凋亡素基因诱导乳腺癌细胞株凋亡的体内外实验研究

目的构建凋亡素基因(vp3)重组真核表达质粒(pcDvp3),观察vp3基因在人乳腺癌细胞435中的表达及诱导凋亡作用,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。方法(1)克隆vp3基因并与pcDNA3.1质粒连接构建pcDvp3重组真核表达载体,测序鉴定;(2)用脂质体将pcDvp3和pcDNA3.1转染人乳腺癌细胞435,48h后分别用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡;(3)建立人乳腺癌细胞435的裸鼠模型,分组给药后测定抑瘤率,并用原位凋亡(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果(1)核酸序列分析表明已构建成重组质粒pcDvp3;(2)pcDvp3转染肿瘤细胞48h后,电镜下可见明显形态改变及凋亡小体形成;琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带;流式细胞仪检测出现凋亡峰,其凋亡百分率高达14.42%;(3)裸鼠实验可见pcDvp3组抑瘤率分别为65.52%和68.23%,明显高于pcDNA3.1组(t=4.06,P<0.01),TUNEL检测可见pcDvp3组肿瘤细胞凋亡。结论vp3基因在体内外均能够有效地诱导人乳腺癌435细胞凋亡。     

凋亡素基因在人乳腺癌细胞中的表达及诱导凋亡作用

目的 构建pcDvp3重组真核表达质粒，并观察凋亡素基因(vp3)在人乳腺癌细胞一435中的表达及诱导凋亡作用。方法 (1)扩增vp3基因，与pcDNA3．1连接构建pcDvp3重组真核表达载体，并测序；(2)将pcDvp3和pcDNA3．1转染Hela细胞，免疫荧光技术检测凋亡素蛋白表达；(3)将pcDvp3和pcDNA3．1空质粒转染人乳腺癌细胞435和正常细胞，转染48h后用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果 (1)核酸序列分析证明克隆的vp3基因与文献报道一致，且正确插入载体中，表明真核表达载体pcDvp3构建成功；(2)转染pcDvp3的Hela细胞48h后可见明显的荧光，而pcDNA3．1组未见；(3)电镜可见细胞明显形态改变及凋亡小体形成；电泳见典型梯形条带；流式细胞仪检测出现凋亡峰，于转染48h后达最高，凋亡百分率为14．42％；而转染pcDNA3．1细胞未见上述改变。结论 vp3在体内能够表达并有效地诱导人乳腺癌．435细胞凋亡。     

外源性Apoptin蛋白过表达对裸鼠乳腺癌MCF-7移植瘤凋亡活性的影响及机制

目的 构建表达重组凋亡素(VP3)基因的重组逆转录病毒,探讨其对人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤模型的凋亡诱导活性及机制.方法 克隆VP3基因,重组法构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-VP3(pLLVP3),转染PT67细胞进行病毒包装;雌激素皮贴刺激法建立去卵巢裸鼠乳腺癌皮下移植瘤模型,观察pLLVP3对肿瘤的生长抑制情况,TUNEL法检测肿瘤凋亡,Western blot印迹法检测VP3、Caspase-3和bcl-2蛋白表达.结果 重组载体pLLVP3鉴定正确,滴度为1×10~7 pfu/ml;裸鼠实验pLLVP3组抑瘤率分别为65.52%和68.23%,显著高于对照组(t=4.06,P<0.01),48 h可见VP3蛋白高表达.TUNEL见各组凋亡指数无差异(t_1=1.05,t_2=0.84,均为P>0.05).VP3蛋白高表达组Caspase-3表达亦升高,但bcl-2未见差异.结论 VP3基因能够诱导人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡,可能是激活Caspase-3而发生作用.     

封闭乳腺癌转移抑制基因1的表达可抑制乳腺癌细胞MCF-7的转移

目的 构建乳腺癌中乳腺癌转移抑制基因1( BRMS1)反义基因重组腺病毒载体,并观察其对乳腺癌细胞MCF-7转移能力的影响。方法 应用基因重组技术将BRMS1反义基因构建于腺病毒载体pAD-X,转染293包装细胞得到高滴度重组腺病毒,并用real-time聚合酶链反应(PCR)进行BRMS1基因表达的验证。将重组腺病毒pAD-aBRMS1感染MCF-7细胞后,应用Tran-°swell小室法观察对细胞侵袭和运动能力的影响。结果 酶切结果与预期相符,real-time PCR可检测到感染BRMS1反义基因重组腺病毒后MCF-7细胞没有BRMS1基因表达。病毒转染后Transwell 小室可见,MCF-7细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制(P值均＜0.01)。结论 重组反义BRMS1腺病毒载体正确构建,其对乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和运动都有抑制作用。     

下调星形细胞上调基因1表达对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的:探讨下调星形细胞上调基因1(AEG-1)对乳腺癌细胞凋亡的影响。方法:通过脂质体介导的方法,将乳腺癌MCF-7细胞分别转染AEG-1siRNA(AEG-1siRNA)和阴性对照siRNA(阴性对照组),以无处理的MCF-7细胞为空白对照组。验证转染效果后,分别采用流式细胞术与Westernblot检测各组细胞的凋亡以及凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9的表达。结果:与空白对照组细胞比较,AEG-1siRNA组MCF-7细胞AEG-1蛋白表达明显降低、细胞凋亡率明显升高、caspase-3和caspase-9蛋白表达明显上调(均P0.05);阴性对照组与空白对照组间以上各项指标均无统计学差异(均P0.05)。结论:下调乳腺癌细胞AEG-1的表达能促进caspase-3和caspase-9的表达,从而诱导乳腺癌细胞凋亡,因此,AEG-1在乳腺癌细胞中可能起了抑制细胞凋亡的作用,机制可能与其调节凋亡相关蛋白的表达有关。     

腺病毒介导的野生型p53基因逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的研究

目的 探讨野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的逆转作用及其机制.方法 选用含野生型p53基因的重组腺病毒载体,转染乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A,绘制细胞生长曲线,利用流式细胞计数仪检测细胞周期分布及凋亡分析、TUNEL法检测细胞凋亡的发生,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot印迹转移检测p53基因的表达情况.结果 野生型p53基因转染MCF-7/A后的24、48 h均检测到p53基因的表达,并显著抑制MCF-7/A细胞的增殖;细胞周期发生改变,转染后的MCF-7/A的G0%G1期DNA百分含量(76.22%)明显高于对照组(43.64%,P<0.05),凋亡率(10.76%)与对照组(1.48%)之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 重组腺病毒介导的野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A的耐药性有明显的逆转作用,其机制可能是引起明显的G1期阻滞并诱导细胞凋亡.     

凋亡素重组腺相关病毒的构建及体外抑制膀胱癌效应

目的 探讨携带凋亡素基因的重组腺相关病毒构建方法,观察其体外抑制膀胱癌的效应.方法 构建重组质粒pAAV-VP3,经EcoRI/Sal Ⅰ双酶切鉴定和基因测序无误后,采用三质粒共转染法包装重组腺相关病毒rAAV-VP3.收获病毒后聚合酶链反应(PCR)扩增病毒液中的目的基因鉴定重组病毒,对其进行纯化后透射电镜观察病毒颗粒,并检测病毒滴度.按每个细胞5×105个载体基因组的剂量感染EJ细胞后,逆转录(RT) -PCR检测VP3基因在EJ细胞中的转录,Western blot法检测凋亡素蛋白的表达.透射电镜扫描观察感染重组病毒后肿瘤细胞的超微结构变化,流式细胞术(FCM)检测重组病毒对EJ细胞的影响.结果 转染72 h后重组腺相关病毒rAAV-VP3包装成功,滴度为5.1×1011个载体基因组/ml,电镜下可见病毒颗粒.感染EJ细胞后,可检测到VP3基因的转录和凋亡素蛋白表达,电镜观察到凋亡形态学改变,FCM检测S期细胞比例降低和G2/M期细胞比例增高,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 重组腺相关病毒rAAV-VP3在体外能够发挥生物学活性,其介导的凋亡素表达抑制膀胱癌的体外效应为体内实验奠定了基础.     

PTEN和p27Kip1共表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的　通过腺病毒介导转染前列腺癌PC 3细胞 ,探讨人 10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白类似物 (PTEN)和p2 7Kip1对肿瘤细胞增殖和凋亡等方面的影响及二者的协同作用。方法　构建携带人PTEN和p2 7Kip1基因的腺病毒载体 ,体外转染PC 3细胞 ,通过RT PCR、Westernblot检测目的基因不同水平的表达。采用细胞生长试验、流式细胞仪检测PC 3转染前后细胞增殖、细胞周期和早期凋亡率的变化。结果　病毒滴度Ad PTEN为 1 8× 10 7pfu ml、Ad p2 7Kip1为 1 2× 10 9pfu ml,RT PCR检测有PTEN mRNA(46 2bp)和p2 7Kip1 mRNA (32 0bp) ,Westernblot检测有PTEN蛋白 (6 0KD)和P2 7蛋白 (2 7KD)特异表达 ,可明显抑制PC 3细胞的增殖 ,诱导细胞凋亡 ,联合基因治疗组与单基因组相比差异有显著意义。结论　成功构建携带人PTEN和p2 7Kip1的重组腺病毒载体 ,在前列腺癌细胞株PC 3得到了稳定、特异的高表达 ,联合基因疗法有望成为治疗前列腺癌的有效方法。     

Meox2调控PI3K/AKT信号通路对乳腺癌细胞的增殖及机制的影响

目的:探究间充质同源盒蛋白(Meox2)对乳腺癌细胞增殖能力及其机制的影响。方法:体外培养人乳腺癌细胞株MCF-7,腺病毒转染调高细胞Meox2基因的表达,常规无额外基因序列添加的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞设为Control组,含有Meox2基因的腺病毒(Ad-Meox2)转染细胞后设为Ad-Meox2组,以空载体Ad-GFP转染细胞后设为Ad-GFP组。荧光显微镜观察其转染率。采用MTT法和流式细胞仪分别验证过表达的Meox2对乳腺癌细胞在24、48、72 h后细胞的增殖及周期的变化。采用Western blot检测细胞中Meox2及其下游PI3K/AKT通路蛋白的表达。结果:腺病毒转染的MCF-7细胞中Meox2基因表达上调,转染率为95%以上。MTT显示,Ad-Meox2组可明显呈时间依赖性地抑制细胞增殖(P0.05)。流式细胞仪检测显示Ad-Meox2组可显著阻滞细胞周期的进行,使更多的细胞停滞于S期与G2/M期(P0.05),同时,阻滞细胞进入下一个周期,即G0/G1期(P0.05)。Western blot显示各组的MCF-7细胞中PI3K和AKT含量无明显变化(P0.05),但Ad-Meox2组的p-PI3K和p-AKT蛋白含量较Control组明显下降(P0.05)。结论:Meox2基因可通过PI3K/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞周期的进程,进而抑制乳腺癌细胞的增殖能力,提示Meox2可能是乳腺癌新的治疗靶点。     

靶向ABCG2的RNA干扰逆转乳腺癌球囊细胞化疗耐药的研究

【摘要】 目的 通过靶向ABCG2的RNA干扰逆转乳腺癌球囊细胞化疗耐药。方法 以ABCG2为靶点,设计ABCG2-siRNA,构建ABCG2干扰慢病毒载体并包装好病毒,稳定转染到筛选好的MCF-7球囊细胞中,Western Blot方法检测ABCG2的表达情况,MTT法检测RNAi沉默ABCG2基因对球囊细胞的增殖抑制作用,同时流式细胞术检测RNAi沉默ABCG2对MCF-7球囊细胞在耐药情况下的细胞周期变化和凋亡状况。 结果 ABCG2干扰慢病毒载体成功构建并包装病毒,建立起ABCG2稳定沉默的MCF-7乳腺癌球囊细胞系。Western Blot显示球囊细胞中高表达的ABCG2,在RNAi沉默后表达下降;MTT结果显示,在5-Fu的作用下的MCF-7贴壁细胞抑制率高于MCF-7球囊细胞,而沉默ABCG2的MCF-7球囊细胞其抑制率会随着5-Fu量的增加而增高;流式细胞仪也显示球囊细胞大多处于G0/G1期,加入5-Fu和沉默ABCG2后,处于G0/G1期细胞数会增加,凋亡率会明显增加。结论 乳腺癌球囊细胞高表达ABCG2蛋白,其5-Fu耐药性高于亲本MCF-7细胞,沉默ABCG2后能够增加球囊细胞在5-Fu的作用下的细胞抑制率及凋亡率,从而逆转对5-Fu的耐药性。     

腺病毒介导的野生型p53对前列腺癌细胞系PC3M的影响

目的　探讨腺病毒介导的野生型p5 3在前列腺癌基因治疗中的可能性及其机制。　方法　培养前列腺癌细胞系PC3M ,转染腺病毒介导的野生型p5 3,检测其增殖和凋亡水平变化 ,并检测其对bax蛋白及mRNA水平的影响。　结果　腺病毒介导的野生型p5 3可高水平转染入PC3M细胞 ,转染率 95 %。转染后的PC3M细胞增殖受到抑制 ,BrdU吸光度A值 0 .4 96 ,显著低于对照组的 1.4 5 4 ,P <0 .0 0 1;细胞凋亡水平增高 ,凋亡指数 16 .2 5 % ,显著高于对照组的 3.6 0 % ,P <0 .0 0 1。细胞中bax蛋白及mRNA水平皆增高。　结论　腺病毒介导的野生型p5 3可抑制PC3M细胞增殖并促进其细胞凋亡 ,其作用可能是通过促进bax表达而实现的。     

Chemosensitization of breast carcinoma cells with the use of bcl-2 antisense oligodeoxynucleotide

This study was designed to observe whether the rates of apoptosis induced in the breast cancer cell line MCF-7 by 5-fluorouracil (5-FU) could be enhanced by transfecting bcl-2 antisense oligonucleotide (ASODN). In our experiment, bcl-2 ASODNs and control ODNs including untreated control, sense ODN and scrambled ODN, were transfected into MCF-7 cells. Changes in expression of the bcl-2 gene were examined by Western blot; cell growths were detected by MTT assay, and apoptosis rates were detected by flow cytometry (FCM). Expression of bcl-2 protein after transfection of bcl-2 ASODN was significantly lower than control ODNs. Moreover, incubation of MCF-7 with bcl-2 ASODN prior to 5-FU treatment caused remarkable loss of viable cells compared with all other control ODNs (P < 0.01). FCM showed the apoptosis rates for ASODN, untreated control, sense ODN and scrambled ODN (29.8 +/- 7.4)%, (8.0 +/- 2.3)%, (15.0 +/- 5.1)% and (16.5 +/- 7.1)%, respectively. Compared with control ODNs, ASODN achieved the strongest effect in terms of enhancing apoptosis (P < 0.01). These results suggest that combining bcl-2 ASODN with 5-FU led to synergistic cytotoxicity.     

p21基因沉默联合表阿霉素促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其机制的研究

目的研究si RNA沉默p21基因表达联合表阿霉素对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响及相关作用机制。方法将化学合成的针对p21的si RNA序列转染至MCF-7细胞,将MCF-7细胞分为5组:空白对照组、阴性对照组、RNA抑制组、表阿霉素组、联合组(RNA沉默+表阿霉素)。采用MTT比色法、流式细胞术和分光光度法分别检测MCF-7细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族成员Caspase-9、Caspase-3和Caspase-6的活化程度。结果 p21 si RNA转染后,相对于表阿霉素单独处理组,联合组细胞死亡率明显升高(P0.01);Caspase-9、Caspase-3和Caspase-6的活化程度显著升高(P0.01)。结论 p21靶向RNA抑制联合表阿霉素处理显著促进了MCF-7细胞凋亡,p21可作为乳腺癌基因治疗的后选新靶点。     

内源性NO对人乳腺癌细胞化疗敏感性的影响

目的 研究内源性一氧化氮(NO)对人乳腺癌细胞化疗敏感性的影响. 方法应用IL-1β处理培养的MCF-7细胞,检测NO的产生情况并用蛋白质印迹法检测诱导型一氧化氮合酶(in-duceble nitric oxide synthase,iNOS)蛋白的表达.M1rr法检测MCF-7细胞在NOS抑制剂NG-甲基-L-精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine,L-NMMA)和NO合成原料L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)作用下对多柔比星(adriamycin,ADM)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)药物的敏感性. 结果内源性NO的产量与IL-1β剂量呈正相关.在IL-1β诱导作用下MCF-7细胞大量表达iNOS蛋白,并与L-Arg、L-NMMA存在与否无关.当ADM浓度为0.5 μmol/L和1 μmol/L时,实验组细胞的生存率明显下降(P<0.05).加入L-NMMA能显著提高实验组细胞的生存率(P<0.05);加入L-Arg能显著提高MCF-7细胞对化疗药物的敏感性(P<0.05).结论在细胞因子IL-1β诱导下MCF-7细胞产生的内源性NO增加,并使MCF-7细胞化学敏感性提高.     

联合PTEN和P27抑制前列腺癌侵袭和血管生成的实验研究

目的:探讨联合PTEN和P27基因治疗对人前列腺癌PC-3细胞侵袭力和血管生成的影响。方法:构建携带人PTEN和P27基因的腺病毒载体(Ad-PTEN、Ad-P27),在HEK293细胞包装、扩增,空斑试验测定病毒滴度,体外转染PC-3细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的基因的表达,利用Boyden侵袭小室法检测联合转染PTEN和P27对PC-3细胞侵袭力的改变,MTT法检测人脐静脉内皮细胞增殖的变化与鸡胚囊实验观察对血管生成的抑制作用。结果:病毒滴度Ad-PTEN为1.8×107pfu/ml、Ad-P27为1.2×109pfu/m,lRT-PCR、Western印迹检测在PC-3细胞中有PTEN和P27的特异高表达,PC-3细胞侵袭力受到明显抑制,联合转染PTEN和P27的PC-3细胞上清液对人脐静脉内皮细胞ECV-304的生长和鸡胚尿囊膜血管形成均有明显的抑制作用,PTEN+P27组与Ad-PTEN、Ad-P27组相比差异有显著性(P<0.05)。结论:联合PTEN、P27基因治疗在抑制前列腺肿瘤细胞侵袭力和抑制血管生成等方面具有协同、增效的作用。     

联合基因靶向治疗对乳腺癌细胞及血管内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体（KDR）启动子驱动的双自杀基因（CDglyTK）联合survivin反义寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌细胞（MCF-7）及血管内皮细胞（ECV304）的特异性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy—KDR—CD0yTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MCF-7和ECV304细胞株,同步用survivinASODN转染已感染腺病毒的MCF-7和ECV304细胞株,观察腺病毒的感染效率和survivinASODN的转染情况,应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot免疫印迹法检测CDglyTK和survivin基因在转基因MCF-7和ECV304细胞中的表达,MTT法测定两者联合应用对细胞的杀伤效应和旁观者效应。结果SurvivinASODN可转染重组腺病毒感染的细胞,并且survivinASODN的转染率及重组腺病毒的感染率均不受影响,CDglyTK可在两种细胞中高表达,survivinASODN可明显降低survivin蛋白表达。单一survivinASODN基因转染MCF-7和ECV304细胞后,细胞存活率为56．4％±3．8％和55．9％±3．6％,与AdKDR—CDglyTK基因联用后,随着丙氧鸟苷（GCV）和5-氟胞嘧啶（5-FC）浓度的增加,细胞存活率迅速下降,两者联合作用与单一基因作用相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。但在GCV100μg／ml、5．FC2000μg／ml时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR—CDglyTK组,两者差异无统计学意义（P〉0．05）。SurvivinASODN和AdKDR—CDglyTK联合作用在GCV、5-FC浓度较低时表现为协同效应,并具有更明显的旁观者效应。结论KDR启动子调控的CDglyTK融合基因体系和survivinASODN基因联合应用对乳腺癌细胞及血管内皮细胞具有显著的特异性杀伤作用。     

c-myc靶向小干扰RNA诱导乳腺癌细胞凋亡的作用

目的构建小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外观察其诱导乳腺癌细胞凋亡效应。方法基因克隆技术构建人cmyc癌基因特异性siRNA表达载体,体外转染MCF7,48h后检测c-myc癌基因表达状况并观察MCF7凋亡诱导效应。结果(1)成功构建siRNA表体载体:pEGFP-C1/U61、pEGFP-C1/U62和pEGFP-C1/U63;(2)siRNA表达载体转染MCF748h后,pEGFP-C1/U62组显著抑制胞内c-myc表达(80%);(3)转染24h和48h后,pEGFP-C1/U62组凋亡率分别为11.01%和21.30%,明显高于对照组(P<0.01)。结论构建的cmyc靶向siRNA表达载体能显著下调cmyc在MCF7中的过表达,诱导乳腺癌细胞株MCF7凋亡。