LMP1与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒的制备

目的: 制备EB病毒LMP1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒. 方法: 采用RT- PCR方法获得LMP1全外显子片段,使之克隆到带绿色荧光蛋白慢病毒表达载体质粒FUGW中. 经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体. 在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-LMP1导入病毒包装细胞293FT, 荧光显微镜检测基因的表达,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩,PCR鉴定. 结果: 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合; LMP1准确克隆入FUGW的多克隆位点. 慢病毒的3种质粒可高效转染入293FT细胞,荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光. 绿色荧光位于细胞的胞膜及胞质. 结论: 成功制备了LMP1与GFP融合基因慢病毒,为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

人THAP11慢病毒载体的构建及表达研究

目的 构建人死亡相关蛋白11(THAP11)基因的慢病毒载体,并建立其慢病毒表达系统.方法 PCR方法获得人THAP11基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pBPLV-THAP11-myc,并通过转染HEK293细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及Western blot检测其表达.在脂质体介导下将重组质粒与包装质粒pLP1和pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞包装产生慢病毒.结果 构建的质粒经PCR,酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293FT细胞获取的5.5×106TU/ml慢病毒滴度.结论 成功构建了人THAP11基因慢病毒载体质粒THAP11-myc-pBPLV,并建立了其慢病毒表达系统,为后续的应用研究奠定了基础.     

大鼠Smad7基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建大鼠Smad7慢病毒载体。方法:提取大鼠大脑皮质及肾脏的总RNA,逆转录PCR扩增获得Smad7目的基因片段,EcoRI及BamHI酶切连接慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,构建融合copGFP共表达的Smad7重组质粒。转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR扩增及测序鉴定正确后,Smad7重组质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293TN,包装产生病毒液,转染H1299细胞株测定病毒滴度。结果:通过扩增获得1.3kb Smad7 cDNA片段,测序结果证实目的基因与Genebank序列完全一致,Smad7重组质粒慢病毒包装后获得Smad7慢病毒载体,病毒滴度为1.0×107ifu/ml。结论:成功构建大鼠Smad7慢病毒载体,为进一步研究Smad7基因的相关功能提供了适合的转染载体。     

含绿色荧光蛋白的慢病毒载体的构建及表达

目的　构建以泛醌启动子 (PUB)驱动绿色荧光蛋白 (GFP)表达的慢病毒载体三质粒表达系统 ,并建立其包装细胞系获得GFP的表达。方法　载体的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法。三质粒系统中 ,转移质粒含PUB启动子及标志基因GFP ,包装质粒为ΔNRF ,内含CMV启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点 ,包膜蛋白质粒编码水疱性口炎病毒G糖蛋白 (VSV -G)。载体构建成功后 ,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞——— 2 93T ,12h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。转染后 72h收集病毒上清 ,采用 6孔板培养感染细胞 ,荧光显微镜计数GFP阳性细胞法测定病毒滴度。结果　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的质粒pXZ5。转染 2 93T细胞后 12h在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光 ,证实了GFP的表达 ,成功构建了慢病毒载体的三质粒系统 ,建立了慢病毒载体的包装细胞系。 72h后 ,GFP的荧光强度较 12h增强 ,每一视野下 ,GFP表达阳性的细胞比例达 5 0 %左右。病毒浓度的测定在未进行超速离心浓缩的情况下达 2× 10 8U L。结论　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的的慢病毒载体三质粒表达系统 ,转染2 93T细胞后获得了GFP的表达 ,完成了慢病毒载体包装细胞系的建立     

Dnd1慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的:构建小鼠Dnd1慢病毒表达载体,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达。方法:设计引物引入AgeⅠ酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-Dnd1中扩增小鼠Dnd1基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化。用In-Fusion技术将AgeⅠ内切酶消化后目的片段交换连接入AgeI酶切的pGC-FU载体,构建Dnd1慢病毒表达载体pGC-FU-Dnd1。酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-FU-Dnd1与慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,Western-blot验证Dnd1在转染293T细胞中表达。结果:通过PCR扩增获得了Dnd1基因,将Dnd1克隆到慢病毒转移质粒pGC-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论:成功构建了Dnd1慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨Dnd1功能奠定了基础。     

ED-L2-LMPl-EGFP融合基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鏊定EB病毒LMPl基因和增强型绿色荧光蛋白基因融合慢病毒表达载体.方法 应用DNA重组技术,将EB病毒ED-L2启动子和LMP1基因克隆到带有EGFP基因的FUGW慢病毒表达载体上,筛选阳性克隆,经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组载体后,以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV△8.9、包膜基因VSVG和带目的 基因ED-L2-LMP1-EGFP载体共同转染到293FT包装细胞内包装病毒,荧光显微镜下观察包装细胞报告基因表达情况,收集病毒上清、浓缩鉴定、测定重组病毒的滴度.PCR和免疫组化鉴定LMP1表达.结果 融合慢病毒表达载体质粒限制性酶切分析证实有782 bp的ED-L2和1 300 bp的LMP1基因片段基因片段插入到慢病毒栽体中.转染重组ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒融合载体的细胞于荧光显微镜下呈绿色荧光;对该细胞PCR可以扩增出404 bp大小的LMP1基因片段和370 bp的EGFP基因片断;免疫组化证明LMP1蛋白在转染细胞表达阳性.结论 成功构建了ED-L2-LMP1-EGFP基因的慢病毒表达载体,为进一步在体研究LMP1基因的功能奠定了基础.     

Iduna过表达慢病毒的构建、包装及鉴定

目的构建大鼠Iduna cDNA的慢病毒表达质粒(pCDH-Iduna),包装Iduna过表达慢病毒,以期上调原代神经元细胞中Iduna的表达。方法提取SD大鼠脑组织总RNA,利用RT-PCR的方法获取大鼠Iduna cDNA序列,将其插入慢病毒过表达载体pCDH质粒中,经酶切和测序验证重组质粒pCDH-Iduna。将pCDH-Iduna(以pCDH-EGFP为阴性对照)及包装质粒共转染HEK293T细胞,包装Iduna过表达慢病毒,显微镜下观察HEK293T细胞的形态变化,了解病毒包装情况。用慢病毒感染原代神经元细胞,Western blot检测靶细胞中Iduna的表达效率。结果琼脂糖凝胶电泳显示Iduna的PCR扩增产物大小为1068 bp左右片段,酶切鉴定可见重组质粒pCDH-Iduna有约1000bp左右片段释放,与预期相符,测序结果提示克隆正确。将Iduna过表达慢病毒表达载体pCDH-Iduna及包装质粒共同转染HEK293T细胞后,镜下可见细胞呈现出毒时特有的致细胞病变效应。Iduna过表达慢病毒及其对照病毒感染原代神经元细胞,免疫荧光观察感染率达70%后,Western blot检测病毒感染的神经元细胞中Iduna表达显著增加。结论成功构建大鼠Iduna慢病毒过表达载体pCDH-Iduna并获得具有良好感染效率的过表达慢病毒,后者能够显著上调原代神经元中Iduna的表达。     

结构特异性核酸酶FEN1对HBV复制的影响

目的探索宿主因子FEN1对HBV复制过程的影响。方法构建FEN1过表达慢病毒质粒,酶切鉴定并测序,转染293FT细胞,Western blot检测FEN1蛋白表达。将该质粒转染HBV复制稳定细胞系,设立慢病毒包装改造质粒pLenti6/V5-D-TOPO和不转染质粒的细胞作为对照。ELISA检测细胞上清,Southern blot及Real-time PCR检测HBV DNA。结果初筛阳性克隆提取质粒酶切鉴定,于FEN1及线性载体质粒大小处出现明亮单一条带,测序结果表明序列插入正确,Western blot检测FEN1蛋白表达量为对照的2～3倍。FEN1过表达质粒转染HBV复制稳定细胞株,细胞上清ELISA检测HBsAg抗原呈阳性,D(450)值为(1.982±0.032);细胞内提取病毒DNA行Real-time PCR,绝对定量拷贝数为1.18×109,Southern blot检测亦表明HBV复制水平明显上调。结论结构特异性核酸酶FEN1能够明显促进HBV DNA复制,是体内一种重要的病毒复制调控因子。     

小鼠动力蛋白激活蛋白1-shRNA慢病毒载体的构建及在足细胞中的敲低效应

目的 构建表达小鼠动力蛋白激活蛋白1 (dynactin-1)特异性shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠足细胞dynactin-1的敲低效果.方法 针对小鼠dynactin-1 mRNA序列,设计合成3种shRNA,克隆到入门质粒pENTR/pTER中,再利用LR反应重组到pLenti X2 Puro慢病毒目的质粒,经过酶切测序鉴定后,将慢病毒质粒和包装质粒共转染293FT细胞,包装得到病毒颗粒.各组shRNA病毒载体转染小鼠足细胞后,用嘌呤霉素抗性筛选细胞,利用蛋白质印迹法检测各组细胞中dynactin-1蛋白的表达水平.结果 构建的各组shRNA入门质粒和慢病毒载体经酶切及测序鉴定正确;慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,制备病毒颗粒,转染小鼠足细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达shRNA的足细胞系;蛋白质印迹检测结果表明转染dynactin-1-shRNA组的dynactin-1蛋白表达降低.结论 构建的小鼠dynactin-1-shRNA慢病毒载体能有效降低小鼠足细胞中dynactin-1蛋白表达,为进一步研究dynactin-1在足细胞中的功能奠定了基础.     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

介绍一种简便、快速的回收DNA片段的方法

我们采用国产 DF-17型电洗脱槽回收了限制性内切酶酶切的 DNA 片段,证明该方法是一种简便、快速、可靠的回收核酸片段的方法.回收的 DNA 片段可进一步用于 DNA 克隆、探针标记和 DNA 分析.     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

弓形虫GRA7基因的保守性鉴定

目的　比较弓形虫不同地理株 (RH株、ZS2株、GT株 ) GRA7基因的异同。方法　运用 PCR从弓形虫不同地理株的基因组 DNA中扩增出 GRA7基因 ,对 GRA7基因用限制性内切酶(Esp3I、Cfr I、Mbo I)酶切并比较。将 GRA7基因克隆至 p GEX- 4 T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 JM10 9,进行测序并比较。结果　 PCR扩增出 3株弓形虫的目的基因片段大小均在 5 0 0 bp- 75 0 bp之间 ,约711bp。 3种限制性内切酶酶切片段的大小均与理论值相符。 3株弓形虫 GRA7基因序列相同。结论　弓形虫不同地理株 GRA7基因具有高度保守性。     

结核杆菌cfp10真核载体的构建、表达与基因免疫

目的: 构建以结核分枝杆菌H37Rv cfp10基因为基础的基因疫苗. 方法: 采用BamH I和Xba I双酶切质粒pGEM-Teasy-CFP10中,10 g*L-1琼脂糖凝胶电泳回收约300 bp大小片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3.1的相应酶切位点. 阳性克隆提取质粒,体外电穿孔转化CHO细胞,RT-PCR法检测cfp10特异的mRNA的表达. 质粒肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体的滴度. 结果: 用BamH I和XbaⅠ酶切鉴定证实目的基因正确插入载体pcDNA3.1,命名为pcCFP10; pcCFP10转化的CHO细胞RNA提取物中,RT-PCR扩增出300 bp大小的条带. 肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体平均滴度为1∶ 4,000. 结论: 以CFP10的编码基因为基础的真核表达质粒的构建成功.     

霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR的PCR扩增及克隆

为了构建霍乱弧菌和杜氏利什曼原虫双价口服活疫苗候选株,作者采用ＰＣＲ对霍乱弧菌毒力表达调控基因ｔｏｘＲ进行扩增及克隆,并对霍乱弧菌ｔｏｘＲ基因进行限制性酶切分析。结果显示：７株霍乱弧菌均扩增出１．３ｋｂ的ｔｏｘＲ基因片段,ｔｏｘＲ基因中部含有ＥｃｏＲⅠ酶切位点,再将ＴｏｘＲ基因克隆在质粒ｐＡＴ１５３上,对所获的重组质粒ｐｔＲ４进行限制性酶切分析,证实质粒ｐｔＲ４插入的１．３ｋｂ的ＤＮＡ片段为ｔｏｐ     

TA克隆载体的再生

目的 :再生 TA克隆载体。方法 :将环化质粒以限制性内切酶消化成线性后 ,以 Klenow大片段将末端补平 ,再用 Taq DNA聚合酶在线性载体的两个 5′末端各加上一个非配对的 T。结果 :构建成 TA克隆载体。结论 :TA载体的再生将使克隆 PCR产物更加方便、价廉。     

重组胸腺素α1 pMAL-C2x- Tα1/TB1工程菌的构建与表达

目的构建表达重组胸腺素α1(Tα1)的pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL-C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白(MBP-Tα1),采用Westernblot对MBP-Tα1进行鉴定。结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP-Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6%,分子量约为45×103。结论工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础。     

肝细胞生长因子原核表达载体PUC18-HGF的构建及鉴定

目的　构建人肝细胞生长因子 (hHGF)的原核表达载体。方法　利用基因重组技术 ,将人肝细胞生长因子cDNA全长序列 ,定向克隆于表达型载体PUC18质粒的多克隆位点中 ,限制性内切酶酶切鉴定。结果　重组PUC18-HGF原核表达载体经限制性内切酶电泳分析 ,与理论值相符。结论　本实验成功将人肝细胞生长因子cDNA全长序列插入表达型载体PUC18多克隆位点BamHI和Xbal限制性内切酶位点之间 ,为通过基因工程获得外源性HGF提供实验依据     

Q热立克次体DNA酶切片段的电泳分析

本文采用限制性核酸内切酶技术,对本室分离的Q热立克次体七医株,进行了DNA酶切片段的电泳分析,并以国外标准株(Grita株)作为参照。Q热立克次体经泛影葡胺密度梯度离心法进行分离纯化。提纯的立克次体DNA,用限制性核酸内切酶(HaeⅢ和BglⅠ)分别消解后,再经琼脂糖凝胶电泳法分析。本文结果证实,七医株和Grita株的酶切电泳图谱存在差异。这种差异在HaeⅢ酶谱上尤为明显。不仅两株立克次体DNA的绝大多数酶切片段的迁移距离不同,而且Grita株明显比七医株缺少包括4.3kb在内的几个HaeⅢ片段。