低氧对大鼠睾丸支持细胞形态结构与存活率的影响

目的 探讨低氧对体外培养大鼠睾丸支持细胞的影响.方法 应用大鼠睾丸支持细胞与生精细胞共培养系统,观察低氧条件下支持细胞的存活数,考马斯亮蓝染色后细胞骨架变化以及生精细胞脱落数.结果 在低氧条件下,支持细胞存活率显著降低,支持细胞细胞骨架出现松弛、回缩等现象;脱落生精细胞数随低氧时间的延长而增加,有明显时间-效应关系.结论 低氧可引起大鼠睾丸支持细胞形态结构及功能的损伤.     

大鼠睾丸生精细胞共培养系统的建立

目的 建立生精细胞体外分化(如减数分裂、精子变态)培养体系,为研究精子发生中各种调控因素的作用提供一个良好的细胞模型.方法 取20～22日龄的SD雄性大鼠睾丸,放在预冷的Hanks液中洗2次,用1 mg/mL胶原酶32 ℃消化15～20 min.然后将睾丸剪碎,重复用1 mg/mL胶原酶消化5～10 min.细胞用含10%胎牛血清及各种营养因子的HamF12/DMEM培养液悬浮,按约2×106 /cm2密度分别接种于双室培养槽(双室培养)或放有盖玻片的6孔板(单室培养)中,在32 ℃、95%空气、5%CO2条件下培养.每日在相差显微镜下观察共培养支持细胞/生精细胞的生长状态,定期进行苏木精-伊红染色、BrdU染色.结果 在双室培养2周后,部分生精细胞可见鞭毛出现,培养4周后,培养体系中仍有一定数量的生精细胞附着在支持细胞上,部分生精细胞上可见鞭毛.单室培养的生精细胞在培养第4～5天开始出现明显脱落,培养1周后大多数生精细胞发生脱落死亡,生精细胞上未见鞭毛出现,但在培养体系中可见次级精母细胞及精子细胞.结论 应用双室培养,生精细胞可存活达1月之久,而且部分生精细胞尾部出现鞭毛,从形态上发生了减数分裂及精子变态过程.     

小鼠生精细胞的体外双室无血清培养

目的 探讨无血清条件下应用插入式细胞培养皿( Transwell 小室)对小鼠睾丸间质细胞 - 支持细 胞 - 生精细胞的双室培养技术。方法 取 60 日龄 C57BL / 6 雄性小鼠睾丸间质细胞和 15 日龄雄性小鼠睾丸支持细 胞与生精细胞混合细胞团双室共培养,不添加血清。每日在倒置显微镜下观察生精细胞的形态和生长情况,苏木 精染色观察生精细胞形态,染色体倍性分析检测细胞分化情况。结果 在培养 1 周后,可见圆形精子细胞出现, 2 周 后可见长形精子细胞, 3 周后可见较短鞭毛,生精细胞可存活 8 周;培养 1 周时,流式细胞术可检测出单倍体细胞, 单倍体细胞百分比随培养时间延长而增加。结论 应用双室无血清培养体系体外培养小鼠生精细胞可获得精子且 生精细胞存活时间较长。     

愤怒应激对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响

目的:探讨愤怒应激对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响.方法:20只健康雄性SD大鼠,随机分为对照组与愤怒组.愤怒组大鼠采用“夹尾激怒法”刺激大鼠,每次夹尾30 min,间隔3h再刺激1次,每天2次,连续14 d.对照组不予夹尾激怒,余同愤怒组.14 d后,HE染色法、TUNEL法分别检测观察睾丸组织病理学改变,生精细胞凋亡情况.结果:①与对照组相比,愤怒组大鼠睾丸生精小管生精上皮层数减少,各级生精细胞及支持细胞排列松散、不规则,生精细胞与支持细胞核浓缩凝集,生精细胞脱落明显,管腔内精子数量减少;②两组大鼠睾丸存在生精细胞凋亡,与对照组相比,愤怒组大鼠生精细胞凋亡显著增高(P＜0.05).结论:愤怒应激导致大鼠睾丸生精细胞凋亡增加,可导致愤怒应激大鼠睾丸生精细胞数量减少.     

大鼠生精细胞体外培养条件的研究

目的:寻找一个最适合生精细胞体外培养的培养体系,为进一步培养人类生精细胞提供技术基础.方法:用单一酶-研磨-Percoll法制备15 d龄雄性大鼠生精细胞混悬液用于体外培养.①设计两种不同的培养条件:DMEM/F12和改良人类输卵管液(HTF)作为基础培养液,分为两组.每组根据添加不同浓度的激素分为6小组.添加的睾酮(T)和FSH浓度分别为:对照组H0(T 1 μmol/L,FSH 0 IU/L)、H1组(T 1 μmol/L,FSH 10 IU/L)、 H2组(T 1 μmol/L,FSH 25 IU/L)、H3组(T 1 μmol/L,FSH 50 IU/L)、H4组(T 1 μmol/L,FSH 100 IU/L)、H5组(T 0 μmol/L,FSH 50 IU/L). ②通过BRDU标记和流式细胞仪检测所有实验的生精细胞倍体的变化来判断其发育,进一步确认本研究使用培养条件的可靠性.结果:在生精细胞与支持细胞共培养过程中以改良人类输卵管液作为基础培养液,添加T 1 μmol/L ,FSH 50 IU/L或100 IU/L都适宜生精细胞体外培养;另通过BRDU标记及流式细胞仪检测均表明,在本研究条件下体外培养生精细胞能从初级精母细胞阶段分化到精子细胞阶段.结论:改良人类输卵管液作为基础培养液,添加浓度为50 IU/L或100 IU/L的FSH及T 1 μmol/L,最适合生精细胞的体外成熟培养.     

锌对睾丸生精细胞凋亡及其衰老变化的影响

目的：探讨补锌和高锌对衰老和幼年大鼠睾丸发育及其功能影响的分子机制。方法：选用Wistar雄性大鼠40只,分为5组,分别为对照组和高锌组（2月龄）、成年组（6月龄）、老年组和补锌组（24月龄）。对照组、成年组和老年组均给以正常锌饲料,含硫酸锌45mg／kg;高锌组给以1000mg／kg硫酸锌;老年补锌组给以100mg／kg硫酸锌。喂养4周后,采用原位缺口平移法检测生精细胞凋亡数目。结果：与对照组相比,衰老大鼠生精细胞凋亡数目明显增多（P＜0．05）;补锌4周后,衰老大鼠的上述变化明显改善;高锌大鼠生精细胞凋亡数目明显增加（P＜0．01）。结论：锌是睾丸发育必须的营养素,适量补锌可改善衰老睾丸生精细胞凋亡的衰老变化,过量补锌可诱发正常睾丸生精细胞凋亡．这种变化可能是不同锌状态对睾丸发育及其衰老变化影响的重要原因之一。     

Sertoli细胞的培养及其对生精细胞支持作用的研究

本文培养幼龄大鼠Sertoli细胞,培养1周细胞纯度达95％以上,3周细胞仍保持止常形态。生精细胞和Sertoli细胞混合培养及Sertoli细胞条件培养液培养生精细胞,结果表明Sertoli细胞可通过和生精细胞在接接触及分泌调节物质对生精细胞的体外存活、增殖、分化等起着支持作用。     

通精灵对实验性精索静脉曲张大鼠生精细胞凋亡的影响

目的探讨通精灵对精索静脉曲张大鼠睾丸生精功能的保护作用。方法将50只成年清洁级雄性Wistar大鼠分为假手术组(10只)、模型组(10只)、通精灵低剂量组(10只)、通精灵中剂量组(10只)和通精灵高剂量组(10只),按Sapyol法制作左精索静脉曲张大鼠模型。造模1个月后,不同浓度通精灵水煎剂灌胃,每日1次,连续60d。采用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法检测睾丸生精细胞凋亡,比较各组左睾丸凋亡指数(AI)。结果模型组左睾丸AI明显高于假手术组及通精灵各组(<0.01),通精灵各组左睾丸AI低于模型组(<0.05)。结论通精灵能降低实验性精索静脉曲张大鼠睾丸生精细胞凋亡,对睾丸生精功能有保护作用。     

睾丸生精细胞完全体外成熟培养的研究

目的在动物实验研究的基础上对人类睾丸生精细胞在体外培养分化、成熟进行初步探索,为临床治疗无精子症奠定基础.方法将14例患者的睾丸组织分离成生精细胞混悬液,采用生精细胞与支持细胞共培养或分选出初级精母细胞和精子细胞培养,观察培养前后各级生精细胞的分化或成熟情况.结果14例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化和成熟.初级精母细胞能分化为精子细胞,分化率平均为4.54%～6.51%;Sa期精子细胞能变形、成熟为Sc期精子细胞,成熟率为3.13%～5.74%.结论人类生精细胞经体外培养能进一步分化、成熟.初级精母细胞能分化为早期精子细胞,Sa期精子细胞可变形为更成熟形式的Sc期精子细胞.甚至可以通过使用被拉长的精细胞或圆形细胞进行显微受精,以达到妊娠的目的.     

人类睾丸生精细胞体外培养的初步研究

目的对人类生精细胞体外培养分化、成熟进行初步研究。方法将4例患者的睾丸组织制备成生精细胞，观察生精细胞体外培养后生精细胞的分化、成熟情况。结果4例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化、成熟。初级精母细胞能分化为精子细胞，分化率平均为0．47％～1．50％；Sa期精子细胞能变形、成熟为Sc期精子细胞，成熟率为0．93％～5．72％。结论在该研究条件下，人类睾丸生精细胞体外培养能进一步分化、成熟。     

血必净对大鼠睾丸扭转/复位缺血再灌注损伤的修复作用

[目的]探讨血必净注射液对大鼠睾丸扭转/复位缺血再灌注(I/R)损伤的修复作用.[方法]将40只雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,血必净低、高剂量组和地塞米松组,每组8只.除假手术组外,其他各组大鼠构建睾丸扭转/复位模型.术后,血必净低、高剂量组和地塞米松组大鼠分别对应腹腔注射0.5、2.0 mL·kg-1·d-1...     

解脲脲原体感染对大鼠睾丸组织结构及分泌功能的影响

目的 探讨解脲脲原体（ureaplasmaurealitycum,UU）感染对大鼠睾丸组织结构及分泌功能的影响。方法 40只清洁级SD大鼠随机分为4组,每组 10只,实验组 A、B（7 d组、14 d组）,对照组 C、D（7 d组、14 d组）。实验组膀胱注射0. 6 mL UU4型菌株〔107 颜色改变单位（CCU）/mL〕,对照组膀胱注射等体积的UU液体培养基。分别于注射后7 d、14 d取各组大鼠睾丸组织于光镜和透射电镜观察镜下结构;化学发光法检测血浆睾酮和睾丸间质液睾酮含量。结果 光镜观察实验组（A、B）为炎症性病变,如生精细胞数量和层次减少,炎性细胞浸润,成熟精子数量稀少等,且B组损伤性病变较A组轻,C、D对照组无明显炎症病变。透射电镜观察实验组（A、B）为生精细胞凋亡表现,如生精细胞核膜皱缩、核染色质浓缩、核破裂等,且B组凋亡情况较A组轻,C、D对照组睾丸生精细胞形态结构较为完整。血浆睾酮水平检测实验组（A、B）均低于C、D对照组（P<0.01）,但A、B组间差异无统计学意义。睾丸间质液睾酮水平检测实验A组低于其余3组（P<0.01）,而其余3组间差异无统计学意义。结论 UU感染大鼠睾丸组织可出现多种病理损伤进而引起分泌功能改变,进一步证实UU感染与男性不育的关系,但上述改变均可自行恢复。     

氨基胍对隐睾所致生精细胞凋亡中p53表达的影响

目的:通过研究氨基胍对隐睾生精细胞中p53表达的影响,探讨生精细胞凋亡的分子机制。方法:雄性SD大鼠随机分为假手术组、隐睾组、隐睾+氨基胍(Aminoguanidine,AG,iNOS抑制剂)组、隐睾+生理盐水组。后三组建立单侧隐睾模型,后两组术后分别于腹腔内注射AG和生理盐水,每天一次,定时定量。7天后处死所有大鼠,取双侧睾丸称湿重。手术侧睾丸H.E染色观察常规组织学及免疫组化检测p53的表达。结果:隐睾+AG组睾丸生精上皮较隐睾组及隐睾+生理盐水组排列有序,细胞层数厚,该组中p53表达弱于隐睾组。结论:AG可降低隐睾中p53的表达,抑制隐睾生精细胞的凋亡,提示NO可能通过增强隐睾生精细胞中p53的表达而促进生精细胞凋亡。     

高功率微波辐照对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响

目的 :探讨高功率微波 (HPM )辐照对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响。　方法 :健康成年SD雄性大鼠 5 0只 ,随机分为照射组和对照组。以S波段平均功率密度为 2 0mW /cm2 的HPM辐照大鼠 5min ,照后 6、2 4、4 8、72h和 5天取睾丸组织 ,应用原位末端标记技术 (TUNEL)检测各组凋亡细胞。　结果 :辐照后 6、2 4、4 8h ,大鼠睾丸生殖细胞凋亡数量明显高于对照组 (P <0 .0 1) ,呈线性上升和下降趋势 ,2 4h凋亡细胞数量最多 ,达(2 5 .4 0± 3.30 )个 /5个曲细精管。 72h和 5天与对照组间无差别 (P >0 .0 5 )。　结论 :HPM辐照大鼠 5min即可触发生精细胞的细胞凋亡数目增加 ,影响大鼠生殖功能。     

人骨髓间充质干细胞向Leydig细胞或产类固醇激素细胞体外诱导分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向睾丸Leydig细胞分化,并确定诱导条件。方法将分离培养所获得的第3代MSCs细胞经含黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血小板衍化生长因子(PDGF)及白介素-1α(IL-1α)的诱导液诱导,按诱导液中各因子浓度不同分为A、B、C组和对照组,分别于7d、14d、21d时观察细胞形态变化,并行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫细胞化学染色和免疫荧光染色,检测各组细胞3β-HSD的表达。以人睾酮ELISA试剂盒检测诱导细胞分泌类固醇的功能情况。结果诱导10～14d后,细胞具有Leydig细胞的形态特点;免疫细胞化学染色及免疫荧光染色显示,本研究条件下,随着诱导液中各因子浓度加大及诱导时间延长,诱导细胞3β-HSD表达阳性数和阳性率逐渐增多,以A组浓度及21d为最佳诱导浓度及时间(P<0.05),并且A组诱导21d分泌睾酮量最高(P<0.05)。结论人骨髓MSCs经体外诱导后可以分化为Leydig细胞或产类固醇细胞。     

精原干细胞在支持细胞饲养层上的长期培养

目的建立体外研究精原干细胞与支持细胞共培养的细胞模型,研究体外精原干细胞在支持细胞层上的增殖特点。方法应用两步酶消化法,分别从14～15d及6d龄雄性昆明小鼠睾丸中分离支持细胞及精原干细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定。将精原干细胞接种在支持细胞层上,观察不同时间点精原干细胞集落形态及数目。结果在支持细胞层上培养24h后,精原干细胞开始增殖分裂,呈双细胞形态;随着培养时间延长,双细胞集落数逐渐减少,而链状细胞集落逐渐增加;培养120h后,链状细胞局部融汇堆积,且细胞集落维持在相对稳定数量。在每4～5d更换培养液的条件下,细胞集落维持稳定状态的平均时间为(51,2±5.8)d。结论精原干细胞在体外支持细胞层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可用于体外研究生精细胞增殖分化特征、药物或毒物干扰精原干细胞功能实验。     

培养原始生殖细胞的新方法——Sertoli细胞的应用

为探讨睾丸支持细胞 (sertolicell,SCs)对原始生殖细胞 ( primordialgermcell,PGCs)的增生与生长是否有明显的促进作用。用SCs和同源生殖嵴成纤维细胞分别与PGCs共培养。结果发现 :与SCs共培养的PGCs集落多于与同源生殖嵴成纤维细胞共培养的PGCs集落 ,传代次数也多于同源生殖嵴成纤维细胞。提示 :SCs能提高原始生殖细胞在体外的增生能力     

新生期脂多糖暴露对大鼠睾丸发育及波形蛋白表达的影响

目的探讨新生期脂多糖暴露对睾丸发育及波形蛋白表达和分布的影响。方法选取新生雄性SD大鼠150只,随机分为对照组和实验组,实验组于生后第4～12d期间,隔日皮下注射脂多糖（75μg/kg）,共5次,对照组在相同时间皮下注射等容生理盐水。常规饲养至生后14d、21d、28d、包皮分离日、60d、77d分批取材,采用组织学和免疫组化技术,观察脂多糖对大鼠睾丸发育、波形蛋白的表达与分布的影响。结果①与同龄对照组相比,实验组大鼠生精小管横径变小,生精上皮变薄,细胞排列紊乱,生精细胞与支持细胞分离,脱落至管腔,性成熟以后,管腔内精子生成减少;②对照组波形蛋白阳性染色从基膜围绕支持细胞核形成棕黄色的环,并呈辐射状延伸至管腔;实验组支持细胞变矮、变圆,波形蛋白仅见于核周或核的基部胞质,伸向管腔的辐射状条带变短或消失。结论新生期脂多糖暴露,可改变支持细胞波形蛋白的有序分布,造成生精细胞脱落,干扰生精细胞的发育成熟,这种影响可延续至成年期,导致成年期精子生成减少。     

特发性少精子症生精细胞增殖与凋亡变化的研究

目的 探讨特发性少精子症患者睾丸生殖细胞增殖与凋亡的病理生理机制。方法 选择特发性少精子症患者79例,行睾丸穿刺活检,所取睾丸组织采用免疫组织化学技术观察生精细胞增殖细胞核抗原的表达,采用原位3'羟基末端标记法观察生殖细胞的凋亡变化。同时以5 例暴死男性的睾丸作为正常对照组,经病理证实组织结构无异常。结果 与正常睾丸生精细胞相比,特发性少精子症患者增殖细胞核抗原增殖指数明显降低, P<0.001;而凋亡指数明显升高,P<0.01。结论 特发性少精子症患者精子减少的主要原因之一是由于生精细胞增殖能力减少及凋亡增加造成增殖与凋亡的平衡失调所致。     

JX-1对雄性小鼠生殖细胞致突变作用的研究

本文采用小鼠精子试验和小鼠睾丸DNA合成抑制试验,检测了JX-1对雄性生殖细胞的致突变作用。实验结果表明JX-1对小鼠精子总数、精子活动率及精子畸形率均无统计学意义的增加,与小鼠睾丸DNA合成抑制试验阴性反应一致。作者认为JX-1对雄性生殖细胞为一种非诱变剂。