09、1.41±0.09、1.01±0.01、0.79±0.04、0.67±0.04;ALP活性检测结果显示,对照组(0μmol/L)、10、20、40μmol/L组ALP活性值分别为0.73±0.03、0.65±0.02、0.54±0.03、0.35±0.04;钙结节检测结果显示,对照组(0μmol/L)、10、20、40μmol/L组TfR mRNA钙化面积比值分别为4.22±0.12、3.29±0.14、1.40±0.20、0.86±0.21;TfR mRNA表达检测结果显示,对照组(0μmol/L)、10、20、40μmol/L组TfR mRNA表达比分别为1、1.52±0.23、1.91±0.17、2.98±0.14。MC3T3-E1细胞的增生、ALP活性、钙结节和钙化面积随DFS干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P0.05),TfR mRNA的表达随DFS干预浓度的增加呈剂量依赖性升高(P0.05)。结论 DFS可能通过螯合成骨细胞内的铁离子抑制其增生、分化和矿化。     

雷洛昔芬对小鼠成骨细胞中护骨素核因子-κB受体活化因子配体表达的影响

目的 雷洛昔芬对小鼠成骨细胞中护骨素(OPG)、核因子-κB(NF-κB)受体活化因子配体(RANKL)表达的影响. 方法 取出生24 h内的小鼠30只,无菌的条件下取出颅骨,应用酶消化法进行成骨细胞的培养,在培养成骨细胞的培养液中加入不同浓度的雷洛昔芬(0、1012、1010、109mol/L),应用反转录聚合酶链扩增(RT-PCR)法检测其对OPG/RANKL mRNA的表达及酶联免疫吸附法(ELISA)法检测OPG蛋白分泌的影响. 结果 OPG mRNA在实验组中表达较对照组强,并且不同浓度组间的比较,差异有统计学意义(均为P<0.05),1010.mol/L组较10～mol/L、1012mol/L组的表达明显增强;RANKL mRNA在实验组的表达均较对照组弱,其组间的差异亦有统计学意义(P<0.01).并且随着雷洛营芬浓度的增加,RANKL mRNA的表达明显减弱,呈现明显的浓度依赖性.在试验组小鼠成骨细胞培养液中OPG浓度(10-9mol/L组为3.017±0.459,1010mol/L组为3.981±0.762,1012mol/L组为2.864±0.416)较对照组(2.106±0.316)增高,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 雷洛昔芬能促进成骨细胞的中OPG的mRNA的表达及其蛋白的分泌,同时抑制RANKL的mRNA的表达.     

雌二醇对成骨细胞OPG和RANKL的影响

目的探讨不同浓度17β-雌二醇(E2)作用下体外培养大鼠成骨细胞护骨素(OPG)、细胞核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)的表达及雌激素治疗骨质疏松的机制。方法采用不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)17β-E2刺激培养的大鼠成骨细胞(OB),RT-PCR方法检测OPG、RANKL mRNA的表达。结果原代OB呈多角形、梭形,传代OB胞核较大,细胞质内见黑色颗粒,细胞形态为多角形或梭形,见突起,三代细胞碱性磷酸酶染色阳性,胞质见大量灰黑色颗粒,细胞鉴定符合成骨细胞特征。不同浓度(10-9、10-8、10-7mol/L)17β-E2对OB OPG mRNA表达具有显著的增强作用(P<0.05),其中10-8mol/L 17β-E2对OB OPG mRNA表达最高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),而10-10mol/L 17β-E2对成骨细胞OPG mRNA表达几乎无影响,与对照组比较无显著差异(P>0.05),10-10、10-9、10-7mol/L 17β-E2对成OB RANKL mRNA表达几乎无影响,与对照组比较无明显差异(P>0.05),其中10-8mol/L17β-E2对OB RANKL mRNA的表达具有明显的抑制作用,其与对照组比较差异明显(P<0.05)。结论雌激素治疗骨质疏松的作用可能与其促进成骨细胞OPG表达、抑制RANKL表达相关。     

四种骨质疏松治疗药物对原代SD大鼠成骨细胞MGP表达的影响

目的 观察4种常用骨质疏松治疗药物(维生素K2、PTH、活性维生素D3、阿仑膦酸盐)对原代SD大鼠成骨细胞基质gla蛋白(MGP) mRNA表达的影响,探讨MGP在骨质疏松发病中的可能作用.方法 采用胰酶-胶原酶序贯消化法获得新生1～3天内SD大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养.第二代细胞经Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶(ALP)、矿化结节染色进行成骨细胞表型鉴定后给予不同浓度的维生素K2、PTH、活性维生素D3、阿仑膦酸盐干预培养24 h后抽提成骨细胞总RNA,采用荧光实时定量RT-PCR检测成骨细胞MGP基因mRNA的表达.结果 (1)原代成骨细胞Ⅰ型胶原染色呈棕红色,ALP染色显示细胞内棕黑细微颗粒,可形成矿化结节.(2)4种常见骨质疏松药物均上调成骨细胞MGP mRNA的表达,维生素K2浓度为10-5、10-6、10-7 mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量分别是空白对照组的2.56、2.12、1.57倍,差异均有统计学意义(P＜0.05).PTH(1-34)浓度为10-7、10-8、10-9 mol/L时,升高成骨细胞MGPmRNA的表达量分别是空白对照组的6.78、5.31、2.23倍,差异均有显著性(P＜0.05).活性维生素D3浓度为10-8、10-9和10-m mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量分别是空白对照组的8.93、6.95、3.47倍,差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)阿仑膦酸盐为10-4、10-5、10-6 mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量是空白对照组的3.47、2.49、1.98倍,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 骨质疏松治疗药物维生素K2、PTH、活性维生素D3、阿仑膦酸盐均可促进原代培养SD大鼠成骨细胞MGP mRNA的表达,且呈剂量依赖性.MGP可能为骨质疏松治疗药物作用的共同靶点,参与了骨质疏松的发病机制.     

氟在体外对兔成骨细胞增殖行为的影响

目的通过体外培养幼兔成骨细胞,观察不同浓度的氟对成骨细胞增殖行为的影响.方法用幼兔肋骨培养成骨细胞,纯化、鉴定.用不同浓度的氟化钠处理(20、160、240、400μmol/L),MTT法测定氟对成骨细胞增殖的影响;嗜银蛋白(AgNoRs)分析计数细胞核内AgNORs颗粒数.结果低浓度的氟(20μmol/L)在体外可促进成骨细胞增殖,而高浓度的氟(160、240、400 μmol/L)则抑制成骨细胞的增殖.低浓度氟处理组(20μmol/L)细胞核内AgNORs颗粒数显著多于对照组(P＜0.01);而高浓度氟处理组(240、400μmol/L)胞核内AgNORs颗粒数显著减少(P＜0.05).结论低浓度的氟可以促进成骨细胞的增殖,高浓度的氟抑制成骨细胞的增殖,氟对成骨细胞的作用具有双向性.     

淫羊藿甙对大鼠成骨细胞护骨素、RANKL表达的影响

目的观察淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞护骨素(OPG)、核因子-kB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达的影响。方法用酶消化法分离24h内新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养。在培养液中加入不同浓度的淫羊藿甙(10~(10)～10~(14)mol/L),培养48h后,抽提总RNA,采用半定量RT-PCR法检测成骨细胞中OPG和RANKL mRNA表达的变化。结果淫羊藿甙可明显促进成骨细胞OPG mRNA的表达,抑制RANKL mRNA的表达,且呈浓度依赖性,均以10~(-7)mol/L时作用最显著(P＜0.05)。预先用淫羊藿甙干预成骨细胞,可逆转地塞米松的降低OPG mRNA(0.570±0.093vs 1.083±0.081)、升高RANKL mRNA(1.079±0.050vs 0.718±0.082)的作用(均P＜0.05)。结论淫羊藿甙可以上调OPG基因表达,下调RANKL基因表达,从而调节骨吸收,这可能是淫羊藿甙防治骨质疏松症的重要机制之一。     

白三烯B4对骨髓细胞及成骨细胞骨代谢相关基因mRNA表达的影响

目的观察不同浓度白三烯B4(LTB4)干预后大鼠骨髓细胞及成骨细胞过氧化物酶体增生物激活受体γ2(PPARγ2)及骨代谢相关基因核因子-KB活化受体配体(RANKL)、碱性磷酸酶(ALP)、骨保护素(OPG)、核因子-KB活化受体(RANK)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)mRNA表达水平的变化,探讨PPARγ2内源性配体LTB4在骨代谢中的作用。方法体外培养大鼠骨髓细胞及成骨细胞,分别加入不同浓度LTB4(0、0.1、1.0、10.0μmol/L)干预24 h,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测骨髓细胞PPARγ2、RANKL、ALP、OPG、RANK、TRAP mRNA表达水平及成骨细胞PPARγ2、RANKL、ALP、OPG mRNA表达水平,比较不同浓度LTB4对上述基因表达的影响。结果 (1)不同浓度LTB4呈剂量依赖性下调骨髓细胞RANKL、ALP、OPG mRNA的表达水平,同时呈剂量依赖性上调PPARγ2、RANK、TRAP mRNA的表达水平,组间比较差异均有统计学意义(P0.05,P0.01);(2)不同浓度LTB4呈剂量依赖性下调成骨细胞RANKL、ALP、OPG mRNA的表达水平,同时呈剂量依赖性上调PPARγ2mRNA的表达水平,组间比较差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论 LTB4可能通过激活PPARγ2转录活性抑制骨髓细胞及成骨细胞成骨标记物基因的表达,促进骨髓细胞破骨标记物基因的表达,从而参与与增龄相关的骨质疏松的发病过程。     

玉米紫色植株色素对氟化钠诱导成骨细胞氧化损伤的保护作用

目的观察玉米紫色植株色素(MPPP)对氟化钠诱导成骨细胞氧化损伤的保护作用。方法MC3T3-E1成骨细胞常规传代培养,分阴性对照组、阳性对照组及低、中、高浓度色素组。浓度为10~(-7)、10~(-6)及10~(-5)mol/L的MPPP预处理成骨细胞24、48和72 h,分别加入5×10~(-4)mol/L的过氧化氢(H_2O_2)培养1 h,观察各组细胞增殖活力,并检测预处理72 h后各组细胞总抗氧化能力(T-AOC);浓度为10~(-7)、10~(-6)及10~(-5)mol/L的MPPP和浓度为10~(-3)mol/L的氟化钠共同培养成骨细胞24、48和72 h,观察各组细胞增殖活力及超微结构,并检测培养48 h各组细胞T-AOC。结果H_2O_2可明显抑制成骨细胞增殖(P0.05或P0.01);而经过MPPP预处理72 h后,成骨细胞增殖能力显著增强(P0.05),且细胞T-AOC明显提高(P0.01);成骨细胞培养24、48和72 h后,氟化钠均可抑制细胞增殖(P0.01);培养48 h,终浓度为10~(-5)mol/L的MPPP可显著促进细胞增殖(P0.01),且提升细胞T-AOC(P0.01),电镜结果显示,氟化钠可诱导成骨细胞发生细胞凋亡,MPPP干预后,成骨细胞的病理学改变减轻。结论MPPP可通过提升成骨细胞T-AOC抑制氟化钠诱导的氧化损伤。     

氟剂对成骨细胞成骨功能表达的影响

目的　从不同剂量氟化钠 (NaF)对大鼠成骨细胞 (OB)功能表达的影响 ,研究氟剂促进成骨作用的机制及剂量效应关系。方法　经酶消化法从新生 2 4hSpregne Dawley (SD)种乳鼠头盖骨分离得到的成骨细胞。在 10 -7～ 5× 10 -4mol/LNaF中培养。用生化法测定细胞碱性磷酸酶 (ALP)活性 ,用放射免疫法测定培养液中骨钙素 (OC)含量。结果　NaF对细胞ALP活性的影响呈双向 ,即低浓度NaF(10 -7～ 10 -5mol/L)增加ALP活性 ,高浓度NaF (10 -4～ 5× 10 -4mol/L)则抑制ALP活性 ;对骨钙素产生和分泌的影响则呈单向 ,即各浓度NaF均刺激细胞骨钙素分泌 ,并与氟剂剂量呈正相关 ,其中 5× 10 -4mol/L组骨钙素水平最高 ,与对照组相比增加 6 7 14 % (P <0 0 5 )。结论　适量氟剂能增加成骨细胞ALP的活性及骨钙素的产生 ,促进成骨细胞的骨形成功能 ,但有效剂量范围狭窄     

雌二醇对成骨细胞护骨素基因表达的影响

目的 研究在MG－63细胞和成人成骨细胞培养的不同阶段,雌激素对护骨素（OPG）基因mRNA表达的影响,探讨雌激素对成骨细胞的作用机制。方法 在细胞培养的不同时间,测定细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素（OC）含量和进行Van Gieson胶原染色,以确定细胞培养的增殖、成熟、矿化,于成熟阶段用17β－雌二醇（E2）对培养细胞进行处理,用半定量RT－PCR技术测定雌二醇对成骨细胞OPG基因mRNA表达的影响。结果 ALP活性、骨钙素含量及胶原染色均表明,细胞培养汇片后12天达到成熟。正常成人髂骨分离的成骨细胞（HOB）及成骨肉瘤细胞株MG－63均能表达OPG,且表达量与培养的时程有关。培养12天时,两各OPG基因mRNA表达均达最高峰（P＜0．01）。10^-8mol/L的E2能使MG－63细胞OPG基因mRNA的表达至基础值的10倍（P＜0．001）,HOB的OPG基因mRNA表达增加至基础值的7－8倍（P＜0．01）。结论 OPG在成骨细胞表达。雌激素使成骨细胞OPG基因mRNA表达的增加是雌激素缺乏导致骨质疏松的重要机制之一。