刚地弓形虫感染对宿主细胞信号转导的影响

刚地弓形虫在入侵和寄生于宿主细胞,引起急性与慢性感染的过程中,对宿主细胞进行精细的、整体的调控,在激发和抑制宿主免疫反应之间保持一个精细的平衡,保证弓形虫在宿主细胞内成功地生存增殖,并有机会传播给终末宿主;在此过程中宿主细胞的信号转导发生广泛的应激变化,在弓形虫入侵、寄生过程中及与弓形虫-宿主相互关系中起着重要作用。本文拟从5个方面综述弓形虫感染对宿主细胞信号通路的调控作用:①弓形虫分泌蛋白调控宿主细胞信号转导,②弓形虫调节宿主天然免疫、保护性免疫相关的细胞信号通路,③弓形虫调控与抗凋亡及细胞周期相关的宿主细胞信号转导,④弓形虫调节宿主细胞钙离子信号通路,⑤弓形虫调节与细胞结构重组相关的宿主细胞信号转导。     

刚地弓形虫速殖子表面抗原的研究及应用

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫, 能感染包括人在内的所有温血动物。近年来弓形虫速殖子表面抗原已成 为候选的诊断和疫苗抗原, 主要包括P30、 P22、 P43、 P35和P23等, 本文就此做一综述。     

刚地弓形虫RH株速殖子在HeLa细胞系体外培养的实验观察

目的 建立稳定高效的刚地弓形虫RH株速殖子(以下简称弓形虫速殖子)体外培养模型。 方法 ①将HeLa细胞（1×10⁴个）接种置于细胞培养皿内底部的盖玻片,12 h后将纯化的弓形虫速殖子接种于细胞培养皿（1×10⁴个/皿）,继续培养0.5～96 h,观察弓形虫速殖子在HeLa细胞内增殖情况;②将纯化的弓形虫速殖子接种于HeLa细胞后分为2组,一组于37 ℃分别培养24～120 h后,移入25 ℃培养120 h;另组于37 ℃培养48 h后,移入25 ℃分别培养72～168 h,观察不同温度和时间对弓形虫速殖子产率和活虫率的影响;③当培养的HeLa细胞80%发生细胞融合时更换速殖子培养液,同上法12 h后接种纯化的弓形虫速殖子进行培养,当80% HeLa细胞被感染增殖的弓形虫速殖子涨破时,收集、计数弓形虫速殖子,并用其感染（3×10⁶个/瓶）新的HeLa细胞,观察其连续传代情况;④每隔5代取弓形虫速殖子,腹腔接种昆明小鼠（3×10⁶个/只）,观察小鼠存活时间、评价该体外培养条件对弓形虫速殖子毒力的影响。 结果 接种弓形虫速殖子96 h后HeLa细胞均被感染及涨破,培养弓形虫速殖子30代（3～4 d为1代）增殖稳定,每代获得弓形虫速殖子1×10⁷～5×10⁷个,增殖5～20倍。各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为5.80～6.40 d, 毒力未见减弱(P>0.05)。HeLa细胞接种弓形虫速殖子,于37 ℃培养72 h后,移至25 ℃培养120 h,其产率高达40倍以上,活虫率为90%以上,仅残留极少量Hela细胞。 结论 刚地弓形虫RH株速殖子可在HeLa细胞中增殖并长期稳定传代。     

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅱ．RH株速殖子细胞培养上清对成囊株速殖子侵入细胞的影响

本文以ＲＨ株细胞培养上清（ＳＲＣ）替代ＰＬＡ２加入培养系统，对三株成囊株４次培养及与含ＰＬＡ２对照培养的观察表明，含ＳＲＣ的培养系统较常规培养检出时间提前，阳性率提高，在本文条件下与含ＰＬＡ２４０Ｕ者效果相当，提示ＳＲＣ可作为ｐＬＡ２的廉价实用的替代物用于弓形虫病的病原检测。     

刚地弓形虫热激蛋白70对宿主抗弓形虫感染的作用

感染弓形虫的小鼠在死前可检出弓形虫的热激蛋白70（TgHSP70）的表达迅速增加，表明该分子可作为弓形虫急性致死性感染的危险信号。对经口感染10个Fukaya株包囊的小鼠在感染的0、1、2、3d分别腹腔注射100、300、600和1000μg重组TgHSP70，对照组注射载体蛋白。弓形虫感染3d的小鼠腹腔注射1000μg重组TgHSP70后，在9d内全部死亡。而感染0、1、2d腹腔注射相同剂量重组TgHSP70的小鼠存活超过6个月（P〈0、01）。TgHSP70是表达在速殖子上的毒力分子，按照该毒力分子的不同，把速殖子分成2类：表达低水平TgHSP70的破坏型速殖子和表达高水平TgHSP70的毒力型速殖子。     

刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌细胞ct26体外增殖和细胞周期的影响

目的研究刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌ct26细胞体外增殖和细胞周期的影响,并探讨其作用的分子机制。方法取对数生长期的小鼠结肠癌ct26细胞,建立弓形虫与ct26复合感染度(moi)分别为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1的共培养试验模型,台盼兰排斥试验连续7d绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测8∶1共培养模型组6h、12h、24h、48h细胞周期改变;采用半定量RT-PCR方法分别检测ct26细胞cyclinB1、cdc2基因转录水平变化;Westernblot方法检测细胞周期蛋白cyclinB1蛋白水平变化。结果台盼兰排斥试验发现各比例组弓形虫均能有效抑制小鼠ct26细胞的体外增殖,且呈现前4d缓慢抑制,4d后细胞大量死亡的现象,以8∶1模型组的增殖抑制作用最明显,感染7d后细胞抑制率达80.77%(P0.01);流式细胞仪检测发现8∶1模型组弓形虫可在各作用时间明显改变ct26细胞周期分布,使G0/G1期细胞百分比下降,G2/M期百分比显著升高(P0.01),24h达到作用高峰,使G2/M期百分比升高12.77%,48h则细胞G2/M期百分比下降;弓形虫感染ct26细胞3～24h,细胞cdc2转录水平在各个时间点未见明显变化,细胞cyclinB1从转录水平和蛋白水平均呈现为感染3h时表达增强,随后各时间点均明显降低的现象,cyclinB1基因转录水平在感染后24h只达到对照组的16.55%。结论弓形虫RH株速殖子可明显抑制小鼠结肠癌ct26细胞体外增殖,感染前期以诱导细胞发生G2/M期阻滞为主要机制,细胞周期蛋白cyclinB1活性下降在G2/M期阻滞中起主要作用。     

刚地弓形虫细胞培养的研究：II.RH株速殖子细胞培养上清对成囊株速…

本文以ＲＨ株细胞培养上清（ＳＲＣ）替代ＰＬＡ２加入培养系统，对三株成囊株４次培养及与含ＰＬＡ２对照培养的观察表明，含ＳＲＣ的培养系统较常规培养检出时间提前，阳性率提高，在本文条件下与含ＰＬＡ２４０Ｕ者效果相当，提示ＳＲＣ可作为ＰＬＡ２的廉价的实用的替代物用于弓形虫病的病原检测。     

弓形虫速殖子侵入宿主细胞机理的研究进展

弓形虫速殖子侵入宿主细胞机理的研究进展梁志慧综述徐麟鹤审校刚地弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）是专性细胞内寄生虫，入侵宿主细胞乃是弓形虫生存的必要条件［１］。弓形虫速殖子入侵宿主细胞的过程及机理极其复杂，可归纳为５个方面：１．细胞识别，２．...     

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅰ．磷脂酶A2对成囊株速殖子侵入细胞的影响

已知多种酶和细胞因子对弓形虫侵入细胞有促进或抑制作用。本研究旨在探讨利用对弓形虫侵入细胞有促进作用的因子提高以细胞培养作病原诊断的敏感性。以激素弱化的小鼠接种成囊株包囊获得速殖子，以单核细胞ＴＨＰ－１细胞系的培养系统定量接种速殖子并加入源自蛇毒的磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２），以免疫荧光法和流式细胞仪检测细胞感染率。结果表明ＰＬＡ２对弱毒株速殖子侵入细胞有明显促进作用，在４株成囊株培养不同时间的检测，其感染细胞比率均比对照有显著提高。     

外源性一氧化氮对弓形虫速殖子凋亡的诱导作用

目的　探讨一氧化氮 (NO)是否能诱导弓形虫速殖子凋亡。方法　采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的原位末端标记法 (TUNEL)、透射电镜和琼脂糖凝胶电泳检测弓形虫速殖子凋亡的特征。结果　TUNEL标记法检测表明 ,NO供体亚硝基铁氰化钠 (SNP)可诱导弓形虫速殖子凋亡 ,并呈剂量和时间依赖性 ;NO清除剂 ,N 乙酰半胱氨酸能明显抑制SNP诱导的弓形虫速殖子凋亡 ;不含NO的SNP类似物 ,铁氰化钾不能诱导弓形虫速殖子凋亡。透射电镜下见SNP处理 15～ 2 0h的速殖子具有凋亡的典型形态学特征 :核染色质凝集、核固缩、核碎裂和凋亡小体形成。琼脂糖凝胶电泳显示SNP处理的弓形虫速殖子DNA片段呈现凋亡特征性的梯形条带。结论　从形态学和生化特征证明由SNP释出的NO可诱导弓形虫速殖子凋亡     

VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的毒力研究

目的探究VEG株弓形虫卵囊对中国昆明小鼠的致病性。方法分别选择1个,100个~108个的VEG株弓形虫卵囊灌胃昆明小鼠,采用MAT、HE和IHC方法研究小鼠对弓形虫的感染情况,并分析小鼠感染率,生存率及其大脑内的弓形虫包囊数量。结果≥10~2个VEG株弓形虫卵囊可引起小鼠100%感染,最低致死剂量为10~2个卵囊,100%致死剂量为108个卵囊,急性期死亡时间为7DPI~14DPI,弓形虫的成囊率是32.14%(9/28),包囊数量为9~857个/只小鼠大脑,感染小鼠生存率为67.44%(29/43),最长存活时间≥390DPI。结论 VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的毒力中等,包囊形成率较高。     

丝裂原蛋白激酶抑制剂U0126对刚地弓形虫侵入宿主细胞的影响

目的观察丝裂原蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases,MAPK)抑制剂对刚地弓形虫侵入宿主细胞的影响。方法以丝裂原蛋白激酶抑制剂U0126分别以不同浓度加入分孔培养的细胞中,于不同时间分别用吉氏染色和流式细胞仪(FCM)检测其宿主细胞感染速殖子的差异。结果吉氏染色检测在以U01261μM,10μM和100μM作用3小时下其感染率分别比对照组下降了20.22%(,P<0.01),52.91%(P<0.01)和75.27%(P<0.01);在作用6小时及9小时其感染率分别比对照组下降了32.88%(P<0.01),57.24%(P<0.01),79.21%(P<0.01)和41.26%(P<0.01),54.73%(P<0.01),80.80%(P<0.01)。FCM检测结果与之相似。结论U0126通过作用于MAPK信号传导途径而明显抑制弓形虫速殖子侵入宿主细胞。     

刚地弓形虫速殖子侵入宿主细胞涉及的丝裂原蛋白激酶信号途径的研究

丝裂原蛋白激酶（MAPKs）是一类存在于所有真核细胞的丝／苏氨酸蛋白激酶,在真核细胞的信号转导过程中起着至关重要的作用。MAPKs磷酸化激活多种转录因子,影响基因表达,调节细胞增殖、分化、凋亡等过程,并在弓形虫速殖子侵入宿主细胞的信号转导中有着重要的意义。     

ERK1/2信号途径与弓形虫侵入细胞及胞内增殖关系的研究

目的探讨阻断细胞外蛋白调节激酶(ERK1/2)信号途径对弓形虫速殖子侵入宿主细胞及在胞内增殖的影响。方法姬氏染色法检测ERK1/2途径不同时间及不同剂量的抑制剂U0126或PD98059作用下宿主细胞感染弓形虫速殖子的百分率,根据细胞感染率和感染细胞内虫荷量分析ERK1/2途径抑制剂对速殖子在细胞中增殖的影响。结果速殖子在细胞培养系统中以1、10和100μmol/L U0126或PD98059作用3 h、6 h和9 h后,前者细胞培养孔中的细胞感染率分别较对照组平均下降34.62%(P<0.01)、53.55%(P<0.01)和67.76%(P<0.01),后者分别较对照组平均下降22.67%(P<0.01)、52.21%(P<0.01)和58.99%(P<0.01);感染细胞感染速殖子率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论阻断ERK1/2途径的不同信号位点对弓形虫速殖子侵入宿主细胞影响不同,ERK1/2途径在速殖子侵入宿主细胞起主要作用,但对侵入后的增殖无明显影响。     

弓形虫入侵的宿主细胞骨架重塑触发线粒体重新分布

目的探讨宿主细胞骨架重塑在弓形虫侵入HFF细胞以及触发细胞线粒体重新分布中的作用。方法体外培养HFF细胞,预先用1 μg/mL细胞松驰素D(CD)处理30 min,接种弓形虫速殖子分别培养1 h和20 h,Western blotting检测弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)1蛋白表达。同时用MitoTracker^􀆿 Red CMXRos荧光探针标记细胞线粒体,激光共聚焦显微镜下观察HFF细胞线粒体在弓形虫侵入前后和CD处理前后聚集和分布情况。结果感染后1 h,CD处理组HFF细胞内虫体量与CD未处理组差异不大,20 h时CD未处理组细胞内虫体量显著多于CD处理组。此时可见HFF细胞线粒体明显聚集成明亮点状且分布于纳虫泡周围,而未感染组细胞线粒体未见明显聚集分布。CD可以显著抑制弓形虫侵入HFF细胞后引起的线粒体聚集。结论触发宿主细胞骨架重塑是弓形虫侵入宿主细胞并引起细胞线粒体向纳虫泡聚集所必须的。     

Opsonization of Toxoplasma gondii tachyzoites with nonspecific immunoglobulins promotes their phagocytosis by macrophages and inhibits their proliferation in nonphagocytic cells in tissue culture

We have recently shown that Toxoplasma gondii tachyzoites grown in in vitro culture can bind unspecific immunoglobulin (Ig) through their Fc moiety. We show now that Fc receptors are also present on T. gondii within the host animal, and that intraperitoneal parasites in immunocompetent mice are saturated with unspecific Ig. We have also investigated the effect of the parasite's Fc receptor on the interaction of tachyzoites with mammalian cells, using the Vero cell line as a model for nonphagocytic host cells and murine peritoneal macrophages in primary culture as a model for phagocytic cells. Coating of tachyzoites with parasite-unrelated Ig did not enhance their invasive capacity in either target cell type, but slightly decreased the parasite proliferation. Moreover, phagocytosis by macrophages was increased by approximately 50% when parasites were coated with unspecific Ig. These results indicate that the Fc receptor on T. gondii affects the balance between invasion and phagocytosis in a way that is detrimental to the parasites.     

尖吻蝮蛇蛇毒对刚地弓形虫侵入宿主细胞的作用研究

目的　观察细胞培养系统中宿主细胞在不同剂量源自皖南地区的尖吻蝮蛇 (Agkistrodonacutus)蛇毒的作用下感染刚地弓形虫速殖子百分率的差异 ;探讨运用蝮蛇蛇毒作为辅助因子提高细胞培养用于弓形虫病病原学诊断的敏感性。方法　以尖吻蝮蛇蛇毒加入分孔培养的Hela细胞和THP - 1细胞中 ,分别用IFA和流式细胞仪进行检测 ,观察尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞的影响。结果　在相同的时间内 ,在尖吻蝮蛇蛇毒的作用下 ,Hela细胞和THP - 1细胞感染弓形虫速殖子的百分率在不同的时段均明显的提高。结论　尖吻蝮蛇蛇毒可以促进弓形虫速殖子侵入宿主细胞 ,在实际应中 ,可以作为一种辅助因子在检测标本时提高速殖子检出率 ,有利于缩短弓形虫的检出时间     

男性不育精浆弓形虫感染与生精细胞凋亡关系的研究

目的探讨男性不育精浆弓形虫感染与生精细胞凋亡及精子凋亡与男性不育关系。方法应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧核苷酸原位末端标记法(TUNEL)检测正常生育、不育男性精液中的生精细胞凋亡。结果男性不育精浆弓形虫感染组生精细胞凋亡率为(14．17± 7．16)％,显著高于男性不育弓形虫感染阴性组生精细胞凋亡率(12．22±6．18)％(P<0．05)。男性不育组精子凋亡发生率为(13．76±9．19)％,显著高于正常生育组男性精子凋亡发生率(4．28± 1．67)％(P<0．01)。结论精子凋亡与男性不育有着密切关系,弓形虫感染可引起生精细胞凋亡。     

丝裂原激活蛋白激酶抑制剂对弓形虫速殖子侵入宿主细胞信号转导途径的阻断效应

目的观察丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)抑制剂对弓形虫速殖子侵入细胞的影响。方法 IFA 荧光标记检测在不同剂量抑制剂作用下及在不同时间其宿主细胞感染速殖子的差异;SDS-PAGE 和 Western blot 分析 MAPK 的表达及其相对活性。结果在 PD980591μM 和10μM 作用下其感染率仅分别为对照组的18.00%(u=9.03,P<0.01)和14.80%(u=7.93,P<0.001);在 PD98059 50μM 作用下宿主细胞感染率在24h 和48h 分别为对照组的55.45%(u=3.58,P<0.01)和49.15%(u=4.08,P<0.01);与对照比较,其 MAPK 的相对活性明显下降,10μM 和50μM 组分别降低了43.03%(u=2.72,P<0.01)和78.79%(u=5.74,P<0.001)。结论 PD98059通过作用于 MAPK 信号转导途径而抑制速殖子侵入宿主细胞的过程。