L-NAME 对顺铂耳毒性影响的实验研究

目的本研究旨在通过建立顺铂内耳中毒的动物模型,探索一氧化氮合酶(NOS)在顺铂的耳毒性机制中的影响,为临床预防和治疗顺铂的耳毒性提供理论依据.方法将豚鼠随机分成三组.对照组给予生理盐水;试验组给予顺铂;拮抗组预先给予N-硝基-L-甲基-精氨酸(L-NAME)后再给顺铂.对耳蜗的iNOS的活性进行免疫组化的研究,对L-NAME对顺铂的耳蜗损害所起的作用进行扫描电镜观察.结果光镜下,对照组螺旋器的结构正常,呈iNOS阴性染色;试验组的内、外毛细胞明显变性,呈iNOS阳性染色.扫描电镜下,对照组内、外毛细胞的纤毛排列整齐;试验组的绝大部分内、外毛细胞的纤毛散乱,倒伏,甚至消失;拮抗组的大多数内、外毛细胞的纤毛排列整齐,少数可见纤毛融合或消失.结论一氧化氮(NO)在顺铂的内耳毒性作用机制中发挥着重要的作用,应用NOS的拮抗剂可以减轻其内耳毒性.     

顺铂对耳蜗单离听觉细胞一氧化氮合酶表达的影响

目的 探讨顺铂对耳蜗单离听觉细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS／NOSⅡ)表达的影响。方法 以单离毛细胞和单离螺旋神经节神经元为模型,用免疫组化方法(ABC法)研究顺铂对细胞内NOSⅡ表达的影响。结果 在1mM顺铂平衡盐溶液中室温下培养两小时的外毛细胞及培养半小时的单离螺旋神经元与对照组相比显示了对NOSⅡ抗体较强的免疫反应。结论 提示顺铂诱导了单离外毛细胞及单离螺旋神经元内NOSⅡ的合成增加,NO可能参与了顺铂的耳毒作用。     

磷霉素减轻顺铂耳毒性的实验研究

本文以听性脑干反应测听、扫描电镜为指标，观察磷霉素对顺铂耳毒性的拮抗作用．用药后顺铂组豚鼠4、8KHzABR阈均明显提高；顺铂 磷霉素组豚鼠仅8KHzABR阈提高。扫描电镜示顺铂组耳蜗第一、二国外毛细胞严重性嵌损；顺铂 磷霉素组耳蜗第一、二回病变轻微。结果表明磷霉素能有效地减轻顺铂引起的耳毒性。     

银杏叶提取物对顺铂耳蜗毒性的拮抗作用

目的 研究银杏叶提取物对顺铂耳毒性的拮抗作用。方法 杂色健康豚鼠27只，随机分为生理盐水组、顺铂（CDDP）组、银杏叶提取物（Egb CDDP）组，动态观察动物听阈变化及耳蜗外毛细胞形态学改变，并在损伤6天后，观察外毛细胞损伤率、耳蜗毛细胞凋亡情况。结果 CDDP组听阈及外毛细胞损伤率显著性升高，凋亡现象明显；Egb CDDP组外毛细胞的损伤率及听阈损伤均明显减轻，仅出现早期凋亡表现；生理盐水组各项指标均无明显变化。结论 Egb对顺铂所致的耳毒性具有明显拮抗作用。     

丹参对顺铂耳蜗毒性的防护作用

目前有研究发现一氧化氮(nitric oxide,NO)与顺铂导致的内耳毒性关系密切,增加的NO可能参与了顺铂的耳毒性作用。近来又有文献报道,丹参salvia miltiorrhiza)可以通过降低一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性以降低庆大霉素耳毒性。但是,丹参能否降低顺铂耳毒性,是否通过影响NOS表达来实现,目前尚未见报道。本研究拟采用顺铂内耳中毒的动物模型,通过免疫组织化学、图像分析、听性脑干反应测定、电镜观察等方法,来探讨顺铂耳蜗毒性的机制,以期寻求防治顺铂耳蜗毒性损伤的有效药物。     

电离辐射对耳蜗毛细胞超微结构的影响

目的 观察电离辐射对耳蜗毛细胞超微结构的损伤情况.方法 将健康豚鼠15只随机分成二组:单纯放射组(单放组)10只,对照组5只,每组观察10耳.对照组不放射,单放组用直线加速器所产生的6Mev电子线对豚鼠的耳颞部予以分次放射(2 Gy/天),总剂量达到60 Gy,行透射电镜及扫描电镜观察两组豚鼠耳蜗毛细胞的形态学变化.结果 透射电镜观察见对照组耳蜗外毛细胞边界清楚,细胞无肿胀,表皮板完整,线粒体嵴完整,核膜完整;单放组耳蜗外毛细胞边界不清,细胞肿胀变形,线粒体空泡变,线粒体嵴断裂,核膜不完整,异染色质增多.扫描电镜观察见对照组耳蜗外毛细胞的纤毛排列整齐无倒伏、缺失;单放组耳蜗外毛细胞的纤毛明显倒伏、缺失、排列紊乱.结论 分割剂量电离辐射对豚鼠耳颞部放射可造成耳蜗毛细胞超微结构损害.     

硫酸小诺霉素对豚鼠耳毒性的扫描电镜观察

为观察小诺霉素的耳毒性,本实验用硫酸小诺霉素80mg/kg/d给甲、乙两组豚鼠肌注,并用扫描电镜观察耳蜗内、外毛细胞和血管纹的表面结构。结果:甲组动物耳蜗底回外毛细胞出现散在的纤毛排列不齐、倒伏和部分融合等改变。乙组动物耳蜗底回外毛细胞纤毛出现高度肿胀,趋于相互融合,并有严重的纤毛崩解。二回第1,2排外毛细胞纤毛出现排列紊乱、倒伏,有散在的纤毛崩解。两组动物的内毛细胞无明显病变,但在内毛细胞的小皮板和柱细胞表面嵌接处均可见散在分布的、表面呈绒球状的颗粒突起。证明硫酸小诺霉素有一定的耳毒性。     

实验性微栓塞缺血豚鼠耳蜗cNOS的表达变化

目的 探究一氧化氮（nitricoxide，NO）在一过性微栓塞耳蜗缺血性损伤中的作用。方法 20只豚鼠随机分为实验组和对照组各10只，实验组动物通过磁微粒栓塞造成实验性耳蜗缺血模型；以扫描电镜观察缺血耳蜗听纤毛变化；以免疫组织化学方法观察原生型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS）在两组耳蜗的表达变化。结果 实验性耳蜗缺血造成内外毛细胞听纤毛散在的粘结、倒伏或缺失，内毛细胞听纤毛病变明显；内皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）表达分布于蜗轴及内侧螺旋板内神经纤维、螺旋神经节、内侧螺旋缘、Corti器细胞及血管纹／螺旋韧带区；神经型一氧化氮合酶（neuron NOS，nNOS）主要分布于蜗轴及内侧螺旋板内神经纤维、螺旋神经节细胞，在Corti器细胞、血管纹细胞及内侧螺旋缘上皮细胞有较弱的表达；实验性缺血组豚鼠耳蜗与正常对照组耳蜗原生型一氧化氮合酶的表达无差异。结论 微栓塞耳蜗缺血引起散在听毛细胞损伤；两种原生型NOS在耳蜗固有表达，分布有交叉，功能存在相互代偿，但未发现因微栓塞缺血而引起变化。     

顺铂及其耳毒性

顺铂是一种用于化疗的铂制剂，在临床上广泛应用于抗肿瘤治疗。然而由于顺铂所具有的肾毒性和耳毒性以及神经毒性等毒副作用，致使其临床应用受到一定的限制。顺铂损害耳蜗的三个主要靶目标分别是血管纹和毛细胞以及螺旋神经节，这三个靶目标在顺铂的作用下都以细胞凋亡的方式实现其程序化自我毁灭，因此顺铂耳中毒模型是一个典型的内耳细胞凋亡模型。顺铂造成的细胞内氧自由基活动增加和抗氧化酶类的活性丧失是产生细胞损害的重要因素之一，因而抗氧化治疗可有效降低顺铂对耳蜗中上述三个靶目标的破坏程度。顺铂在Caspase（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）径路上激发的毛细胞凋亡是首先启动Caspase－8的活动，说明毛细胞膜表面的细胞死亡因子受体是顺铂诱导毛细胞凋亡的一根导火索；螺旋神经节细胞的凋亡却是被顺铂同时启动了Caspase－8和Caspase－9，因此螺旋神经节细胞的凋亡不但是因为细胞膜表面的死亡因子受体因受顺铂刺激而发出凋亡的信号，而且还会被从线粒体释放出的细胞色素C启动其凋亡自毁程序。肿瘤抑制基因p53是出现在顺铂耳中毒早期的一个促使细胞凋亡的重要“杀手”，应用Superarray技术发现顺铂激发的耳蜗毛细胞和螺旋神经节凋亡基因主要涉及p53，肿瘤坏死因子家族，Death domain family（死亡结构域家族），Bcl－2family，Card family（Caspase相关的招募域家族），和GTP signal transdution（三磷酸鸟苷信号转导）等多条凋亡通路，其中p53信号通路是顺铂诱导毛细胞和螺旋神经节凋亡的主线，因此应用p53抑制剂－Pifithrin仅可以通过有效阻止p53的活动而减轻顺铂诱导的毛细胞凋亡。分裂素激活的蛋白激酶在顺铂诱导的内耳细胞凋亡过程中也扮演了重要的角色．应用PD98059可以通过暂时抑制分裂素激活的蛋白激酶活性和p53磷酸化以及Caspase的活动延迟耳蜗毛细胞凋亡的起始阶段，但不能完全阻止病变的扩展，因而PD98059对顺铂引起的耳蜗毛细胞凋亡仅具有短期保护效应。     

5－BrdU 标记骨髓间充质干细胞对顺铂耳中毒豚鼠耳蜗的保护作用

目的：探讨5－BrdU（5－bromo－2－deoxyuridine）标记的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）植入豚鼠耳蜗后的生长情况及对顺铂耳中毒豚鼠耳蜗的保护作用。方法20只健康豚鼠,随机抽取4只豚鼠的骨髓,分离培养 MSCs,用5－BrdU 标记 MSCs。另16只豚鼠建立顺铂耳毒性模型,建模前后分别进行ABR 检测。然后每只豚鼠左侧耳蜗注射5－BrdU 标记的 MSCs,右侧耳蜗注射生理盐水,注射后1、4 w 豚鼠 ABR检测后断头取耳蜗做石蜡切片和耳蜗毛细胞铺片,BrdU 免疫化学观察耳蜗内 MSCs 存活情况。结果顺铂耳毒性模型豚鼠右侧耳蜗注射 MSCs 1、4 w 后,ABR 反应阈（25．07±0．12、20．07±0．14 dB SPL）随着时间延长逐渐恢复,左侧耳蜗注射生理盐水1、4 w 后,ABR 反应阈（31．07±0．08、32．07±0．14 dB SPL）随着时间延长无变化。耳蜗毛细胞铺片及耳蜗 BrdU 免疫组织化学显示右侧耳蜗移植术后1 w 可见部分棕黄色颗粒,BrdU 染色阳性细胞,排列不规则,移植术后4 w 耳蜗内 BrdU 染色阳性细胞逐渐增多,排列逐渐规则,左侧耳蜗注射生理盐水后1、4 w均未见棕黄色颗粒。结论5－BrdU 标记 MSCs 耳蜗移植后可在耳蜗存活、增殖,其对顺铂耳毒性耳蜗具有保护作用。     

诱生型一氧化氮合酶在顺铂所致豚鼠耳蜗损伤中的表达

目的：检测诱生型一氧化氮合酶（iNOS）在顺铂所致豚鼠耳蜗损伤中的表达。方法：实验组豚鼠腹腔注射顺铂造成耳蜗损伤，对照组豚鼠腹腔注射等量生理盐水。用免疫组织化学的方法检测iNOS在耳蜗中的表达。结果：iNOS在实验组耳蜗的表达呈阳性，在对照组耳蜗的表达呈阴性。结论：iNOS在顺铂损伤耳蜗中呈阳性表达，iNOS催化产生大量NO而致耳蜗损伤。     

Smad5 基因敲除小鼠耳蜗扫描电镜观察

目的观察Smad5基因敲除杂合（3月组2只小鼠4只耳蜗）子小鼠内耳形态学超微结构变化。方法野生型动物组：1个月组4只小鼠5只耳蜗，2个月组及3个月组各有2只小鼠4只耳蜗：杂合子动物组1个月组3只小鼠3只耳蜗，2个月组2只小鼠4只耳蜗，3个月组3只小鼠6只耳蜗。按常规方法制成标本作扫描电镜观察。结果Smad5基因敲除杂合子小鼠扫描电镜观察：1月组耳蜗中均观察到耳蜗第一和第二圈外毛细胞有不同程度的静纤毛融合，未见外毛细胞缺失，内毛细胞未见明显地病理变化。2月组耳蜗中观察到第一和第二圈均可见内外毛细胞静纤毛不同程度缺失，有的部位以内毛细胞静纤毛缺失为主，而有的部位以外毛细胞静纤毛缺失为主，有的以片状缺失为主，有的则以散在性缺失为主。3个月组3只小鼠6只耳蜗中均观察到不同程度第一和第二圈内外毛细胞静纤毛广泛性缺失，有外毛细胞缺失的部位多，以第一排外毛细胞的静纤毛缺失为主．第二和第三排外毛细胞静纤毛多以散在性缺失为主，有内毛细胞缺失的部位多伴有外毛细胞静纤毛的大片状缺失。野生型动物组扫描电镜观察：1个月组4只小鼠5只耳蜗，2个月组2只小鼠4只耳蜗均未观察到内外毛细胞缺失和静纤毛的变化，3月组有少量的外毛细胞缺失。结论野生型小鼠2个月以内耳蜗毛细胞无明显变化．杂合子小鼠随着月龄的增加内外毛细胞缺失的程度逐渐加重。     

川芎嗪对庆大霉素耳中毒耳蜗外毛细胞和血管纹的保护作用

目的：探讨在庆大霉素（gentamycin，GM）耳中毒情况下，川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）对豚鼠耳蜗外毛细胞和血管纹边缘细胞的保护作用。方法：12只豚鼠随机分为GM组、联合用药组、TMP组及对照组，用药十天后处死，采用透射电镜观察耳蜗外毛细胞及血管纹边缘细胞超微结构，扫描电镜观察血管纹边缘细胞表面形态。结果：透射和扫描电镜显示，联合用药组外毛细胞及血管纹边缘细胞超微及表面结构破坏不均明显轻于庆大霉素组，特别是其中的线粒体结构破坏与数目减少更显著轻于庆大霉素组。结论：川芎嗪具有保护庆大霉素耳中毒耳蜗外毛细胞和血管纹结构的作用，从而拮抗庆大霉素耳毒性。     

离体培养时bFGF对顺铂耳蜗毒性的拮抗作用

目的 研究不同浓度的顺铂对耳蜗基底膜毛细胞的损伤、不同浓度的bFGF对顺铂耳蜗基底膜毛细胞损伤的保护作用以及caspase-9的表达。方法 对耳蜗基 底膜进行离体培养,用荧光染色方法对毛细胞数量和caspase-9的表达进行观察。结果 在不同浓度中,15μg/ml顺铂对基底膜毛细胞损伤最大;bFGF浓度≥100ng/ml时,对顺铂所致的基底膜毛细胞损伤具有良好的拮抗作用。结论 顺铂对耳蜗基底膜上毛细胞的损伤具有剂量依赖性; bFGF拮抗顺铂所致的耳蜗基底膜毛细胞的损伤;caspase-9的表达与bFGF对顺铂耳蜗毒性的拮抗作用相关。     

顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶表达的影响

目的：观察顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶（calpain ）表达的影响,探讨顺铂致耳蜗毛细胞凋亡的机制。方法取出生后3 d的昆明小鼠300只（600耳）,分离出耳蜗基底膜600条,体外培养24 h后,随机分为对照组和4、8、16μg／ml顺铂组,每组150条;对照组加入2ml新鲜培养基,顺铂组分别加入2 ml含不同浓度顺铂（4、8、16μg／ml）的新鲜培养基,再继续培养24 h后,应用Hoechst 33258荧光染色观察耳蜗毛细胞凋亡情况,并应用免疫荧光染色和免疫印迹（Western blot）技术检测calpain 1（μ－calpain）和calpain 2（m －calpain）在耳蜗毛细胞的表达。结果4、8、16μg／m l顺铂组耳蜗毛细胞凋亡率分别为15．63％±0．20％、38．40％±2．64％和64．24％±0．05％,均高于对照组（5．55％±0．12％）,呈现明显的量效关系;不同浓度顺铂组μ－calpain和m －cal‐pain的表达均较对照组明显增强（ P＜0．01）,且m －calpain的表达随顺铂浓度的增高而明显增强（ P＜0．01）。结论顺铂可通过calpain通路诱导小鼠耳蜗毛细胞凋亡,从而发挥毒性效应。     

单次不同放射线剂量和时间对Balb/c小鼠耳蜗显微和超微结构的影响

目的：观察单次不同放射剂量及时间对Balb／c小鼠耳蜗显微和超微结构的影响,探讨放射线所致感音神经性聋机制的形态学依据。方法：将16只健康Balb／c小鼠随机分成4组（对照组和3个实验组,每组4只）,实验组分别给予8、12、16Gy剂量的放射线照射,在照射后第3、7天处死小鼠,取耳蜗标本后行石蜡包埋、组织切片及苏木精-伊红染色,每组取耳蜗标本行扫描电镜观察。结果：扫描电镜观察发现,对照组内毛细胞及外毛细胞排列整齐,无倒伏、紊乱及缺失;各放射组内毛细胞出现轻微倒伏及排列紊乱,外毛细胞偶有缺失。苏木精-伊红染色结果示各放射组耳蜗内毛细胞、外毛细胞、血管纹细胞及支持细胞在照射后第3、7天与对照组比较未出现明显病理形态学异常。结论：在一次给予≤16Gy放射剂量照射后早期小鼠耳蜗形态仅有轻微改变。     

Smad4 基因缺陷小鼠耳形态学改变的初步研究

目的研究Smad4基因缺陷小鼠中耳及内耳的病理形态学改变，探讨Smad4基因对中耳及内耳发育的影响。方法利用建立的Smad4基因敲除嵌合体小鼠模型，通过火棉胶包埋HE染色观察Smad4（＋/＋）与Smad4（＋／-）小鼠的情况；通过耳蜗基底膜铺片琥珀酸脱氢酶染色观察Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠的耳蜗内、外毛细胞数量；应用扫描电镜观察Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠的内耳超微结构。结果火棉胶包埋HE染色显示：Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠耳蜗大小、耳蜗转数均未见异常，中耳鼓膜正常，听小骨锤骨、砧骨、镫骨及关节结构正常，骨细胞排列紧密，Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）之间没有差异。Smad4（＋／＋）小鼠耳蜗Corti器结构完整，未圯异常，血管纹厚薄均匀，血管腔腔径大小均匀。内、外毛细胞及内外柱细胞、支持细胞无异常，螺旋神经节细胞未见缺失；Smad4（＋／-）小鼠耳蜗钩端至-回外毛细胞轮廓不清，呈均质化，细胞核消失。Deiter细胞核下沉或消失，相应的螺旋神经节细胞大量缺失。耳蜗基底膜铺片琥珀酸脱氢酶染色显示：Smad4（＋／-）和Smad4（＋／＋）小鼠均有明显的局限于Corti’S器底同的外毛细胞缺失，其中Smad4（＋／-）小鼠外毛细胞的缺失，比Smad4（＋／＋）小鼠更明显（P〈0．01），两个基因型小鼠的内毛细胞均未见缺失。扫描电镜显示：Smad4（＋／＋）小鼠未见明显病理变化，Smad4（＋／-）小鼠耳蜗钩端外毛细胞静纤毛广泛散在性缺失，外毛细胞的表皮板穿孔、自溶，其周边与指状突小皮板断离。两个基因型小鼠耳蜗内毛细胞纤毛均未见明显改变。结论Smad4基因敲除后内耳形态发生明显改变，表明Smad4基因缺陷导致小鼠内耳细胞损害。     

头面部常规^60钴照射及顺铂应用对豚鼠耳蜗的影响

将实验豚鼠分成60钴70Gy照射组，60钴50Gy照射组，顺铂治疗组，60钴50Gy照射加顺钱治疗组，对照组，共5组每组9耳，顺铂腹腔注射2mg/kg/次，共10次，用电瓜在测听仪分别在实验前、60钴照射后或应用顺铂后10周测定ABR阈值，对全耳蜗铺片基底膜上的内、外毛细胞及柱细胞缺损九进行定量观察计数。结果各组实验耳在ABR阈值测定上均无显著性差异。在基底膜内、外毛细胞及柱细胞缺损方面，提示随着放射剂量的增大，耳蜗毛细胞的损伤也随之增加。应用顺铂后可加重放射对耳蜗的损害，但按临床常规应用顺铂的剂量则对耳蜗是安全的。     

DPOAE监测一次性大剂量顺铂致豚鼠耳毒性的实验研究

目的观察一次性大剂量顺铂注射后豚鼠畸变产物耳声发射(DPOAE)和内耳形态学的依时性改变,探讨应用耳声发射监测顺铂耳毒性的最佳时机。方法将豚鼠随机分为对照组(A组)及实验组(B、C、D组),每组6只,A组皮下注射生理盐水,B、C、D各组一次性皮下注射顺铂(10mg/kg),分别于给药前及给药后第3(B组)、5(C组)、10(D组)天检测DPOAE,比较给药前、后DPOAE的幅值的变化,并行耳蜗铺片,观察毛细胞缺失率及耳蜗形态学的改变。结果给药后第3天,DPOAE的幅值仅8kHz处有明显改变(P<0.05);给药后第5、10天DPOAE幅值明显降低(P<0.01)。给药后第3、5、10天,耳蜗外毛细胞缺失率分别为4.34%±3.20%、16.14%±9.15%、18.25%±9.04%。在第5、10天后尚可见血管纹充血以及螺旋神经节细胞肿胀缺失。结论顺铂的耳毒性主要作用于耳蜗底回、中回的外毛细胞,用药后第3~5天应用畸变产物耳声发射检查能早期发现其耳毒性损伤。     

头面部常规~（60）钴照射及顺铂应用对豚鼠耳蜗的影响

将实验豚鼠分成￣（６０）钴７０Ｇｙ照射组，￣（６０）钴５０Ｇｙ照射组，顺铂治疗组，￣（６０）钴５０Ｇｙ照射加顺铂治疗组，对照组，共５组每组９耳。顺铂腹腔注射２ｍｇ／ｋｇ／次，共１０次。用电反应测听仪分别在实验前、￣（６０）钴照射后或应用顺铂后１０周测定ＡＢＲ阈值。对全耳蜗铺片基底膜上的内、外毛细胞及柱细胞缺损数进行定量观察计数。结果各组实验耳在ＡＢＲ阈值测定上均无显著性差异。在基底膜内、外毛细胞及柱细胞缺损方面，提示随着放射剂量的增大，耳蜗毛细胞的损伤也随之增加。应用顺铂后可加重放射对耳蜗的损害，但按临床常规应用顺铂的剂量则对耳蜗是安全的。