中缅边境流行区恶性疟原虫野生株驯化方式的研究

本文旨在探讨恶性疟原虫野生株体外培养的驯化方法。在中缅边境流行区采集12株野生型恶性疟原虫样本,采用添加ALBUMAX II、次黄嘌呤的改进配方,通过逐渐脱离灭活去纤维蛋白原人血浆的培养方式进行人工驯化临床恶性疟原虫株。分别对灭活去纤维蛋白原人血浆对野生型虫株驯化过程及驯化后生长的影响做统计学分析。结果表明灭活去纤维蛋白原人血浆对野生株体外驯化过程生长的影响具有统计学意义,对人工驯化后生长影响不具有统计学意义。最终N13-1231和F08B38两虫株经驯化后可脱离灭活去纤维蛋白原人血浆连续培养。本文成功对中缅边境流行区恶性疟原虫野生株N13-1231和F0838进行驯化,可脱离灭活去纤维蛋白原人血浆连续培养,具有科学研究价值。     

抗恶性疟原虫HRP—Ⅱ单链抗体的筛选与特性分析

目的：筛选抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白2（HRP－Ⅱ）单链抗体（SeFv)并对其进行鉴定。方法：从抗恶性疟原虫HRP－Ⅱ ScFv库中，挑取单菌落鉴定重组噬粒，采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP－Ⅱ结合的阳性噬粒，采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP－Ⅱ结合的阳性克隆，并选其中2株强阳性克隆进行序列分析。结果：筛选到8株具有HRP－Ⅱ结合活性的阳性克隆，所测2株克隆的基因序列一致，其重链及轻链分别属于鼠抗体基因家族中第I及kVI亚群。结论：从抗体库中成功地筛选出阳性克隆，为基因工程抗体在恶性疟诊断试剂中的应用奠定了基础。     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白（HRP—Ⅱ）的表达和分离纯化

为获得大量具天然抗原活性的恶性疟原虫HRP-Ⅱ抗原,用摇瓶发酵工程菌,诱导β-半乳糖苷酶-HRP-Ⅱ融合蛋白表达;裂菌后,洗涤沉淀2-3次,用6M脲溶解;取上清经Sephacryl-200柱层析分离纯化目的蛋白,然后复性。结果重组蛋白以包涵体的形式高效表达;Sephacryl-200柱层析后,目的蛋白纯度达86%,91.48%被复性,被Dipstick即ParsSight-F识别,表明该重组抗原纯度高,复性效果好,可用于恶性疟原虫HRP-Ⅱ抗体的制备等研究。     

抗恶性疟原虫HRP-II单链抗体的筛选与特性分析

目的　筛选抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白 2 (HRP II)单链抗体 (ScFv)并对其进行鉴定。方法从抗恶性疟原虫HRP IIScFv库中 ,挑取单菌落鉴定重组噬粒 ,采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP II结合的阳性克隆 ,并选其中 2株强阳性克隆进行序列分析。结果筛选到 8株具有HRP II结合活性的阳性克隆 ,所测 2株克隆的基因序列一致 ,其重链及轻链分别属于鼠抗体基因家族中第I及κVI亚群。结论从抗体库中成功地筛选出阳性克隆 ,为基因工程抗体在恶性疟诊断试剂中的应用奠定了基础     

连结蛋白36和闭锁小带蛋白1的PDZ结构域关系

目的:探讨连结蛋白36(Cx36)和闭锁小带蛋白1(ZO-1)相互作用的PDZ结构域。方法:构建pGEX-3X GST-PDZ重组载体在DH5α细菌表达,加IPTG产生融合蛋白,经纯化,免疫印迹分析Cx36与ZO-1相互作用的PDZ结构域,PVDF膜洗脱后抗GST和考马斯亮蓝染色。结果:构建了pGEX-3X GST-PDZ重组载体,与转染Cx36的HeLa细胞孵育,免疫印迹显示Cx36与ZO-1的PDZ1结构域结合。而对照组Cx43与ZO-1的PDZ2结构域结合。实验组在相对分子质量为40 000-42 000有蛋白带,提示GST-PDZ融合蛋白表达。与鼠视网膜组织孵育免疫印迹显示Cx36与ZO-1的PDZ1结构域结合,而对照组Cx43与ZO-1的PDZ2结构域结合,相同膜洗脱后抗GST抗体和考马斯亮蓝染色显示GST-PDZ融合蛋白表达。结论:Cx36与ZO-1的PDZ1结构域结合。     

恶性疟原虫海南株裂殖子表面蛋白1基因第1至第4区的多态性分析

本对5株恶性疟原虫海南株MSP1基因5'端（第1～第4区）进行体外扩增，其中2株的目的基因扩增产物直接用末端标记循环测序法测定其DNA序列，另3株虫株的目的基因片段用pGEM-T载体克隆化后再测序，结果获得了6个MSP1分子第1～第4区的序列片段，与已报告的MSP1分子比较，证明属MAD20等位基因型。同时发现，6个序列片段中，除了HN3和HN5株的序列彼此完全一致，其余株序列的保守区（第1和第3区）也一致外，可变区的第2区和第4区的氨基酸序列存在一定的差异，与MAD20的序列也略有不同，序列分析也证明海南株的MSP1也存在基因内重组现象，此外，3株经克隆化处理的虫株中，发现1株含2种不同的MSP1等位基因，本研究初步提供了我国恶性疟原虫海南株MSP1存在多态性的依据。     

Deaf1的功能结构域分析和预测

目的 分析转录因子Deaf1的功能结构域并预测其功能.方法 利用现有的数据库和软件对Deaf1的转录因子结构域,核定位信号及和输出信号进行分析和预测.结果 Deaf1含有一个保守的SAND结构域及一个能介导蛋白质-蛋白质相互作用的MYND结构域;有核定位信号和核输出信号;在其N端还有一个富含丙氨酸结构域.结论 Dea...     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因复合核酸疫苗诱导小鼠抗体免疫性的研究

目的　检测以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1的 17区片段基因为基础的复合核酸疫苗(分泌性的VR10 12 /TPA/HG MSP1 17和非分泌性的VR10 12 /HG MSP1 17)诱导小鼠的体液免疫反应和免疫血清对疟原虫生长的抑制能力。方法　以 2 0 0 μg/10 0 μl或 10 0 μg/10 0 μl每次每只VR10 12 /HG MSP1 17或VR10 12 /TPA/HG MSP1 17肌注免疫BALB/c或C5 7BL/6小鼠。用ELISA间接法测定小鼠血清的特异性抗体 ,用体外抑制试验检测免疫血清抑制疟原虫生长效果。结果　经 3次 10 0 μg/10 0 μl每次每只VR10 12 /HG MSP1 17免疫后 ,BALB/c小鼠和C5 7BL/6小鼠均产生了明显的HG和YMSP119抗体。但总体抗体水平不高。BALB/c小鼠经 3次 2 0 0 μg/10 0 μl每次每只的VR10 12 /HG MSP1 17免疫后 ,产生了较高的HG抗体 ,但MSP1 17的抗体无明显变化 ,经 3次 2 0 0 μg/10 0 μl每次每只VR10 12 /TPA/HG MSP1 17免疫后 ,仅产生较低的HG抗体 ,无MSP1 17抗体的产生。用 2 0 0 μg/10 0 μlVR10 12 /HG MSP1 17免疫的BALB/c小鼠血清做体外抑制试验 ,结果抑制效果明显。结论　VR10 12 /HG MSP1 17比VR10 12 /TPA/HG MSP 17具有更强的免疫原性 ,其免疫鼠血清能明显地抑制疟原虫生长     

IRE1结构域分析及截短型载体的构建和表达

目的 克隆IRE1基因,根据IRE1基因不同生物学功能的4个结构域构建截短型真核表达载体,并用生物信息学方法对其蛋白产物进行分析.方法 应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板扩增IRE1全长及4个截短型片段,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测...     

恶性疟原虫红细胞表面膜蛋白1DBLα区不同区段与血型抗原的结合特性分析

根据大肠杆菌密码子组成特点,重新优化并合成FCR3S1.2株恶性疟原虫红细胞表膜蛋白1(PfEMP1)DBLα区基因序列,利用PCR的方法,将优化后的基因序列分为3段.分别将全长基因和3个基因片段在大肠杆菌中表达、纯化.通过重组蛋白与血型抗原的亲和试验,分析功能区与血型抗原是否具有亲和力.结果表明,重组的PfEMP1-...     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3功能区片段的制备及其免疫原性分析

目的构建恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3功能片段MSP3（69）与谷胱甘肽（GST）的融合蛋白，并在大肠杆菌中进行表达，分析其免疫原性。方法采用大肠杆菌系统表达融合蛋白GST—MSP3（69），以疟疾病人血清进行Western-blot，并以ISA720、佛氏、氢氧化铝与CpG联合3种佐剂与GST—MSP3（69）融合蛋白乳化，免疫Balb／ca小鼠．分析其免疫原性。结果在大肠杆菌系统中成功表达GST-MSP3（69）融合蛋白，疟疾病人血清能与融合蛋白反应。3种佐剂免疫Balb／ca小鼠均能诱发Balb／ca小鼠产生较高水平的特异抗体，3次免疫后的抗体滴度分别为4．5×10^5，4．1×10^5和3．5×10^5。3次免疫后血清抗体亚型分析显示该蛋白能够诱导Balb／ca小鼠产生较高滴度的亲细胞亚型IgG1和IgG2b．ISA720、佛氏、氢氧化铝与CpG联合佐剂组IgG1分别为8×104、7．8×10^4、6．8×10^4．IgG2b分别为1．2×10^4，1．25×10^4、1．5×10^4。统计学分析显示不同佐剂组的抗体滴度及抗体亚型滴度之间差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论制备了在大肠杆菌表达的GST-MSP3（69）融合蛋白，该蛋白具有高免疫原性，并产生亲细胞亚型抗体，这些为研究MSP3蛋白功能区的免疫保护作用打下了基础。     

我国恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP-2的抗原表位分析

根据我国恶性疟原虫株MSP-2基因序列,检索我国虫株MSP-2是否具有国外已鉴定的MSP-2抗原表位。结果显示,我国虫株MSP-2具有已鉴定的FC-27等位基因型可变区抗原表位STNS和DTPTATE。同时应用计算机辅助抗原表位分析技术对MSP-2进行抗原表位分析预测,并以合成肽技术鉴定了预测表位的免疫原性。抗原指数分析表明,MSP-2分子亲水性指数和侧链易曲性指数最高的区域分别位于aa153～166和aa65～72,而aa53～60可能是我国虫株特异的抗原表位。用4个合成肽进行免疫学鉴定,证实预测的表位可以诱导抗肽抗体反应,免疫血清可识别重组MSP-2和恶性疟原虫全抗原中MSP-2抗原区带,且合成肽可与我国流行区高度免疫人群免疫血清反应。由于这些表位存在于我国海南、云南、安徽株MSP-2序列中,可以作为研制我国恶性疟重组多价表位疫苗的候选抗原表位。     

恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1和M.RCAg-3佐剂的配伍

目的 评价恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1和M.RCAg-3与不同佐剂最优配伍方式并进行初步的免疫机制研究.方法 将多表位疫苗表达纯化后混合4种佐剂(AD、ADL、CpG及CpG&A1)经皮下注射BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔2周.测定血清中抗M.RcAg-1和M.RCAg-3抗体滴度、IgG分型及血清抗体对抗原单表位识别.间接免疫荧光检测血清对天然疟原虫的识别.结果 佐剂ADL和AD分别能显著增强M.RCAg-1(P<0.05)和M.RCAg-3(P<0.05)免疫反应.而佐剂CpG和CpG&A1增强抗原免疫反应的能力相对较弱.与M.RCAg-1、M.RCAg-3和CpG、CpG&A1配伍的组相比,AD和ADL佐剂组的抗体水平和间接免疫荧光反应也都显著增强(P<0.05,P<0.05),抗体对单表位识别显著,抗体IgG分型中IgG1和IgG2a水平较高.结论 佐剂ADL和AD的效果显著,可以作为与M.RCAg-1和M.RCAg-3配伍的候选临床应用佐剂.     

登革病毒1～4型E蛋白结构域Ⅲ融合蛋白的表达纯化及功能研究

目的 了解原核表达的登革病毒（Dengue virus,DV）1～4型融合的E蛋白结构域Ⅲ直接抑制登革病毒感染及其抗体的中和作用.方法 通过连接肽将1～4型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区串联的基因产物插入PET30a在大肠埃希菌中进行表达、纯化后,应用Western Blot及间接ELISA验证表达产物.将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备免疫血清,应用间接免疫荧光检测多抗血清的活性.将融合蛋白及多抗血清分别进行阻断实验和中和实验,对抗原及抗体的功能进行研究.结果 在大肠埃希菌中成功表达了串联的登革病毒1～4型E蛋白结构域Ⅲ融合蛋白,并得到兔抗免疫血清,分别对融合蛋白及兔抗免疫血清进行验证.融合蛋白能够阻断1～4型DV感染,兔抗免疫血清能中和1～4型DV,但中和抗体效价不同.结论 串联表达的登革病毒包膜蛋白Ⅲ区可抑制登革病毒感染,串联rEⅢ蛋白免疫新西兰大白兔产生的针对DV1～4型包膜蛋白结构域Ⅲ区的抗体对登革病毒具有中和作用.     

携带恶性疟原虫ama1基因的重组MVA构建及免疫性分析

目的　构建稳定表达恶性疟原虫 (Pf)顶端膜抗原 1(AMA1)的重组改良安卡拉痘苗病毒 (MVA) ,对其诱导小鼠免疫应答的特性进行分析。方法　构建包含PfAMA1编码基因的重组载体pⅢdHR .ssp E ,转染MVA感染的BHK2 1细胞 ,经同源重组插入MVA基因组的deletionⅢ位点 ,利用宿主范围基因k1l在RK13细胞中对rMVA进行瞬时筛选 ,用获得的rMVA E(K1L)感染BHK2 1并进行传代 ,经内部同源重组去除k1l后获得rMVA E。采用PCR、IFA和Westernblot对rMVA E的基因组序列和重组抗原的表达情况进行鉴定。用不同剂量的rMVA E经腹腔接种免疫BALB c小鼠 ,ELISA检测特异性抗体应答的水平并分析IgG亚类 (IgG1和IgG2a) ,取脾细胞用重组抗原在体外进行刺激增殖。结果　获得了可稳定表达PfAMA1的重组MVA ,经 3次腹腔接种不同剂量 (10 7～ 10 8TCID50 )后的rM VA E诱导BALB c小鼠产生了水平相当 (P >0 .1)的抗AMA1抗体 ,其IgG亚类以IgG2a为主 ,各免疫组脾细胞在体外对AMA1抗原的再刺激均产生了明显的回忆应答。结论　成功构建了携带Pfama1基因的重组MVA。rMVA E可诱导小鼠产生AMA1特异的免疫应答。     

恶性疟原虫113肽抗原基因重组的减毒鼠伤寒沙门菌在家兔中免疫应答的研究

我们已经在减毒鼠伤寒沙门菌ＳＬ３２６１以融合蛋白的形式表达了人工合成的恶性疟原虫杂合１１３肽基因ＡＢ（ＧＺ－ＡＢ）。活菌以２×１０９ＣＦＵ经口服免疫新西兰家兔，用ＥＬＩＳＡ测定抗体水平，结果于首次免疫或加强免疫后都可检测到一定水平的特异性抗体。所免疫的家免可以诱发针对恶性疟原虫抗原及ＧＺ－ＡＢ的迟发性超敏反应（ＤＴＨ）。我们的研究表明，含有多个恶性疟原虫抗原表位的人工合成基因可以在减毒鼠伤寒沙门菌中表达，活菌可诱发家兔产生特异的体液免疫及细胞免疫，为恶性疟口服活菌苗的制备打下基础。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1羧基端编码基因真核表达重组克隆的构建

目的构建以恶性疟原虫红内期重要的疫苗候选抗原——裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）羧基端编码分子量４２０００蛋白的基因片段为外源基因的可用作候选核酸疫苗的真核表达载体。方法目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟，将恶性疟原虫ＦＵＰ株裂殖子表面蛋白１羧基端编码４２０００蛋白的基因片段用常规分子克隆方法，分别克隆入非分泌性真核表达载体ＶＲ１０１２和改建后的分泌型载体ＶＲ１０１２／ＴＰＡ中，通过ＰＣＲ和酶切鉴定出重组克隆。结果成功地构建了真核表达载体ＶＲ１０１２／ＭＳＰ１－４２和ＶＲ１０１２／ＴＰＡ／ＭＳＰ１－４２。结论目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟红外期，该研究对研制有效的恶性疟原虫红内期核酸疫苗是一个有益的尝试。其免疫保护作用待进一步研究。     

丙型肝炎病毒与恶性疟原虫复合多表位抗原基因在小鼠及家兔中免疫应答的研究

目的 :探讨丙型肝炎病毒 (HCV)及恶性疟原虫 (Pf)复合DNA疫苗的可行性。方法 :把HCV复合多表位抗原基因PCX与Pf复合基因AB克隆到带CMV启动子的真核表达载体pcDNA3中 ,构建真核表达载体pcDNA3 CAB ,肌肉注射免疫小鼠及家兔 ,检测其诱发特异性免疫应答水平及安全性。结果 :小鼠及家兔分别于免疫后第 6周及第 8周可检测到抗GZ PCX抗体 ,于第 10周达最高 ,滴度分别为 1:40 0及 1:3 2 0 0 ,但持续时间较短 ;免疫血清可识别Pf抗原 ;免疫动物还可产生针对GZ PCX融合蛋白的迟发性超敏反应 ;免疫后小鼠体重正常 ,肝脾脏未见明显肿大 ,具有良好的安全性。结论 :HCV Pf双价多表位DNA抗原基因在小鼠及家兔中可诱发特异性免疫应答 ,但抗体的持续时间较短。