siRNA干扰人胰腺癌T3细胞系KAI1基因的表达

目的 应用小分子干扰RNA(small interference RNA,siRNA)干扰KAI1基因在人胰腺癌T3细胞系的表达,为基因治疗胰腺癌打下基础.方法 针对KAI1基因CD82片段序列设计A、B、C、D 4个siRNA靶序列,构建针对KAI1基因(CD82)含siRNA片段的慢病毒载体.以脂质体2000转染T3细胞,测定病毒滴度.以空载体、含不同靶序列siRNAd1载体的病毒感染T3细胞(MOI=5),采用实时PCR方法检测CD82mRNA的表达.结果 正常对照组、空载体对照组、A靶序列组、B靶序列组、C靶序列组和D靶序列组CD82 mRNA表达量分别为1.398 ±0.242、1.311 ±0.048、0.664±0.093、0.345 ±0.032、0.641 ±0.049和0.147±0.049,各靶序列组的表达量明显低于空载体对照组(P＜0.01).结论 应用RNAi可有效抑制T3细胞KAI1基因CD82片段的表达.     

单核细胞CX3C趋化因子受体1表达与冠状动脉狭窄性疾病的关系

目的探讨单核细胞CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)表达与冠状动脉狭窄性疾病的关系。方法选择冠状动脉血管狭窄≥50%患者70例、冠状动脉血管狭窄50%患者23例与无冠状动脉病变的非冠状动脉粥样硬化性心脏病志愿者24例分别为狭窄组、不明显病变组与对照组。用流式细胞术测定单核细胞CX3CR1荧光表达强度,比较3组单核细胞CX3CR1表达水平,进行Spearman相关分析,多因素logistic回归分析,ROC曲线分析相关危险因素。结果狭窄组、不明显病变组、对照组CX3CR1荧光强度分别为4.94%(2.41%,6.58%)、2.02%(1.25%,3.57%)、1.68%(1.09%,2.24%),3组比较有统计学差异(Hc=31.025,P0.01)。与对照组比较,狭窄组CX3CR1荧光强度明显升高,有统计学差异(Z=4.934,P0.01)。TG和CX3CR1是冠状动脉狭窄性疾病发病的危险因素(P=0.048,P=0.026)。CX3CR1荧光强度在临界值为2.91%时,敏感性为64.1%,特异性为91.7%,曲线下面积为0.810,CX3CR1对冠状动脉狭窄病变有一定的诊断效力(95%CI:0.728~0.891,P0.01)。结论单核细胞CX3CR1高表达是冠状动脉狭窄性疾病发病的危险因素,对冠状动脉狭窄性疾病诊断有一定的效力。     

沉默SIRT1基因表达对胰腺癌细胞PANC1增殖和凋亡的影响

目的 应用RNA干扰技术沉默胰腺癌PANC1细胞的SIRT1基因表达,观察其对细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建靶向SIRT1基因表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒pGC-shRNA,转染胰腺癌细胞PANC1.设对照shRNA(shRNA-C)转染组和未转染对照组.实时定量PCR和免疫细胞化学法检测转染后细胞SIRT1 mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞的增殖率;ELASA法检测细胞caspase-3和caspase-9活性;Western bloting检测细胞Bax、Bcl-2蛋白表达.结果 与未转染组相比,shRNA组转染后48 h,PANC1细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为(76.2%±10.4)%和(80.1±11.6)%;细胞增殖抑制率为(45.1±6.5)%;caspase-3和caspase-9酶活性显著增高;Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调.结论 应用RNA干扰技术能有效沉默PANC1细胞SIRT1基因的表达,其机制可能与caspasa酶活性升高及Bax表达上调、Bcl-2表达下调有关.     

沉默畸胎瘤衍生生长因子-1基因对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响

目的 探讨TDGF-1基因沉默对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响.方法 设计并合成3个(S1、S2、S3)靶向TDGF-1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),筛选出沉默效果最好的siRNA.以该siRNA的不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)转染PANC1细胞,并设对照组和脂质体组.采用实时定量PCR和Western blotting检测TDGF-1 mRNA和蛋白表达,以软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力,并将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察癌细胞的体内侵袭.结果 siRNA转染组细胞的TDGF-1 mRNA和蛋白表达水平呈浓度和时间依赖性下降,且较脂质体组明显降低(P值均＜0.01).对照组细胞集落形成数和穿膜细胞数分别为19.8±2.2和49.8±2.6;siRNA组呈浓度依赖性明显减少,12.5 nmol/L转染组分别为5.6±1.2和8.1±1.1.对照组、脂质体组和12.5 nmol/L转染组接种4周后裸鼠种植瘤体积分别为(2.228±0.026)cm3、(2.186±0.028)cm3和(0.728±0.023)cm3.对照组和脂质体组种植瘤侵犯周围肌层组织,转染细胞组未见侵犯.结论 采用RNA干扰技术沉默PANC 1细胞的TDGF-1基因表达可抑制癌细胞的侵袭力.     

靶向性沉默DNMT1基因对胰腺癌细胞DNA甲基化的影响

目的 观察DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因沉默后对人胰腺癌PaTu8988细胞的DNMT活性及hMLH-1基因CpG岛DNA甲基化状态的影响.方法 由美国Ambion公司设计合成DNMT1siRNA和阴性对照siRNA,分别用15、30 nmol/L的浓度转染胰腺癌PaTu8988细胞,以未转染组细胞作为对照.应用实时PCR和蛋白质印迹法检测DNMT1 mRNA和蛋白的表达;用DNMT活性检测试剂盒检测其活性;用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)法检测hMLH-1基因CpG岛的甲基化状态;实时PCR法检测hMLH-1 mRNA的表达.结果 转染48 h后,DNMT1 siRNA15、30 nmol/L组细胞DNMT1 mRNA表达量分别为0.573±0.026和0.143±0.044,显著低于对照组的1.020±0.217及阴性siRNA 15、30 nmol/L组的0.900±0.475和0.938±0.327(P值均＜0.05);DNMT1 siRNA组的DNMT1蛋白表达亦低于对照组和阴性siRNA组.DNMT1 siRNA15、30 nmol/L组细胞DNMT活性分别为0.364±0.124和0.250±0.072,明显低于对照组的0.931±0.065及阴性siRNA 15、30 nmol/L组的0.665±0.055和0.472±0.040.DNMT活性与DNMT1 mRNA表达呈正相关(r=0.69,P＜0.01).DNMT1 RNA干扰后导致hMLH-1基因CpG位点的8个甲基化减少到1个甲基化.结论 DNMT1 siRNA能特异性抑制胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1基因的表达,明显抑制DNMT的活性,并引起hMLH-1基因CpG岛去甲基化.     

RNA干扰DNA甲基转移酶1对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察以DNA甲基转移酶1(DNA methy transferas 1,DNMT1)基因为靶基因的RNA干扰对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计、合成针对DNMT1基因的siRNA和阴性对照siRNA(N-siRNA).实验分为空白对照组、脂质体组(仅予脂质体)、N-siRNA组(转染30 nmol N-siRNA)、siRNA组(转染30 nmol siRNA).siRNA转染48 h后,实时PCR法检测DNMT1 mRNA水平;WST-8法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡.结果 siRNA组DNMT1 mRNA的抑制率为(86.0±4.3)%,明显高于N-siRNA组的(40.1±2.2)%和空白对照组的0(P＜0.01);细胞存活率为(47.6±5.6)%,明显低于N-siRNA组的(68.1±4.1)%和空白对照组的100%(P＜0.01);细胞凋亡率为(14.94±2.89)%,明显高于空白对照组的(7.51±1.12)%、脂质体组的(7.06±0.39)%、N-siRNA组的(8.84±1.44)%(均P＜0.01).结论 siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1mRNA的表达,同时抑制细胞增殖、促进细胞凋亡.     

hPOT1 RNA干扰对人胃癌细胞株BGC-823端粒长度和hTERT表达的影响

人端粒保护蛋白1（hPOT1）的主要作用为保护端粒和调节端粒长度。目的：探讨hPOT1在人胃癌细胞中对端粒长度的调节作用及其可能机制。方法：以RNA干扰（RNAi）技术抑制人胃癌细胞株BGC-823中hPOT1的表达．以实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测细胞端粒长度，以半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA表达。结果：以RNAi技术抑制hPOT1表达后，BGC-823细胞端粒长度明显缩短，反映端粒相对长度的T／S值显著小于亲本BGC-823细胞组和阴性对照组（1．383±0．091对2．758±0．647和3．043±0．548，P〈0．05），亲本细胞组与阴性对照组之间则无明显差异。hPOT1RNAi组细胞hTERTmRNA表达亦明显下调。结论：在人胃癌细胞中，hPOT1能正性调节端粒长度；在hPOT1下调引起端粒缩短的环节中，hTERT表达下降可能起一定作用。     

趋化因子配体16对人胰腺癌细胞株PANC1生物学行为的影响

目的 探讨趋化因子配体16(CXCL16)对人胰腺癌细胞PANC1生物学行为的影响.方法 取对数生长期的人胰腺癌细胞PANC1,分别加人50、100、200 ng/ml的重组人CXCL16(rhCXCL16)和抗CXCL16 抗体处理4 h,以不加rhCLCL16作为对照.采用MTT法检测细胞增殖,采用Mqrtigel基质检测细胞的黏附率,采用Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力.结果 100 ng/ml rhCXCL16处理PANC1细胞后,细胞增殖、对基质的黏附率、侵袭和迁移能力分别为0.264±0.021、(91.4±8.6)%、1.246±0.216、1.361±0.276,其中细胞对基质的黏附率、侵袭和迁移能力均显著高于对照组的(20.6±3.2)%、0.259±0.013、0.199±0.1308(P<0.01),对细胞的增殖不影响;200ng/ml rhCXCL16处理后,细胞对基质的黏附率、侵袭和迁移能力进一步提高到(92.1±6.3)%、1.511±0.174、1.600±0.20s(P<0.05).结论 CXCL16可诱导人胰腺癌细胞PANC1增强对基质的黏附性、侵袭性和迁移性.     

趋化因子配体16对人胰腺癌细胞株PANC1生物学行为的影响

目的探讨趋化因子配体16（CXCL16）对人胰腺癌细胞PANC1生物学行为的影响。方法取对数生长期的人胰腺癌细胞PANC1,分别加入50、1013、200ng／ml的重组人CXCL16（rhCXCL16）和抗CXCL16抗体处理4h,以不加rhCLCL16作为对照。采用MTT法检测细胞增殖,采用Mqrtigel基质检测细胞的黏附率,采用Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力。结果100ng／ml rhCXCL16处理PANC1细胞后,细胞增殖、对基质的黏附率、侵袭和迁移能力分别为0．264±0．021、（91．4±8．6）％、1．246±0．216、1．361±0．276,其中细胞对基质的黏附率、侵袭和迁移能力均显著高于对照组的（20．6±3．2）％、0．259±0．013、0．199±0．008（P〈0．01）,对细胞的增殖不影响;2130ng/ml rhCXCL16处理后,细胞对基质的黏附率、侵袭和迁移能力进一步提高到（92．1±6．3）％、1．511±0．174、1．600±0．208（P〈0．05）。结论CXCL16可诱导人胰腺癌细胞PANC1增强对基质的黏附性、侵袭性和迁移性。     

干扰Sema4D基因表达对胰腺癌细胞生物学特征的影响

目的探讨干扰Sema4D基因的表达对胰腺癌细胞生物学的影响。方法设计合成Sema4D-siRNA,转染到人胰腺癌细胞系中,将实验分为3组,转染siRNA组、阴性对照组(即转染非特异性对照组)﹑空白对照组(未经任何处理的胰腺癌细胞)。转染48 h后利用RT-q PCR检测转染前后Sema4D mRNA表达的变化,转染72 h后利用Western-Blot的方法检测转染前后Sema4D蛋白表达的变化;采用四甲基偶氮唑蓝显色法观察转染后细胞生长变化;Transwell小室侵袭试验检测转染后肿瘤细胞侵袭性的改变;采用流式细胞技术检测肿瘤细胞凋亡的变化。计量资料多组间比较采用单因素方差分析比较,进一步两两比较采用LSD-t检验法。结果转染Sema4D-siRNA 48 h后,转染siRNA组Sema4D mRNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组,3组比较差异有统计学意义(F=421.990,P<0.001)。转染Sema4D-siRNA 72 h后,转染siRNA组Sema4D蛋白明显低于阴性对照组和空白对照组,3组间比较差异有统计学意义(F=27.074,P=0.002 3)。转染siRNA组48、72、96 h的细胞生长速度明显低于阴性对照组和空白对照组,3组间比较差异均有统计学意义(F值分别为15.314、62.255、223.493,P值分别为0.004、<0.001、<0.001)。转染siRNA组穿膜细胞个数明显低于阴性对照组和空白对照组,3组间比较差异有统计学意义(42.0±5.9 vs 60.0±6.1 vs 61.0±4.6,F=37.21,P=0.000 4]。转染siRNA组穿膜细胞凋亡率明显低于阴性对照组和空白对照组,3组间比较差异有统计学意义[(16.57±0.31)%vs(9.50±0.45)%vs(9.90±0.61)%,F=26.75,P=0.007 4]。结论 siRNA能够下调Sema4D基因在胰腺细胞中的表达,可以抑制胰腺癌细胞增殖,使胰腺癌细胞侵袭能力明显下降,凋亡率下降。     

VEGF基因沉默对胰腺癌细胞化疗敏感性和Akt信号通路的影响

目的 观察靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对胰腺癌BxPC3细胞化疗药物敏感性的影响,并探讨其可能机制.方法 将培养后的BxPC3细胞分为单纯BxPC3细胞组、脂质体处理组、错配siRNA转染组和VEGFsiRNA转染组.以5、10、20、100、200 nmol/L的VEGF siRNA转染BxPC3细胞.采用实时定量RT-PCR和ELASA法检测细胞VEGF mRNA和蛋白的表达;MTT法检测吉西他滨对各组细胞生长的影响;蛋白质印迹法检测BxPC3细胞Akt蛋白的磷酸化.结果 VEGF siRNA转染后,BxPC3细胞VEGF mRNA和蛋白呈浓度和时间依赖性明显下调,但对BxPC3细胞的增殖无明显影响.用0.2 μmol/L吉西他滨处理细胞48 h后,BxPC3细胞组、错配siRNA组及5、10、20 nmol/L siRNA组细胞的生长抑制率分别为(16.9±0.3)%、(17.3±0.3)%、(28.8±0.4)%、(52.2±0.3)%、(75.4±0.4)%,抑制率与siRNA浓度相关(r=0.928).同时,siRNA转染后细胞Akt蛋白的磷酸化被明显抑制.结论 VEGF基因在胰腺癌BxPC3细胞耐药中起着重要的作用,其机制可能与Akt蛋白磷酸化有关.     

乏氧条件下PTEN、KAI1基因双转染对胰腺癌AsPC1细胞增殖、转移的影响

目的 观察乏氧环境下PTEN和KAI1基因双转染人胰腺癌AsPC1细胞后对其增殖、迁移的影响.方法 应用我们前期构建的PTEN和KAI1基因过表达载体同时转染乏氧环境培养的人胰腺癌AsPC1细胞,采用蛋白质印迹法检测PTEN和KAI1蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖,克隆形成实验观察肿瘤细胞形成集落能力,Transwell小室实验观察细胞的迁移能力.结果 双基因转染后,乏氧培养的AsPC1细胞的PTEN、KAI1蛋白表达量较空载体转染组细胞增加2.05倍及1.51倍;细胞增殖显著减缓(0.5比0.8,P=0.000);克隆形成数显著下降[(41.67±5.03)个比(86.00±7.81)个,P=0.017)];细胞迁移能力明显减弱(0.68±0.05比1.23±0.03,P=0.003).结论 乏氧条件下PTEN、KAI1基因双转染AsPC1细胞后能够抑制其增殖、迁移能力,基因联合治疗胰腺癌可能具有潜在的应用价值.     

核糖核酸干扰下调骨桥蛋白表达对胃癌细胞生物学行为的影响

目的探讨骨桥蛋白（OPN）下调对胃癌细胞株MKN28和SGC7901生物学行为的影响。方法参考相关文献，设计并合成OPN的小干扰RNA（siRNA），通过荧光标记测定2株细胞的转染效率。Western印迹法检测OPN蛋白下调情况。实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测siRNA对OPNmRNA的下调率及随时间的变化。流式细胞仪检测转染前、后细胞周期和凋亡变化。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法连续7d检测OPN干扰时肿瘤细胞增殖的变化，并采用混合模型进行统计分析。Transwell实验检测转染前、后细胞的运动侵袭能力并行t检验进行分析。结果2株细胞中OPN siRNA的转染效率均在90％以上。干扰后2株细胞中OPN蛋白表达均下调。SGC7901细胞在siRNA转染后72hOPN mRNA表达下降最低，达47％；MKN28细胞在siRNA转染后48hOPN mRNA表达下降最低，达40％。OPN被干扰后，SGC7901和MKN28细胞的增殖能力明显减弱（混合模型分析与未干扰组比较，P〈0．01）。OPN被干扰后MKN28和SGC7901细胞周期受到影响，其中SGC7901分裂期细胞比例由18．78％降至17．02％，MKN28分裂期细胞比例则由4．96％降至0．39％。2株细胞都未发现下调OPN后诱发细胞凋亡。OPN下调后2株肿瘤细胞的运动侵袭能力均下降，穿过人工基底膜的细胞数明显减少（SGC7901：t=5．172，P〈0．01；MKN28：t=11．365，P〈0．01）。结论siRNA能下调MKN28和SGC7901中OPN表达，OPN可能与MKN28和SGC7901细胞的增殖和运动侵袭相关。     

MMI-166对人胰腺癌细胞株SW1990体外增殖及凋亡的影响

目的 探讨基质金属蛋白酶抑制剂MMI-166对人胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响.方法 应用不同浓度(25、50、100μg/ml)的MMI-166处理人胰腺癌SW1990细胞24、48 h.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率;采用Annexin V-PI法检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 25、50、100μg/ml MMI-166处理细胞24h后,细胞生长抑制率分别为(34.23±3.87)％、(44.81±2.01)％、(53.91±1.74)％;48 h的抑制率为(39.95±1.83)％、(52.26±3.46)％、(63.20±2.48)％,呈浓度及时间依赖性.24h的细胞凋亡率分别为(4.17±0.55)％、(8.22±0.70)％、( 14.10±0.44)％;48 h的细胞凋亡率为(11.19±0.47)％、(23.01±0.53)％、(28.10±0.52)％,均显著高于对照组的(0.09±0.12)％(P＜0.05).结论 MMI-166以浓度和时间依赖性抑制胰腺癌SW1990细胞增殖,诱导细胞凋亡.     

Transgelin在伴随糖尿病的胰腺癌中的表达及其对SW1990细胞运动侵袭的影响

目的 探讨骨架相关蛋白Transgelin在伴或不伴糖尿病的胰腺癌组织中的表达,及其对胰腺癌SW1990细胞运动侵袭的影响。方法 采用免疫组织化学法检测Transgelin在92例胰腺癌患者（其中伴糖尿病者45例）的癌组织、癌旁组织（距癌边缘＞5 cm）中的表达水平,分析其与临床病理特征的关系;设计并体外合成靶向Transgelin的小干扰RNA(siRNA),将其转染到SW1990细胞中,采用Transwell小室检测转染前后细胞运动侵袭能力的改变。结果 Transgelin在胰腺癌 组织中的表达阳性率为68.5％(63/92),显著高于癌旁组织[33.7％(31/92),P＜o.05]。伴随糖尿病的胰腺癌组织中Transgelin表达阳性率为84.4％(38/45),显著高于无糖尿病的胰腺癌组[53.2％(25/47),P＜0.05]。胰腺癌组织中Transgelin表达与胰腺癌的淋巴结转移及TNM分期密切相关(P＜0.05),与性别、年龄、发生部位、分化程度、门静脉或神经受侵犯无关(P＞0.05)。Transgelin siRNA干扰后48 h,SW1990细胞迁移能力[穿膜细胞数为(49.2±9.5)个]明显低于阴性对照组和空白组[(61.9±7.5)和(65.3±10.6)个,P值均＜0.05];SW1990细胞的体外侵袭能力[穿膜细胞数为(48.0±8.6)个]也明显低于阴性对照组和空白组[（63.5±11.4）个和(67.5±9.6)个,P值均＜0.05]。结论 Transgelin可能通过促进胰腺癌细胞的运动侵袭能力,参与伴随糖尿病的胰腺癌的转移发生。