恶性疟原虫AMA1不同类型疫苗组合免疫接种研究

目的 探索应用恶性疟原虫DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种，诱导针对恶性疟原虫红内期抗原AMA1的保护性抗体。方法PCR扩增云南株恶性疟原虫AMA1编码基因，构建和制备DNA免疫质粒VR1020/E（疫苗D）、重组改良安卡拉痘苗病毒rMVME（疫苗V）和重组原核表达AMAl胞外域蛋白E（疫苗P）。用疫苗D单独或与小鼠GM-CSF表达质粒共同对小鼠进行初始免疫，用疫苗V和疫苗P进行单次或先后各一次追加强化。采用疫苗D-V组合方案免疫新西兰白兔。ELISA测定小鼠血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a的水平，用免疫动物血清进行疟原虫裂殖子体外入侵抑制实验。结果在疫苗D初始免疫的基础上，采用疫苗V或疫苗P进行强化免疫可显著提高小鼠针对AMA1的抗体应答，小鼠血清特异性IgG平均增加15至137倍，GM-CSF表达质粒对疫苗D-V组合免疫小鼠的抗体应答有显著促进作用。采用疫苗D-V组合免疫在家兔可诱导明显的抗体应答。小鼠和家兔免疫血清在体外可显著抑制疟原虫裂殖子对RBC的入侵。结论将DNA疫苗、重组改良安卡拉痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种是诱导疟疾红内期保护性抗体的有效方法。     

抗恶性疟原虫全虫单克隆抗体的制备和鉴定

为建立分泌抗恶性疟原虫全虫单克隆抗体杂交瘤细胞株，研制简易、敏感、特异的快速诊断恶性疟试剂盒。本用恶性疟原虫全虫抗原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2／0细胞融合，用ELISA法筛选分泌抗体的阳性杂交瘤细胞克隆，测定单抗的效价和Ig亚类，并用SDS-PAGE、Western印迹、IFAT和IPA等方法对单抗进行鉴定。结果，获得4株(2H6，2A3，3B1和2C12)分泌抗恶性疟原虫单抗的杂交瘤细胞克隆，均属IgG类。其中2H6克隆产生的抗体滴度最高《腹水效价达1：32000)．属IgG1亚类。与伯氏疟愿虫、弓形虫无交卫反应；Western印迹分析显示2H6能被约：130、63、41、33和20kDa等抗原蛋白所识别,IFAT和IPA分析显示，2H6单抗的抗原主要定位于裂殖子、滋养体和裂殖体的表膜部分。从而提示所制备的抗恶性疟原虫全虫杂交癌细胞株能分越高滴度的抗体，其中2H6是针对恶性疟原虫裂殖于表面蛋白的特异性单抗，可用于怒性疟快速诊断试剂盘的研制。     

BCG/恶性疟MSP-2、CSP多价疫苗免疫小鼠应答类型研究

目的：探讨恶性疟原虫FCC－1／HN株裂殖子表面蛋白－2（MSP－2）和环子孢子蛋白（CSP）与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法：将重组pBCG／MSP－2和pBCG／CSP多价疫苗经皮下注射BALB／c小鼠，小鼠经多价疫苗免疫8周后，用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化，并体外培养脾脏细胞，用夹心ELISA法测定IFN－γ和IL－2的产生；用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化，在体外测定抗体介导的抑制实验。结果：与对照组相比，疫苗组CD4^ 和CD8^ T淋巴细胞有显著性的增高，体外培养的脾脏细胞IFN－γ有高浓度的分泌。同时，免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了较高水平的IgG类抗体反应，抗体对原虫的增殖明显抑制。结论：恶性疟原虫FCC－1／HNpBCG/MSP-2和pBCG/CSP多价疫苗诱导了以TH1为主的免疫应答类型。     

抗恶性疟原虫单克隆抗体的分析

在两次细胞融合中,经2—4次克隆化后已建成28株抗恶性疟原虫(FCC—1/HN)的杂交瘤。其中针对裂殖子和分裂体抗原的McAb有9株,仅对裂殖体特异的有4株,对裂殖体和滋养体期原虫产生荧光反应的有15株。 应用间接荧光抗体技术,检查这28株McAb对恶性疟原虫(安徽株),间日疟原虫、食蟹猴疟原虫,诺氏疟原虫、伯氏疟原虫、约氏疟原虫和鸡疟原虫的交叉反应。结果,仅有93D4和94B5属株特异性McAb,其余各株均对恶性疟原虫(安徽株)有明显荧光反应。有5     

恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白对裂殖子入侵人红细胞的抑制作用

恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白－１（ＭＳＡ１），又称Ｐ１９５，与人红细胞具有结合作用，这种结合是裂殖子识别红细胞的基础。为了确定Ｐ１９５蛋白与识别有关的位点，本研究在大肠杆菌中分８段表达了ＭＡＤ２０株恶性疟原虫的Ｐ１９５蛋白。各段蛋白用镍亲和层析柱分离，然后复性。在体外培养疟原虫至成熟裂殖体期，将各段蛋白分别加入到培养基上清中，继续培养２４小时，检查红细胞感染率，通过感染率了解各段蛋白对裂殖子入侵红细胞的影响。结果发现Ｐ１９５蛋白中氨基酸序列为３８４－５９５的一段蛋白（Ｍ６），呈剂量依赖性抑制恶性疟原虫裂殖子入侵人红细胞，且Ｍ６对疟原虫生长无细胞毒性作用。这表明Ｍ６可能含红细胞结合位点，该位点与裂殖子竞争性结合红细胞，而使感染率下降     

约氏疟原虫蛋白磷酸酶6 免疫血清的传播阻断效果分析

目的:探讨约氏疟原虫蛋白磷酸酶6(PyPPM6)作为传播阻断疫苗候选抗原的可行性。方法:PCR扩增PyPPM6蛋白功能区(359-644 aa),克隆入pET32a(+)载体。IPTG诱导PyPPM6重组蛋白表达,免疫小鼠后收集抗-PyPPM6免疫血清。ELISA和Western Blot检测血清中抗体效价和特异性。体外实验观察免疫血清对配子体出丝、动合子形成和转化率及囊合子形成的影响。结果:成功表达PyPPM6重组蛋白;抗-PyPPM6免疫血清抗体滴度为1∶64 000;与对照组相比,抗-PyPPM6免疫血清可使配子体出丝减少78.8%,动合子减少78.7%,动合子转化率降低55.1%,蚊胃内卵囊减少40.4%。结论:PyPPM6蛋白具有较强免疫原性。抗-PyPPM6免疫血清具有良好的传播阻断效果。     

疟疾传播阻断疫苗Pys25重组蛋白免疫活性的实验研究

为探讨约氏疟原虫传播阻断疫苗Pys25重组蛋白的免疫效果及其效应,我们以酵母菌表达的Pys25重组蛋白皮下免疫DBA/2小鼠,采用ELISA检测免疫后不同时间小鼠血清中的特异性抗体水平,并通过IFA观察免疫血清对有性阶段虫体发育的阻断效应。初次免疫后2周,小鼠血清中特异性IgG抗体水平开始升高,并于加强免疫后2周达到峰值;感染血液与免疫血清共同培养后,配子体向合子和动合子的发育明显受阻,并且其传播阻断效应与免疫血清呈剂量依赖性。实验表明,酵母菌表达的Pys25重组蛋白具有良好的免疫原性,其免疫血清可显著抑制有性阶段原虫的进一步发育。     

RA患者抗天然Ⅱ型胶原抗体与ESR、CRP、AAG之间的关系

为探讨抗天然Ⅱ型胶原抗体(抗Nat Ⅱ)在类风湿性关节炎(RA)疾病活动中的意义.采用ELISA检测抗Nat Ⅱ IgG,用BN prospec特定蛋白分析仪检测C-反应蛋白(CRP)和α1-酸性糖蛋白(AAG),Electa血沉仪测定红细胞沉降率(ESR).结果60例RA患者血清抗Nat Ⅱ IgG水平与ESR和血清CRP、AAG含量呈正相关(相关系数r分别为0.402、0.268和0.382),其中23例抗NatⅡIgG阳性患者的ESR、CRP、AAG均显著高于抗Nat Ⅱ IgG阴性者(P＜0.01).抗Nat Ⅱ IgG可作为RA疾病活动性指标之一.     

脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的免疫效果

目的研究原核重组表达的B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白0315(rNMB0315)在诱导小鼠产生特异性免疫应答中的作用、免疫血清抗体体外杀菌活性和重组蛋白的免疫保护效果,初步评价rNMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的潜力。方法将构建的原核表达载体p ET30a-NMB0315转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白,纯化鉴定后的重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,检测体液免疫和细胞免疫水平;测定血清抗体在补体介导下的体外杀菌活性,观察rNMB0315蛋白疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果 rNMB0315具有良好的免疫原性,能诱导产生较高水平的体液免疫应答:包括血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG3、IgG2b和生殖道黏膜特异性分泌型IgA(s IgA),免疫后第6周抗体效价分别为1∶150 000、1∶85 000、1∶60 000、1∶35 000、1∶30 000和1∶30 000;也能激发较高水平的细胞免疫应答,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的刺激指数(SI)值明显高于PBS、Freund佐剂对照组。在免疫的2、4、6周,血清IgG2a/IgG1比值均小于1,提示rNMB0315疫苗以诱导Th2细胞性体液免疫应答为主。rNMB0315疫苗免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价为1∶128;72 h内,对实验小鼠的免疫保护率为90%。结论原核表达的rNMB0315具有良好的免疫活性和免疫保护效果,NMB0315外膜蛋白具有作为预防B群流脑蛋白疫苗候选抗原的潜力。     

夫妇血型不合的孕妇产前免疫性抗体检测分析

目的:探讨夫妇血型不合的孕妇免疫性IgG抗体效价异常率及临床意义, 观察凝聚胺法(MPT)检测孕妇血清中IgG抗A(B)及Rh血型抗D抗体的灵敏度和特异性.方法:常规检测夫妇ABO及RhD血型, 对夫妇ABO及Rh血型不合的孕妇血清进行不规则抗体筛选及特异性鉴定;用MPT法检测孕妇血清中IgG抗A(B)及Rh抗D抗体效价.结果:在986例夫妇ABO血型不合的孕妇血清中, MPT法检出IgG抗A(B)效价≥1∶ 64者528例(53.5%), 传统试管法检出512例(51.9%), 两者比较无统计学意义(P＞0.05);在15例RhD阴性孕妇中检出抗D抗体11例(73%).结论:产前对夫妇进行ABO、 RhD血型及IgG抗A(B)和抗D效价检测, 发现异常及时进行治疗, 可减少母婴血型不合新生儿溶血病的发生率;MPT法检测IgG抗A(B)及抗D抗体效价, 操作简便, 结果准确.     

疟疾DNA疫苗免疫接种方法对小鼠 体液免疫应答的影响

目的 探讨DNA疫苗免疫接种方法对抗体水平及辅助性T细胞极化的影响。方法 利用DNA重组技术构建恶性疟原虫红内期多表位DNA疫苗,通过基因枪、肌肉注射、皮内注射等接种方法免疫小鼠,经ELISA测定该疫苗诱导产生特异性抗体的总量、亚型及表位特异性,比较不同免疫接种方法对DNA疫苗诱导产生抗体及辅助性T细胞极化的影响。结果 接种DNA疫苗的小鼠经3次免疫后都产生了较高滴度的抗重组蛋白抗体。基因枪组单位DNA诱导抗体滴度是肌注组的120倍。基因枪组小鼠血清抗体以IgG1升高为主,而肌注和皮内注射组小鼠血清抗体均以IgG2a升高为主。各免疫接种组诱导产生的抗表位多肽抗体特异性相同。结论 不同免疫接种方法不但会影响血清总免疫球蛋白水平,还能使辅助性T细胞向不同方向极化。肌注和皮内注射诱导产生以IgG2a为主的TH1型免疫应答,基因枪接种诱导产生以IgG1为主的TH2型免疫应答。DN疫苗的摄取方式可明显影响辅助性T细胞的极化。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体。方法应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度：用Western-blot、ELISA法检测纯化后IgG性质及效价。结果重组NS1蛋白获得分泌表达。其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1：6000。结论重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1羧基端编码基因真核表？…

构建以恶性疟原虫红内期重要的疫苗候选抗原－裂殖子表面蛋白羧基端编码分子量４２０００蛋白的基因片段为外源基因的可用作候选核酸疫苗的真核表达载体。方法目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟，将恶性疟原虫ＦＵＰ株裂殖子表面蛋白１羧基端编码４２０００蛋白的基因片段用常规分子克隆方法，分别克隆入非分泌性真核表达载体ＶＲ１０１２和改建后的分泌型载体ＶＲ１０１２／ＴＡ中，通过ＰＣＲ和酶切鉴定出重组克隆。     

E型沙眼衣原体重组主要外膜蛋白诱导恒河猴的交叉免疫效应

目的 探讨E型重组主要外膜蛋白(rMOMP)对恒河猴诱导产生的衣原体交叉免疫应答效应.方法 恒河猴分3组,每组2只,分别为佐剂蛋白组、佐剂组、对照组.于第0、2、4周双侧肱三头肌注射.末次免疫后两周,ELISA检测恒河猴血清中沙眼衣原体特异性IgG抗体和细胞因子IFN-γ,MTT法检测恒河猴淋巴细胞特异性增殖反应,观察恒河猴的迟发型超敏反应,以及恒河猴的血清抗体中和试验.结果 佐剂蛋白组产生了较强的抗rMOMP反应和高水平细胞因子.淋巴细胞特异性增殖反应、迟发型超敏反应明显强于对照组,抗体中和试验蛋白佐剂组血清能抑制D/E/H/L2型沙眼衣原体生长.结论 沙眼衣原体rMOMP能刺激恒河猴产生有效的交叉免疫.     

疟原虫裂殖子入侵人红细胞的受体学说研究进展

疟原虫裂殖子入侵红细胞是在受体介导下完成的,目前研究较多的是恶性疟和间日疟受体。一般认为,恶性疟原虫裂殖子受体主要是红细胞膜上的血型蛋白A(GPA),GPA分子中的Ne-uNAc、(GlcNAc以及T;和T6结构均可能参与其活性中心的组成。Duffy血型抗原可能作为间日疟原虫裂殖子受体,但至今对其化学本质的了解远不如GPA清楚,又由于间日疟原虫在体外培养未获成功,故对间日疟原虫受体及其活性中心的研究进展较缓。人们在研究受体过程中,已分离纯化出多种裂殖子表面配体,发现受体和配体均存有异源性,这些突破性进展将为最终阐明疟原虫裂殖子入侵的生化机制开拓研究前景。     

连续的重复顺序是恶性疟原虫上红细胞受体结合蛋白的结合区

疟原虫裂殖子入侵红细胞是一个受体介导的过程。近年来的研究结果证明:恶性疟原虫裂殖子首先必须与红细胞上血型糖蛋白(即受体)结合,才能侵入人红细胞;而裂殖子上分子量为155,000(GBP-155)和130,000～135,000(GBP-130)的     

肠道病毒71型与脊髓灰质炎病毒抗体交叉反应性研究

通过临床血清样本研究及实验动物验证,探讨肠道病毒71型(EV71)与脊髓灰质炎病毒(PV)之间的抗体交叉反应性。以酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测健康儿童血清中IgG型抗体与EV71及PV的反应性;用原核表达与亲和纯化等方法分别获得EV71和PV的衣壳蛋白VP1及非结构蛋白3C;将PV-VP1、EV71-VP1、EV71灭活疫苗及PV灭活疫苗(IPV)分别经皮下免疫BALB/c小鼠制得免疫血清,以蛋白免疫印迹实验分别研究PV-VP1或EV71-VP1小鼠阳性血清与EV71-VP1和PV-VP1的反应情况,进一步以竞争ELISA试验分别研究EV71-VP1对PV-VP1与其特异性免疫血清特异结合的影响。微量中和试验研究PV阳性抗血清对EV71的体外中和效应。结果:已接种PV疫苗但未曾感染EV71的健康儿童的IgG抗体与EV71有较高的反应性,且针对EV71及PV两种病毒的IgG抗体的相对含量成正相关;蛋白免疫印迹实验显示PV-VP1与EV71-VP1免疫的小鼠抗血清中存在交叉抗体,竞争ELISA试验进一步表明EV71-VP1蛋白能明显抑制PV-VP1与其特异性免疫血清抗体的结合,反之亦然。但中和实验揭示PV阳性血清在体外不能中和EV71病毒。PV之间存在大量交叉反应性抗体,但PV免疫后产生的与EV71交叉反应的抗体是非中和性质抗体。非中和抗体可能通过免疫调理效应在EV71病毒的致病的过程中发挥重要作用。     

纯化血清不同倍比稀释法检测孕妇IgG型抗A或抗B抗体效价的比较

目的探讨纯化后的血清不同倍比稀释法检测孕妇ABO血型IgG型抗A抗体效价、抗B抗体效价的可行性。方法采用1∶16、1∶32、1∶4倍比稀释法对同一份效价为512的IgG型抗A抗体的孕妇血清进行检测,再采用以上倍比稀释法检测200例孕妇IgG型抗A抗体效价、抗B抗体效价。结果三种倍比稀释法对同一份效价为512的IgG型抗A抗体孕妇血清检测的凝集强度与效价积分为45、47、45分;再采用三种倍比稀释法检测200例孕妇IgG型抗A抗体效价、抗B抗体效价,异常率为35.5%、36.0%、35.0%,三种方法检测的结果无显著性差异。结论采用更高倍比稀释纯化后血清检测孕妇血清中IgG型抗A抗体或抗B抗体效价,具有敏感性适当、缩短批量检测时间、节约试剂耗材等优点,适合对大批量血标本进行检测,具有一定实际应用价值。     

鼠疫组分疫苗诱导小鼠体液免疫应答研究

目的通过检测鼠疫组分疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫应答,对其免疫原性进行评价。方法将小鼠随机分成4个实验组,免疫后5周内眦采血,检测血清中抗F1抗原和rV抗原IgG及IgA抗体;充分暴露气管,沿气管上端剪一楔形口,用PBS冲洗肺泡制备肺冲洗液,检测肺冲洗液中抗F1抗原和rv抗原IgG及IgA抗体。结果血清中可产生较高效价的抗F1抗原和rV抗原IgG抗体以及较低效价的抗F1抗原IgA抗体。肺冲洗液中可检测到抗F1抗原和rV抗原的IgG抗体,但无特异性IgA产生。结论鼠疫组分疫苗能诱导小鼠产生较强的血清抗体应答,肺冲洗液可检测到一定的IgG抗体,该疫苗有希望成为我国新一代鼠疫疫苗。     

恶性疟原虫抗原—痘苗病毒重组活疫苗株的实验室评价

以恶性疟原虫保护性抗原复合基因—痘苗病毒重组活疫苗候选株为研究对象 ,探索其免疫血清及IgG的体外抗疟原虫能力、保护性细胞免疫反应及换人血猕猴模型动物抗攻击能力试验。结果表明 ,受检免疫血清及IgG具有一定的体外抑制恶性疟原虫增殖作用。家兔及大白鼠免疫后 4～ 6周血清中可产生明显的IL 2活性 ,免疫后 6周家兔、大白鼠及小白鼠血清IFN的活性水平比免疫前明显升高。免疫后 1个月攻虫 ,免疫猴从第 3天一直到第 12天血检中均未发现疟原虫 ;而非重组痘苗病毒免疫猴第 3天后原虫感染率上升 ,第 6天原虫感染率最高达到 6 0 % ,而后原虫感染率逐渐下降 ,持续 13d ;空白对照猴第 3天后原虫感染率也上升 ,第 8天原虫感染率最高达到 2 5 % ,而后原虫感染率逐渐下降 ,持续 12d。结果初步表明该候选疫苗株具有一定的诱发体液免疫、细胞免疫反应及抗虫体攻击能力 ,值得做进一步的研究。