RNAi沉默NF-κB p65对小鼠巨噬细胞细胞因子表达的影响

目的: 探讨RNA干扰(RNAi)技术在抑制NF-κB p65表达、调控LPS活化后巨噬细胞细胞因子表达中的应用。方法: 利用阳离子脂质体将NF-κB p65小干扰RNA(siRNA)瞬时转染入Ana-1细胞,RT-PCR及Western blotting法检测其沉默效率,ELISA法检测LPS(1 mg/L)刺激下0 h、4 h、12 h和24 h Ana-1细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10浓度。结果: NF-κB p65 siRNA转染24 h后,NF-κB p65在基因水平及蛋白水平表达均被明显抑制(P<0.05)。RNA干扰组Ana-1细胞培养上清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达在相应时点内均较对照组明显降低(P<0.05),IL-10表达显著升高,在12 h和24 h差异显著(P<0.05)。结论: 体外实验初步证实RNAi技术能有效沉默小鼠巨噬细胞NF-κB p65 基因的表达,下调其下游调控的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及上调抑炎症细胞因子IL-10的表达,从而抑制过度的炎症反应。     

淫羊藿苷对化疗后小鼠骨髓和细胞免疫抑制作用的影响

目的:观察淫羊藿苷(ICA)对环磷酰胺(Cy)所致小鼠骨髓和免疫抑制作用的影响,探讨ICA促进化疗后小鼠造血功能和免疫功能的作用及机制。方法:将小鼠随机分为6组:正常对照组,模型组,阳性对照组,ICA高、中、低剂量组。除正常对照组小鼠外,其余各组小鼠均腹腔注射Cy(200mg/kg)。第2天开始,对ICA高、中、低剂量的实验组小鼠灌胃不同剂量的ICA(150、80、40mg/kg.d),阳性对照组小鼠尾静脉注射参芪扶正注射液(1mL/d),模型对照组给予等量生理盐水,连续给予10d。经HE染色后观察小鼠胸腺组织结构的变化。用MTT比色法检测脾淋巴细胞的增殖率。用乳酸脱氢酶(LDH)法检测腹腔巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。用ELISA试剂盒检测混合细胞培养上清中TNF-α和IL-12的含量。用全自动血液分析仪检测外周血红细胞、白细胞和血小板数量的变化;外周血和股骨骨髓涂片经瑞氏-吉姆萨染色后,光镜下计数单根股骨骨髓细胞(BMC)的数量。结果:ICA具有保护小鼠胸腺、骨髓免受Cy损伤的作用。不同剂量的ICA组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力增加,巨噬细胞吞噬能力和分泌细胞因子的能力均增强,外周血红细胞、白细胞和血小板数量均明显上升。结论:ICA可逆转Cy化疗后小鼠骨髓造血和免疫功能的抑制状况。     

银杏内脂B抑制NF-κB P65磷酸化对内毒素诱导的小鼠心肌炎损伤的保护作用

目的:探索银杏内脂B对内毒素诱导的小鼠心肌炎损伤的影响及分子机制。方法:小鼠分为对照组、银杏内脂B组、内毒素组和内毒素+银杏内脂B组。H-E染色检测心肌组织病变。ELISA检测心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β水平。免疫印迹检测caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-κB P65和p-NF-κB P65蛋白水平。结果:银杏内脂B可改善内毒素诱导的心肌组织病变。银杏内脂B可抑制内毒素诱导的cTnⅠ、Mb、CK-MB和LDH水平的升高。银杏内脂B可抑制内毒素诱导的caspase-3和Bax表达的上升和Bcl-2表达的下降。而且,银杏内脂B可抑制内毒素诱导的TNF-α,IL-6和IL-1β水平的升高。另外,银杏内脂B可抑制内毒素诱导的p-P65/P65比值的上升。结论:银杏内脂B可通过抑制NF-κB P65磷酸化减轻内毒素诱导的小鼠心肌炎损伤。     

淫羊藿苷对ConA诱导的小鼠肝脏损伤保护机理的研究

目的:利用刀豆蛋白A(ConA)诱导建立小鼠肝炎模型,观察淫羊藿苷对该损伤模型保护作用的细胞免疫学和分子免疫学机制。方法:采用C57BL/6雄性小鼠,随机分为淫羊藿苷+ConA组、生理盐水+ConA组、淫羊藿苷+生理盐水组。小鼠尾静脉注射ConA,建立T细胞介导的免疫性肝脏损伤模型;采用转氨酶试剂盒测定各组小鼠血液中转氨酶含量;组织病理学观察实验小鼠肝脏组织和肝细胞坏死变化;采用ELISA试剂盒测定血清中炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α含量;流式细胞术观察注射ConA后肝脏淋巴细胞的活化变化。结果:与ConA对照组相比,淫羊藿苷干预组小鼠血液中ALT和AST水平明显降低,P<0.01;IFN-γ、TNF-α含量明显降低,P<0.05;H&E染色可见淫羊藿苷干预组小鼠肝细胞核完整,未见炎性细胞的浸润,而ConA对照组小鼠肝细胞核固缩,部分核膜破裂,肝组织内有炎症细胞和红细胞浸润;流式细胞技术发现淫羊藿苷可明显延缓由ConA引起的肝脏NKT细胞的活化,减弱T细胞的浸润。结论:淫羊藿苷对ConA诱导的小鼠肝脏损伤有明显的保护作用,其机理可能与淫羊藿苷降低血液中IFN-γ、TNF-α表达及影响肝脏NKT细胞的活化有关。     

淫羊藿苷(ICA)对化疗后免疫抑制小鼠的免疫促进作用

目的:通过观察淫羊藿苷(ICA)对化疗药环磷酰胺(Cy)所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响,探讨ICA促进免疫功能的作用及机理.方法:除正常组小鼠外,所有小鼠经腹腔注射Cy(300 mg/kg);第二天开始给予实验组小鼠灌胃不同剂量的ICA[150、80、40 mg/(kg·d)],阳性对照组小鼠尾静脉注射参芪扶正注射液(1 ml/d),模型组给予等量生理盐水,连续干预10天.所有小鼠均于末次给药12小时后处死,计算胸腺指数(TI)和脾指数(SI),光镜下计数外周血和脾淋巴细胞数量.MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应.ELISA法检测TNF-α的含量.乳酸脱氢酶实验(LDH)检测小鼠脾脏NK和CTL细胞的活性.流式细胞术(FACS)检测脾淋巴细胞中NKT和CD3+T细胞的比例.结果:模型组小鼠以上各项免疫指标均有所下降.ICA处理组小鼠脾脏指数和胸腺指数均升高(P<0.01),脾淋巴细胞数量显著增加(P<0.01),但未达到正常对照组水平;ICA明显提高小鼠脾淋巴细胞的增殖反应,促进了小鼠脾NK和CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性(P<0.01),提高了小鼠脾细胞TNF-α的产生(P<0.01).ICA处理组小鼠脾细胞中CD3+T、NKT细胞比例明显增加(P<0.01).结论:ICA能促进小鼠免疫功能,具有逆转化疗后小鼠免疫抑制状态的作用.     

淫羊藿苷对胰腺癌细胞BxPC-3增殖和凋亡的影响与miR-9上调有关

目的:探讨淫羊藿苷对胰腺癌细胞增殖和凋亡的作用及机制.方法:MTT法检测细胞活性确定给药浓度.对照组、淫羊藿苷12.5、25、50μmol/L组BxPC-3细胞用终浓度含有Icariin 0、12.5、25、50μmol/L培养基培养;顺铂10μmol/L组BxPC-3细胞用终浓度含有顺铂10μmol/L培养基培养;m...     

厚果崖豆藤提取物抑制NF-κB p65 的活化对三阴性乳腺癌细胞增殖、凋亡和转移的影响

目的:本研究探索厚果崖豆藤提取物MIL对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖、凋亡和转移的影响。方法:将MDA-MB-231细胞随机分为4组,分别在4组细胞的血清DMEM培养基中加入0、2、4、8μmol/L的MIL继续培养,用CCK8试剂盒检测处理细胞存活率;EDU染色检测细胞增殖状态;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell实验观察细胞侵袭的情况;RT-PCR检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达;免疫印迹法检测NF-κB p65蛋白表达变化;免疫荧光检测p65的细胞核转位情况。结果:MIL对MDA-MB-231细胞有毒性作用,其毒性作用呈一定的剂量关系(P0.05)MIL浓度大于16μmol/L时,细胞存活率显著降低(P0.05);2、4、8μmol/L MIL三个处理组增殖抑制作用较0μmol/L MIL处理组明显(P0.05); 2、4、8μmol/L MIL三个处理组细胞凋亡率较0μmol/L MIL处理组明显升高,但差异无统计学意义;与对照组比较,MIL加药组显著抑制细胞增殖(P0.05);而对细胞凋亡率无显著影响;4μmol/L和8μmol/L两个浓度的MIL对MDA-MB-231细胞侵袭能力有显著的抑制作用(P0.05);与0μmol/L MIL处理组对照组比较,2μmol/L、4μmol/L和8μmol/L MIL处理MIL加药组组Vimentin mRNA的表达均显著降低(P0.05);4μmol/L和8μmol/L MIL两个处理组E-cadherin mRNA的表达均显著升高(P0.05),N-cadherin mRNA的表达均显著降低(P0.05);4μmol/L和8μmol/L MIL两个处理组p65磷酸化水平较0μmol/L MIL处理组显著降低(P0.05)。4μmol/L和8μmol/L两个浓度的MIL明显抑制p65的核转位(P0.05)。结论:MIL通过抑制NF-κB p65的活化有效抑制MDA-MB-231细胞增殖、侵袭能力并促进其发生凋亡,表明MIL对三阴性乳腺癌有缓解作用。     

淫羊藿苷对过载损伤后成骨细胞凋亡和骨架的影响

目的研究淫羊藿苷对过载损伤后成骨细胞的凋亡和细胞骨架的影响。方法应用4点弯曲加载装置模拟过载损伤力学环境,建立过载损伤模型,依据力学加载前后是否加入药物干预,实验分为空白对照组、单纯给药组、单纯损伤组、预防给药组和损伤治疗组。应用细胞流式术进行细胞凋亡检测。应用特异性荧光染料分别标记微丝蛋白和细胞核,在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的变化。结果与对照组比,过载损伤组的凋亡率最高,单纯给药组最低(P0.05);在过载处理组中,与单纯过载损伤组比,预防给药组的凋亡率最低(P0.05)。单纯过载损伤组的细胞皱缩变形,微丝排列紊乱,骨架排列疏松,轮廓模糊,骨架甚至出现破碎等现象。预防给药组细胞骨架形态变化不大,细胞核未见明显变化。结论淫羊藿苷可以在一定程度上抑制过载损伤后成骨细胞的凋亡,维持细胞骨架稳定。     

川产淫羊藿对羟基脲阳虚小鼠IL－2活性的影响

川产淫羊藿对羟基脲阳虚小鼠ＩＬ－２活性的影响肖崇厚，孙奕，骆永珍，董晓萍，孟宪丽，张艺，沈文龙（成都中医药大学成都６１００７５）用小鼠脾细胞￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测了四川产巫山淫羊藿和柔毛淫羊藿的正丁醇总提物对羟基脲阳虚模型小鼠ＩＬ－２活性的影响，其...     

淫羊藿甙对小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖的影响

目的研究淫羊藿甙(ICA)对刀豆蛋白A(ConA)刺激的小鼠T淋巴细胞体外早期活化和增殖的影响。方法以MTT法检测T细胞药物毒性;利用流式细胞术(FCM)结合双色荧光抗体染色技术检测早期活化标志CD69分子的表达;运用流式细胞术结合活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)染色技术和荧光抗体染色技术检测T细胞增殖。结果ICA在终浓度0.3、1.5、3.0μmol·L-1时对于CD69的表达以及淋巴细胞48和72h增殖,均有明显的抑制作用(P<0.01)。结论ICA能抑制ConA刺激的小鼠T淋巴细胞的早期活化和增殖,并呈剂量依赖性,即在最高浓度3.0μmol·L-1时抑制率最强。     

淫羊藿苷对小鼠皮肤成纤维细胞重编程为心肌样细胞的作用

目的研究小鼠成纤维细胞重编程为心肌样细胞(induced cardiomyocytes,iCMs)过程中淫羊藿苷(icariin,ICA)的作用及心血管发育中胚层相关蛋白1(mesoderm posterior 1,Mesp1)的表达。方法 MTT法筛选ICA的最佳药物浓度。GMT转染小鼠皮肤成纤维细胞,建立重编程心肌样细胞模型。qRT-PCR检测转染后重编程细胞中肌球蛋白重链6(myosin heavy chain 6, Myh6)的mRNA表达,免疫荧光细胞化学方法检测心肌肌钙蛋白I (cardiac troponinI, cTnI)及Mesp1的表达情况。结果 ICA最佳药物浓度为10-7mol/L。ICA组诱导iCMs高表达cTnI,是GMT组的1.3倍。Myh6 mRNA在重编程第3周达到高峰,且ICA组显著高于GMT组(P0.01)。Mesp1与c TnI的表达趋势正好相反。结论 ICA可以提高成纤维细胞重编程为心肌样细胞的效率;Mesp1参与促进成纤维细胞重编程的过程。     

淫羊藿次苷Ⅱ对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响及其机制研究

目的:研究淫羊藿次苷Ⅱ对正常小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响,并初步探讨其机制。方法:不同浓度的淫羊藿次苷Ⅱ与刀豆素A(Concanavalin A,ConA)体外处理小鼠脾淋巴细胞,观察淫羊藿次苷Ⅱ对细胞增殖的影响,初步确定其发挥作用的最佳浓度;然后以最佳浓度淫羊藿次苷Ⅱ在不同时间点与ConA协同处理细胞,采用细胞增殖-毒性检测试剂盒检测增殖能力;运用流式细胞仪检测细胞周期分布;用荧光定量分析仪检测细胞内游离Ca2+浓度的变化。结果:淫羊藿次苷Ⅱ在10-12～10-9mol/L的浓度范围作用48小时,对细胞增殖有一定的促进作用,呈浓度依赖性。在10-7～10-4mol/L范围出现抑制作用。以10-9mol/L的淫羊藿次苷Ⅱ处理细胞,发现其与ConA在不同时间点促进细胞增殖作用显著优于ConA单独应用;并且促进细胞由G0/G1期进入S与G2/M期,并以第24小时效果更明显;促进细胞内Ca2+浓度升高,效果以第12小时最明显。结论:不同浓度的淫羊藿次苷Ⅱ对小鼠脾淋巴细胞增殖具有促进作用,有浓度、时间依赖性,这种促增殖作用的机制可能与升高细胞内Ca2+浓度,进而加快细胞由G0/G1期进入S与G2/M期有关。     

淫羊藿苷对IgA肾病大鼠纤维化和炎症反应的调控作用

目的Ig A肾病(Ig A nephropathy,Ig AN)是最常见的原发性肾小球肾炎。本文旨在探索淫羊藿苷对Ig AN大鼠纤维化和炎症反应的影响。方法牛血清球蛋白(bovine gamma globulin,BGG)处理建立Ig AN大鼠模型。免疫组化和蛋白印迹检测转化生长因子β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1),IV胶原蛋白(type IV collagen,Col IV)和纤连蛋白(Fibronectin)1蛋白水平。酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β),IL-6和IL-18水平。蛋白印迹分析细胞核中抗肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、NF-κB P65和抗血管细胞黏附蛋白(vascular cell adhesion protein 1,VCAM-1)表达。结果与对照组相比,Ig AN模型组尿蛋白,血清肌酐和尿素氮水平明显升高(P<0.05)。模型加药组尿蛋白,血清肌酐和尿素氮水平明显低于Ig AN模型组(P<0.05)。Ig AN模型组TGF-β1、Col-IV和Fibronectin 1表达水平显著高于对照组(P<0.01)。淫羊藿苷处理Ig AN模型大鼠后,TGF-β1、Col-IV和Fibronectin 1表达水平明显下降(P<0.05)。而且,Ig AN模型组血清中IL-1β、IL-6和IL-18水平明显高于对照组(P<0.05)。与Ig AN模型组相比,模型加药组IL-1β、IL-6和IL-18水平明显降低(P<0.05)。另外,Ig AN模型大鼠肾脏组织细胞核的NF-κB P65、TNF-α和VCAM-1蛋白水平显著高于对照组(P<0.01)。与Ig AN模型组相比,模型加药组大鼠肾脏组织细胞核的NF-κB P65、TNF-α和VCAM-1蛋白水平明显下降(P<0.05)。结论淫羊藿苷可改善Ig AN大鼠纤维化水平并抑制炎症反应。