应用蛋白质的相互作用网络图筛选鼻咽癌放射抗拒相关基因

目的 应用蛋白质相互作用网络图,寻找鼻咽癌放射抗拒相关的分子标志物,探讨鼻咽癌放射抗拒机制.方法 应用全基因组表达谱芯片,初步筛选出2种不同放射敏感性细胞株CNE-2R与CNE-2的差异表达基因.采用计算机软件随机选取4个差异表达基因,分别设计引物,用半定量RT-PCR技术检测验证.将2次实验中均出现的差异有统计学意义的基因导入SNOW在线数据库进行分析,绘制差异基因相互作用网络图,网络中心节点作为鼻咽癌放射抗拒相关分子标志物;进一步采用Western blot检测关键节点STAT1在CNE-2R与CNE-2表达差异.结果 CNE-2R与CNE-2相比,2次芯片实验中均出现的差异基因374个,其中差异有统计学意义的基因197个;随机选取的4个差异表达基因RT-PCR结果与芯片扫描结果相似,具有相同的方向性.197个共有的差异有统计学意义的基因编码蛋白经SNOW分析存在相互作用,并构成一个复杂的相互作用网络图,寻找到了关键性的节点为STAT1和JUN.Western blot结果显示,STAT1-d在CNE-2R中表达明显高于CNE-2(t =4.96,P＜0.05).结论 关键性的节点STAT1和JUN可能是引起鼻咽癌放射抗拒的分子标志物,STAT1-α可能与鼻咽癌放射抗拒发生密切相关.     

鼻咽癌细胞辐射抗拒的比较蛋白质组学分析

目的 通过分离并鉴定具有不同辐射抗拒的人鼻咽癌细胞株CNE-2R与CNE-2的差异表达蛋白,探讨与鼻咽癌细胞辐射抗拒相关的分子机制.方法 分别提取鼻咽癌辐射抗拒细胞株CNE-2R及其亲本细胞株CNE-2的总蛋白,采用双向凝胶电泳分离,经软件分析识别差异表达蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.结果 两种不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞株CNE-2R和CNE-2中,共筛选出差异表达明显的蛋白质点有32个,其中11个蛋白质被鉴定成功,在CNE-2R中上调的蛋白有3个,下调的蛋白有8个.结论 不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞的差异表达蛋白,主要涉及调节凋亡、DNA损伤与修复、细胞周期调控、RNA转录、细胞信号转导、细胞骨架组成及辐射应激反应等多个方面.     

鼻咽癌细胞放射敏感性的比较蛋白质组学研究

目的 探讨与鼻咽癌细胞放射敏感性相关的并可能预测鼻咽癌细胞放射敏感性的蛋白质。方法 以人鼻咽癌细胞株CNE-2诱导建立放射抗拒的鼻咽癌细胞株CNE-2(R743),通过克隆形成实验及流式细胞术检测以比较CNE-2和CNE-2(R743)细胞的放射敏感性及细胞周期的特征。提取细胞总蛋白质,进行双向凝胶电泳,Image Master 7.0图像分析软件分析图谱以识别差异蛋白质点,MALDI-TOF/TOF肽质量指纹图谱分析,蛋白质质谱数据库搜索鉴定差异蛋白。应用RT-PCR和Western blot验证2种细胞中相关差异蛋白的表达。 结果 得到7个差异表达较显著的蛋白质,与CNE-2相比较,CNE-2(R743)细胞中6个上调,1个下调。Western blot及 RT-PCR证实膜联蛋白A2、原肌球蛋白及糖调节蛋白78在CNE-2(R743)的表达均上调(t=24.22、24.20和29.19,P<0.05),与蛋白质组学结果一致。结论 不同放射敏感性鼻咽癌细胞存在差异表达的蛋白质,其中膜联蛋白A2、原肌球蛋白及糖调节蛋白78有可能成为预测鼻咽癌细胞放射敏感性的候选生物标志物。     

放射抗拒细胞模型基因表达异常对比研究

目的研究已建立的放射抗拒细胞对比模型基因表达谱差异，初步分析放射抗拒的相关基因。方法Hep-2细胞重复照射12次后，传代培养至细胞形态、增殖状态稳定，筛选得到抗拒细胞株Hep-2R。从亲代Hep-2细胞和Hep-2R细胞提取总RNA，选用2张各含基因14000个的基因表达谱cDNAV芯片检测。筛选2张芯片差异相同的基因，计算Hep-2R细胞与Hep-2细胞基因表达的比值。结果Hep-2R与Hep-2的放射生物学参数分别为SF2=0．6798，D0=3．24、α=0．2951、β=0．0363，及SF2=0．4148、Do=2．06、α=0．1074、β=0．0405，Hep-2R获得了明显的抗拒性（SF2的x^2=63．957，P〈0．001）。Hep-2R细胞中上调基因22个，下调基因19个，主要基因类别为：蛋白质合成基因11个、DNA损伤修复基因9个、细胞结构基因6个、凋亡相关基因3个、癌基因与抑癌基因2个、细胞周期基因2个、代谢基因2个、信号通路受体基因2个、其他类基因4个。端粒保护蛋白基因POT1表达在所有上调基因中变化最显著（上调3．348倍）。结论不同放射敏感性的对比模型细胞基因表达谱不同，POT1基因变化最显著，有可能成为放射增敏的靶点。     

沉默STAT1基因增强放射抗拒鼻咽癌CNE-2R细胞放射敏感性

目的 研究基因STAT1沉默对人放射抗拒鼻咽癌细胞放射敏感性的影响.方法 慢病毒介导的STAT1基因转染放射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2R,荧光定量RT-PCR技术检测沉默效果.MTT法检测转染前后细胞增殖活性,流式细胞技术检测细胞周期及凋亡,克隆形成实验检测转染前后细胞放射敏感性变化.结果 慢病毒转染后放射抗拒鼻咽癌细胞STAT1表达降低(F=429.87,P<0.05)、细胞生长抑制(F3=.88~4.63,P<0.05)、凋亡率增加(F=38.13,P<0.05)、放射敏感性增加(F=252.80,P<0.05)、细胞周期中G₀/G₁、S和G₂/M期未见明显差异(P>0.05).结论 沉默STAT1基因能增加放射抗拒鼻咽癌细胞 CNE-2R的放射敏感性.     

靶向Survivin的siRNA对鼻咽癌细胞生长抑制作用的研究

目的通过化学合成靶向Survivin的SiRNA转染CNE-2细胞株的方法来探讨以Survivin为靶点的基因干预手段对鼻咽癌细胞生长抑制作用,为鼻咽癌的基因治疗提供新的实验依据。方法通过生物合成Survivin特异性siRNA转染CNE-2细胞,采用Western blotting检测Survivin在干扰后蛋白的表达情况,并筛选出干扰效果最好的siRNA序列转染细胞进行细胞生长抑制试验(CCK-8实验)检测其对细胞生长抑制作用。结果转染siRNA后,CNE-2细胞中survivin表达明显下降,筛选出转染1号序列的实验组CNE-2细胞进行CCK-8实验,结果显示,其细胞增殖明显抑制。结论靶向Survivin的siRNA转染人鼻咽癌CNE-2细胞有效抑制鼻咽癌CNE-2细胞Survivin表达,细胞增殖受到抑制。     

Ku蛋白表达与鼻咽癌细胞放射敏感性 关系初探

目的探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1（鼻咽高分化鳞癌细胞株）、CNE-2（鼻咽低分化鳞癌细胞株）中DNA依赖蛋白激酶（DNA—PK）的调节亚基Ku70、Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数，并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值，以及四氮唑蓝比色分析法（MTT法）检测^60Co γ射线4Gy照射后的细胞群体生长情况，以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术（RT-FQ-PCR）检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平Ku70、Ku80基因的定量表达。结果CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高，MID值分别为2．78、1．61，SF2值分别为0．627、0．341；4Gy照射后的存活率分别为88．2％、72．3％；RT-FQ-PCR显示两株细胞中均有Ku70、Ku80基因的表达，其相对表达量之比分别为1．76±0．54（P=0．07）、13．82±3．78（P=0．004），Ku80基因在CNE-2细胞中存在剂量依赖关系。结论实验验证了CNE-2比CNE-1对射线更敏感，Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。     

鳞癌细胞株放射敏感性与端粒酶活性及端粒长度变化的关系

目的探索放射抗拒鳞癌细胞株放射敏感性的改变与端粒酶活性、端粒长度变化的关系。方法以人喉鳞癌细胞株Hep2为实验对象,用γ射线反复照射获得具有放射抗拒性细胞株Hep2R,拟合细胞存活曲线比较两种细胞株的放射生物学参数及端粒酶抑制剂AZT(azidothymidine,叠氮胸苷)作用后的变化,用TRAP-ELISA法测定端粒酶活性(OD值),Southernblotting法分析端粒平均长度(TRF),比较端粒酶活性、端粒平均长度的变化。结果辐射诱导出一个具有放射抗拒性的Hep-2R细胞株,并已稳定传代培养30代以上且放射抗拒性能稳定,测得其SF2=0.6798、D0=3.24,Hep-2R细胞的端粒酶活性较Hep-2细胞升高(0.982±0.005vs0.604±0.015),端粒长度延长了2倍(11.12kbvs3.76kb),AZT作用后Hep2R细胞株SF2=0.4892、D0=2.51,端粒酶活性下降为0.708±0.011、端粒长度缩短为10.18kb。Hep2细胞对应的参数SF2=0.4148、D0=2.06,AZT作用后Hep2细胞SF2=0.3843、D0=1.81,端粒酶活性下降为0.364±0.003、端粒长度缩短为2.76kb。结论辐射诱导细胞获放射抗拒性后其端粒酶活性升高、端粒平均长度增长,端粒酶抑制剂能通过降低端粒酶活性、缩短端粒长度而对其有增敏效应。     

放射抗拒性肿瘤细胞株构建研究进展

约70%的恶性肿瘤患者需要放射治疗,局部复发和转移是治疗失败的主要模式,放射抗拒性是重要的因素之一。明确潜在的放射抗拒相关机制至关重要,通过放射线构建放射抗拒性肿瘤细胞株是关键的工作基础。根据分割剂量、照射次数及不同分割剂量组合方式等因素的不同,归纳出4种典型的照射模式：常规照射模式、反复照射模式、梯度照射模式和其他照射模式。不同的照射模式在总照射剂量、构建周期上不同,肿瘤细胞的生物学特性也存在差异。梯度照射模式随着细胞株放射抗拒性增强而逐步提高分割剂量,较好地平衡了分割剂量和照射后细胞恢复至指数期时间,优于其他3种照射模式。临床相关放射抗拒性细胞株具备放射抗拒性表型的同时,保持与亲本细胞株相同的基因型,是未来肿瘤放射抗拒性研究的重要方向。     

RNA干扰抑制c-jun基因表达对放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R放射敏感性的影响

目的 利用RNA干扰技术抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,研究其对CNE-2R细胞放射敏感性的影响及其潜在机制.方法 设计合成3组特异性针对c-jun基因的siRNA,构建慢病毒vshRNA载体,感染CNE-2R细胞,采用RT-PCR和Western blot方法检测各组对目的基因的抑制效果;并通过克隆形成实验测定其放射敏感性,CCK-8实验检测细胞的存活能力,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 重组慢病毒c-jun-RNAi-LV2能明显下调CNE-2R细胞中c-jun的mRNA和蛋白水平的表达(F=217.20、42.07, P<0.05).6 MV X射线联合c-jun-RNAi-LV2组在0、2、4、6和8 Gy照射后细胞的吸光度值均显著低于未转染组和阴性对照组(F=42.70~200.67, P<0.05).克隆形成实验显示,c-jun-RNAi-LV2组与未转染组及阴性对照组相比,SF₂、D₀和D_q值均减小,放射增敏比(SER_D0)为1.41.细胞凋亡实验结果显示,未经照射的c-jun-RNAi-LV2组与联合2 Gy照射的凋亡率分别为(20.93±1.99)%和(38.17±0.83)%,均高于未转染组和阴性对照组的凋亡率[0 Gy:(10.97±0.70)%和(20.43±0.25)%;2 Gy:(10.80±1.25)%和(19.53±1.50)%;F=50.54、330.14, P<0.05].结论 RNA干扰技术可有效抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,使细胞放射敏感性增高,其作用可能与c-jun基因的下调使细胞增殖能力减弱,细胞凋亡增多有关.     

食管癌放射抗拒关键基因及通路的生物信息学分析

目的 寻找食管癌放射抗拒关键分子及通路,从分子水平揭示食管癌放射抗拒发生机制。方法 从基因芯片公共数据库GEO中下载食管癌放射抗拒相关芯片数据（GSE61772,GSE61620）;进一步运用GEO2R进行差异基因分析,利用DAVID、String等分析软件对差异基因进行生物信息学分析。RT-PCR技术检测差异基因在不同放射敏感性细胞中表达差异。结果 两组芯片数据中共筛选出49个差异基因,这些基因参与生物学过程主要集中在调节多细胞生物合成、离子转运、DNA合成、代谢、调节细胞增殖等。差异基因涉及的主要生物学通路是Wnt信号通路。12个差异基因间存在相互作用关系,关键节点为CHN2。CHN2基因在不同放射敏感性食管癌细胞中表达未见明显差异。结论 包括CHN2在内的49个差异基因可能与食管癌放射抗拒发生相关, Wnt信号通路在其中具有重要作用。     

食管癌细胞系TE13R120放射抗性与HDAC3、NF-kB和NRAGE关系的研究

目的探讨HDAC3、NF—kB和NRAGE基因与食管癌细胞放射抗性的关系。方法以人食管癌细胞系TE13和由TE13经γ射线反复照射建立的放射抗性细胞系TE13R120为研究对象，用Western blotting技术检测这两种细胞于不同时间、剂量点照射后基因HDAC3、NF—kB和NRAGE的蛋白表达；用流式细胞术检测相同时间、剂量点两种细胞的凋亡和细胞周期分布情况。结果Western blotting显示，与TE13相比，TE13R120细胞照射前后HDAC3的核表达均增高，NF-kB的表达也明显增强，NRAGE在两种细胞胞浆中的表达无差异。与TE13相比，TE13R120中S期细胞明显增多，照射后G2期阻滞明显，凋亡水平较低。结论基因HDAC3和NF-kB可能在食管癌细胞放射抗性形成中发挥作用并可能有协同作用；NRAGE与食管癌辐射抗性的关系有待进一步研究。     

辐射相关基因芯片的制备及其在肺癌细胞中的应用

目的 寻找参与肺癌细胞辐射抗性的基因。方法构建辐射相关的基因芯片，初步筛选出在不同辐射敏感性肺癌细胞系中差异表达的基因。为了评价芯片结果的可靠性，我们对一些差异表达基因进行了RT-PCR验证。结果和辐射敏感的NCI-H446细胞相比，辐射抗性的A549中有18个基因有明显的改变，8个基因是上调，10个基因是下调。在照射后6h和24h，A549细胞中分别有22个基因(19个基因上调，3个下调)和26个基因(8个上调，18个下调)的差异表达；NCI-H446细胞中分别有17个基因(9个基因上调，8个下调)和18个基因(6个上调，12个下调)差异表达。从这些基因中，我们发现一些参与细胞增殖和抗凋亡的基因，在照射后的A549细胞中是增高的，而在NCI-H446细胞中是降低的。另外一些参与DNA修复的基因，在A549中比在NCI-H446细胞中有更高的表达。结论一些参与细胞DNA修复、细胞周期调控、细胞增殖和抗凋亡作用的基因可能有助于A549细胞辐射抗性的形成。     

Dcr3 inhibit p53-dependent apoptosis in γ-irradiated lung cancer cells

Purpose:?To identify genes responsible for the radiosensitivity, we investigated the role of the differential gene expression profiles by comparing radioresistant H1299 with radiosensitive H460 lung cancer cell lines.

Materials and methods:?mRNA profiles of lung cancer cell lines were assessed using microarray, and subsequent validation was performed with qRT-PCR (Quantitative real time-polymerase chain reaction). The expression levels of differentially expressed genes were determined by Western blot and the radioresistance of lung cancer cell lines was measured by clonogenic assay.

Results:?From the differentially expressed apoptosis-related genes between H1299 and H460, we found Dcr3 (Decoy receptor 3, also known as TNFRSF6B; Tumour necrosis factor receptor super family member 6B) expression was significantly (P?=?4.38 × 10^?7) higher in H1299 cells than H460 cells. Moreover, the Dcr3 mRNA expression level in the radioresistant cell lines (H1299, A549, DLD1, MB231, MB157) was increased in comparison to the radiosensitive cell lines (ME180, Caski, U87MG, MCF7, H460). Overexpression of Dcr3 increased the survival rate of radiosensitive H460, MCF7, and U87MG cells, and knockdown of Dcr3 abolished the radioresistance of A549 cells. The survival rate of p53 (Tumour protein 53)-deficient H1299 after gamma-irradiation was not affected by the suppression of Dcr3 expression. However, when we introduced p53 into H1299 cells, siDcr3 (siRNA of Dcr3) suppressed the radioresistance of H1299 cells by inducing p53-dependent Fas (Fas receptor, also known as TNFRSF6; Tumour necrosis factor receptor super family member 6)-mediated apoptosis pathway.

Conclusion:?Characterisation of gene expression profiles in two lung cancer cell lines revealed that Dcr3 expression and p53-dependent apoptosis signalling pathway regulate cellular response to ionising radiation.     

BEP2D细胞恶性转化不同时期差异表达基因的筛选

目的 筛选并鉴定α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达的基因。方法 抑制消减杂交(SSH)，cDNA芯片。结果 利用SSH构建了BEP2D细胞3个恶性转化不同时期差异表达基因的文库。BEP2D细胞的文库有416个克隆，R15H20细胞的文库有301个克隆，R15H35细胞的文库有586个克隆，经cDNA Microarray验证发现：BEP2D细胞文库来源的芯片与3代细胞探针杂交后的阳性信号率为90．4％、21．6％和19．7％；R15H20细胞文库来源的芯片的阳性信号率为8．6％、93．8％和31．6％：R15H35细胞文库来源的芯片的阳性信号率为23．5％、18．2％和90．7％。结论 联合应用SSH和cDNA Microarray是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速和有效方法；经cDNA Microarray鉴定出的3个文库中差异表达的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关的基因。     

应用慢病毒shRNA文库结合二代测序筛选口腔鳞癌放疗抵抗相关分子

目的:用高通量方法筛选口腔鳞癌放疗抵抗相关的激酶基因,为口腔鳞癌的临床治疗决策提供理论基础。方法:以慢病毒构建的短发夹核糖核酸(shRNA)激酶文库(含4 675个不同shRNA序列,覆盖709个人激酶基因)感染舌鳞癌Cal-27细胞,嘌呤霉素筛选去除未成功感染的细胞后,以光子射线进行照射(0、10和15 cGy),然...