罗汉果甜苷对肝星状细胞HSC-T6增殖及肝纤维化相关基因的影响

目的 研究罗汉果甜苷含药血清对大鼠肝星状细胞HSC-T6的毒性以及对细胞增殖与相关基因表达的影响,初步探讨其抗肝纤维化作用机制.方法 以罗汉果甜苷含药血清干预HSC-T6,乳酸脱氢酶(LDH)法检测罗汉果甜苷含药血清对HSC-T6的细胞毒性;MTT法检测其对HSC-T6生长的抑制作用;RT-PCR法检测HSC-T6中Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、转化生长因子-β1 (TGF-β1)及基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)mRNA表达.结果 罗汉果甜苷含药血清对HSC-T6无特异毒性,罗汉果甜苷含药血清体积分数为20％、10％时可显著抑制HSC-T6的增殖(P＜0.05、0.01),并对Col-Ⅰ、TGF-β1及TIMP-1mRNA表达均表现显著抑制作用(P＜0.05、0.01).结论 罗汉果甜苷含药血清对HSC-T6细胞无特异毒性,对HSC-T6细胞增殖、Col-Ⅰ有抑制作用,促进细胞外基质(ECM)降解,这可能是其抗肝纤维化的部分作用机制.     

夏枯草硫酸多糖对CCl4致大鼠肝纤维化及TGF-β1诱导的大鼠肝星状细胞活化的影响

目的:观察夏枯草硫酸多糖(PSSP)对四氯化碳(CCl4)所致的大鼠肝纤维化及转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导活化大鼠肝星状细胞-T6(HSC-T6)的影响,从而初步探讨PSSP抗纤维化的机制。方法:采用CCl4-橄榄油溶液腹腔注射诱导大鼠肝纤维化造模,随机分为5组,分别为正常组,模型组,秋水仙碱组(0.25 mg·kg-1),PSSP高剂量组(300 mg·kg-1)和PSSP低剂量组(100 mg·kg-1)。分别测定各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),层粘连蛋白(LN),透明质酸(HA),Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和Ⅳ胶原(C-Ⅳ)的含量;采用苏木素-伊红(HE)及天狼猩红染色观察大鼠肝组织病理学改变;体外培养HSC-T6细胞;采用细胞增殖与活性法(CCK-8)测定PSSP对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖的影响;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HSC-T6细胞中Ⅰ型胶原(Col-I),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白的表达。结果:与模型组比较,PSSP可明显降低大鼠ALT,AST,HA,LN,PC-Ⅲ和C-Ⅳ的含量,并减轻大鼠肝纤维化程度(P0.01);PSSP可抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖,减少HSC-T6细胞Col-I,α-SMA mRNA和蛋白的相对表达量(P0.01)。结论:PSSP具有很好的抗纤维化作用,其机制可能与抑制肝星状细胞活化及抑制胶原合成与沉积,减少细胞外基质(ECM)的生成并促进其降解有关。     

当归补血汤有效组分配伍对肝星状细胞Ⅲ型胶原分泌及转化生长因子β1受体的影响

目的观察当归补血汤有效组分及其配伍对大鼠肝星状细胞HSC-T6Ⅲ型胶原分泌和转化生长因子β1(TGF-β1)Ⅰ型和Ⅱ型受体表达的影响。方法当归的有效成分阿魏酸和黄芪的有效成分黄芪甲苷单独及联合处理HSC-T6细胞24 h,ELISA检测培养上清液中Ⅲ型胶原含量,Western blot检测HSC-T6细胞Ⅰ和Ⅱ型TGF-β受体蛋白表达,实时定量PCR检测HSC-T6细胞Ⅰ型TGF-β受体mRNA表达。结果阿魏酸显著抑制了HSC-T6细胞培养上清液中Ⅲ型胶原含量,下调了Ⅰ和Ⅱ型TGF-β受体蛋白表达和Ⅰ型TGF-β受体mRNA表达(均P0.05),黄芪甲苷对这些指标无显著性影响(均P0.05)。与阿魏酸单独处理组的作用效果比较,联合处理组无显著性提高(均P0.05)。结论当归补血汤的有效组分阿魏酸抑制了肝星状细胞Ⅲ型胶原分泌及TGF-β受体表达。     

垂盆草总黄酮通过TGF-β_1/Smad2/3通路干预肝星状细胞上皮间质转化的分子机制

目的:探讨垂盆草总黄酮对肝星状细胞(HSC-T6)增殖及上皮间质转化的影响及其作用机制。方法:将HSC-T6细胞分为空白对照组、水飞蓟素阳性对照组及垂盆草总黄酮低(1 mg/mL)、中(1.5 mg/mL)、高(2 mg/mL)浓度组。MTT法检测各组细胞增殖情况;观察细胞形态学变化;ELISA法检测细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量;Western blot检测各组细胞TGF-β_1、Smad2/3、E-cadherin、Vimentin蛋白表达;Real-time PCR检测E-cadherin、Vimentin、TGFβ_1、Smad2、Smad3 mRNA表达。结果:垂盆草总黄酮能显著抑制HSC-T6细胞增殖,明显改变细胞形态,降低肝星状细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量,上调E-cadherin蛋白及mRNA表达,下调Vimentin蛋白及mRNA表达,并能显著降低HSC-T6细胞中TGF-β_1、Smad2/3蛋白及mRNA表达(P0.05)。结论:垂盆草总黄酮能显著抑制肝星状细胞(HSC-T6)增殖及上皮间质转化,作用机制可能与其抑制TGF-β_1/Smad2/3信号通路的激活有关。     

瑶药厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位的体外筛选及化学成分研究

目的:体外筛选出厚叶南五味子逆转肝纤维化作用的最佳活性部位,并对其化学成分进行解析。方法:厚叶南五味子经天然药物化学方法提取得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水层共4个部位,采用CCK-8法检测不同溶剂提取物对大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖作用、ELISA法检测不同溶剂提取物对细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分的影响,从中筛选出逆转肝纤维化活性最佳的部位。Western blot检测最佳活性部位处理细胞后磷酸化c-jun氨基端激酶(P-JNK)和磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(P-p38)的含量;流式细胞术检测细胞凋亡率;采用气相-质谱(GC-MS)方法对该活性部位进行解析。结果:厚叶南五味子石油醚部位对HSC-T6细胞的增殖抑制作用最强,IC_(50)为35.73μg/mL;进一步筛选显示石油醚部位可显著降低细胞外基质成分Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的表达;厚叶南五味子石油醚部位作用后,HSC-T6细胞磷酸化JNK、p38蛋白表达较空白对照组显著降低(P0.01),细胞凋亡率显著升高(P0.05);从厚叶南五味子石油醚部位中分离出27个成分,并鉴定出其中20个成分,主要成分为石竹烯(25.329%)、δ-杜松烯(13.211%)和β-石竹烯(10.076%)。结论:厚叶南五味子石油醚部位具有较好的逆转肝纤维化活性,其作用机制与抑制磷酸化JNK、p38表达及诱导细胞凋亡有关,石竹烯、δ-杜松烯及β-石竹烯可能是其发挥逆转肝纤维化作用的物质基础。     

阿魏酸钠对乙醛诱导的肝星状细胞增殖、活化和胶原合成的影响

目的:研究阿魏酸钠(SF)对体外乙醛诱导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖、活化、胶原合成的影响及其作用机制。方法:体外培养HSC-T6细胞,建立乙醛诱导的HSC-T6增殖模型,设空白组、乙醛组、秋水仙碱组(2.5μmol·L~(-1))及SF组(1,10,25,50,100,200,400μmol·L~(-1)),通过细胞增殖和毒性检测(MTS)比色法检测细胞增殖,筛选合适的SF浓度。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测SF(400,200,100μmol·L~(-1))对乙醛诱导的HSC-T6细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测Ⅰ型,Ⅲ型胶原浓度,酸水解法检测羟脯氨酸(Hyp)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)检测转化生长因子-β_1(TGF-β_1),信号转导蛋白Smad2,Smad3,Smad4,Smad7,基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)基因mRNA表达变化。结果:与空白组比较,200μmol·L~(-1)的乙醛能显著诱导HSC-T6体外增殖(P0.01);与空白组比较,模型组HSC-T6增殖显著增加(P0.01),α-SMA和I型,Ⅲ型胶原和Hyp含量显著增加(P0.01),TGF-β_1,Smad2,Smad3,Smad4,Smad7 mRNA的表达显著上调(P0.01),MMP-1和TIMP-1 mRNA表达显著上调(P0.01)。与模型组比较,400,200,100μmol·L~(-1)浓度的SF能明显抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖(P0.05,P0.01),显著降低α-SMA和I型,Ⅲ型胶原和Hyp含量(P0.01),下调TGF-β_1,Smad2,Smad3,Smad4基因mRNA的表达(P0.05,P0.01),上调Smad7基因mRNA表达(P0.01),并明显上调MMP-1 mRNA表达(P0.05,P0.01)和下调TIMP-1 mRNA表达(P0.01)。结论:SF能通过调控TGF-β_1/Smad和MMP-1/TIMP-1信号通路,抑制乙醛诱导的体外HSC-T6细胞的增殖,活化和胶原分泌。     

委陵菜酸对大鼠肝星状细胞的抑制作用及其机制分析

目的:研究委陵菜酸(tormentic acid,TA)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)活化增殖及转化生长因子-β(TGF-β)/Smads信号通路的影响,探讨其抗纤维化的作用机制。方法:采用细胞活性毒性检测法(CCK-8)观察TA(0,50,60,70,80,90,100μmol·L-1)作用于HSC-T6细胞24 h时的增殖情况,计算半数抑制率(IC50)并筛选出最适浓度。取对数生长期的HSC-T6细胞,分为正常组,刺激组,TA高、中、低剂量(40,20,10μmol·L-1)组。利用姬姆萨染色液检测TA对细胞集落形成;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化;免疫组化法检测Ⅲ型胶原蛋白(Col-Ⅲ)的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Smad4,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。结果:TA能够抑制HSC-T6细胞的增殖,呈剂量依赖性,IC50为81.71μmol·L-1;与正常组比较,TA呈剂量依赖性地抑制HSC-T6细胞集落的生成,同时,TA能明显地促进细胞凋亡和将细胞阻滞在G2期(P0.05,P0.01);此外,还能降低Col-Ⅲ,α-SMA,Smad4蛋白表达(P0.05)。结论:委陵菜酸对肝星状细胞有明显的抑制作用,其机制可能与促进细胞凋亡、阻滞细胞周期,以及与阻断TGF-β/Smads通路有关。     

苦杏仁苷对HSC-T6细胞分泌作用的影响

目的:观察苦杏仁苷对肝星状细胞(HSC)-T6细胞Ⅰ型胶原mRNA、Ⅲ型胶原mRNA活化,以及Ⅰ型胶原、透明质酸等分泌的影响。方法:将HSC-T6细胞系分为以下4组,每组细胞均置于6孔板中。4组分别为:正常组,苦杏仁苷高剂量(10-3 mol/L)组,苦杏仁苷中剂量(10-4 mol/L)组和苦杏仁苷低剂量(10-5 mol/L)组。RT-PCR检测Ⅰ型胶原mRNA、Ⅲ型胶原mRNA,酶联免疫法检测HSC-T6Ⅰ型胶原的分泌,放射免疫法检测透明质酸的含量。结果:各苦杏仁苷组对Ⅰ型胶原基因表达均有明显的抑制作用,与正常组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。以苦杏仁苷中剂量组最为明显,苦杏仁苷高剂量组次之,苦杏仁苷低剂量组再次之。提示苦杏仁苷对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原mRNA表达有明显的抑制作用,但这种抑制作用或并不与剂量成正比。各苦杏仁苷组对Ⅲ型胶原基因表达均有明显的抑制作用,与正常组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。以苦杏仁苷高、中剂量组明显,苦杏仁苷低剂量组次之。24 h时,Ⅰ型胶原的OD450值苦杏仁苷各组与正常组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。72 h时,苦杏仁苷各组与正常组比较,差异均有统计学意义(P0.05),但苦杏仁苷各组组间比较,差异无统计学意义(P0.05)。正常组透明质酸分泌曲线与苦杏仁苷低剂量组稍有重叠,位置较苦杏仁苷高、中剂量组分泌曲线高。但24 h、72 h时,4组透明质酸含量比较,差异均无统计学意义(P0.05)。96 h时,苦杏仁苷高、中剂量组比较,差异有统计学意义(P0.05),其余组间比较,差异仍无统计学意义(P0.05)。结论:苦杏仁苷对HSC-T6细胞活化后的细胞外基质(ECM)分泌功能有明显的抑制作用,此可能是其抗肝纤维化的主要机制之一。     

鳖甲提取物对抑制TGF-β诱导的大鼠肝星状细胞活化的影响

目的:研究鳖甲提取物相对分子质量6 k Da肽段(P6)对转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)诱导的大鼠肝星状细胞HSC-T6的活化增殖与肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)相关基因表达的影响,初步探究其抗肝纤维化的作用机制。方法:应用透析法得到P6;细胞增殖与活性检测(CCK8)法检测P6对HSC-T6细胞增殖的影响;实时荧光定量聚合酶反应(Real-time PCR)检测HSC-T6细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),I型胶原(collagen type I,Col I),基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)分析HSC-T6细胞内α-SMA与Col I蛋白的表达。结果:与空白组比较,P6对HSC-T6细胞存活率无明显影响,但却能显著抑制TGF-β诱导的HSC-T6细胞的增殖(P0.05)。与TGF-β组比较,P6各浓度均能显著降低HSC-T6细胞中α-SMA,Col I,TIMP-1 mRNA的表达,增加MMP-2 mRNA的表达(P0.05,P0.01),明显降低α-SMA与Col I蛋白的表达。结论:P6能抑制TGF-β诱导的HSC-T6细胞的活化增殖,减少细胞外基质(extracellular matrix,ECM)生成,促进其降解,发挥抗肝纤维化作用。     

白背叶根水提物对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠的保护作用研究

目的:研究白背叶根水提物对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠的保护作用及其作用机制。方法:用四氯化碳建立大鼠肝纤维化模型,成模大鼠分为模型组、秋水仙碱(0.2 mg/kg)阳性对照组及白背叶根水提物高(5 g/kg)、中(2.5 g/kg)、低(1.25 g/kg)剂量组,同批未给四氯化碳的大鼠作为正常对照组。给药8 w后,全自动生化分析仪检测大鼠血清ALT、AST、ALB、TP水平;HE和Masson胶原染色观察肝脏病理学改变;夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肝组织中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN含量;q-PCR法测定肝组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TNF-α mRNA的表达。结果:与模型组比较,白背叶水提物能显著降低血清ALT、AST水平,提高ALB、TP水平,明显减轻肝脏炎症损伤;显著降低肝组织中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN含量及Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TNF-α mRNA的表达。结论:白背叶根水提物对肝纤维化有保护作用,其机制可能与调节胶原合成异常、减轻机体炎症反应有关。     

抗纤复方影响大鼠肝贮脂细胞生成Ⅰ、Ⅲ型胶原的比较研究

用免疫细胞化学染色法观察抗纤复方药物血清对大鼠正常肝传代贮脂细胞和纤维肝原代贮脂细胞Ⅰ,Ⅲ型胶原表达的影响,并对Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达量进行比较分析。结果：传代贮脂细胞Ⅲ型胶原增加显著,而纤维肝贮脂细胞Ⅰ型胶原增加明显,抗纤复方能显著抑制贮脂细胞表达胶原,且对传代贮脂细胞Ⅲ型胶原和纤维肝原代贮脂细胞Ⅰ型胶原抑制作用更明显。     

生、醋莪术对大鼠免疫性肝纤维化及HSC-T6增殖和α-SMA,Procollagen Ⅰ表达的影响

比较生、醋莪术对猪血清所致大鼠免疫性肝纤维化及对活化的肝星状细胞(HSC-T6)增殖和α-SMA,ProcollagenⅠ表达的影响。采用腹腔注射猪血清0.5 mL/只,每周2次,共14周制备大鼠免疫性肝纤维化模型。观察生、醋莪术(0.95,1.90 g·kg~(-1))对大鼠血清ALT,AST,PC-Ⅲ,IV-C,LN,HA和肝组织HYP,MDA的表达水平;采用HE染色观察大鼠肝组织病理改变情况,Masson染色和天狼猩红染色观察大鼠肝组织中胶原表达情况;体外培养HSC-T6细胞,MTT法测定不同浓度生、醋莪术含药血清作用12,24,36,48 h对HSC-T6增殖的影响;采用Real-time PCR法检测各组α-SMA和ProcollagenⅠ表达情况。结果显示,给药生、醋莪术后,大鼠血清ALT,AST,PC-Ⅲ,IV-C,LN,HA表达水平均下降,与生莪术组相比,醋莪术组作用效果优于生莪术组;生、醋莪术含药血清各剂量组均能抑制HSC-T6的增殖,呈现一定的量效和时效关系;各给药组作用24 h后,HSCT6中α-SMA和ProcollagenⅠ表达水平降低,且醋莪术组降低更显著。生、醋莪术均能不同程度减轻肝纤维化,其抗肝纤维化机制可能与抑制HSC-T6增殖,减少细胞外基质的生成并促进其降解有关。     

消痰化瘀抗纤方药物血清对肝星状细胞增殖及胶原降解基因表达的影响

目的:观察消痰化瘀抗纤方(简称抗纤方)药物血清对肝星状细胞(HSC)增殖,Ⅰ型胶原含量及相关基因表达水平的影响,探讨该方抗肝纤维化的细胞分子学机制。方法:正常大鼠血清和药物血清干预HSC-T6细胞24h,MTT法检测抗纤方药物血清对HSC增殖,ELISA法测定细胞上清液Ⅰ型胶原含量变化,RT-PCR法检测细胞中金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的mRNA表达量。结果:抗纤方高(13.5倍)、中(4.5倍)、低(1.5倍)剂量组药物血清能明显抑制HSC增殖(P<0.05),且增殖抑制率与剂量呈正相关;对上清液中Ⅰ型胶原含量影响,随药物剂量增加明显降低(P<0.05);能明显抑制TIMP-1mRNA表达(P<0.05),促进MMP-1mRNA表达(P<0.05)。结论:抗纤方药物血清能抑制HSC增殖,减少Ⅰ型胶原含量,抑制TIMP-1表达,促进MMP-1表达,具有抗肝纤维化作用。     

一贯煎对大鼠肝星状细胞雌激素受体的影响

目的:观察一贯煎含药血清对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)2种亚型基因表达的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法:体外培养活化的大鼠HSC-T6细胞,分为空白组、雌二醇组和一贯煎高、中、低剂量组,共5组,空白组加入空白鼠血清,药物组加入相应的含药血清进行干预,培养24 h、48 h、72 h后,分别收集细胞和上清液,保存备用。MTT法检测细胞增殖情况;ELISA法检测细胞上清液中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量;Real time-PCR方法检测ERα、ERβ mRNA的表达。结果:一贯煎高剂量组表现对细胞增殖有明显的抑制作用,能够降低细胞上清液中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量,且作用较雌二醇显著(P0.05);一贯煎在提高HSC-T6细胞ERα、ERβ mRNA的表达方面作用较雌激素含药血清组弱,差异无统计学意义。结论:一贯煎能够抑制肝星状细胞活化,其机制可能是通过提高肝星状细胞的雌激素受体表达而起作用。     

壮药排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞胶原和细胞因子生成的影响

目的:研究排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)相关胶原和细胞因子的分泌影响。方法:体外培养HSC-T6细胞,将排钱草总生物碱(终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/m L)作用于细胞48h后,以MTT法检测细胞存活率,求出半数抑制浓度(IC50),根据IC50选取无细胞度浓度进一步研究;收集细胞上清液,用ELISA法分别检测Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(COL-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(COL-Ⅳ)、转化生长因子(TGF-β1)、血小板衍生因子(PDGF)的含量。结果:排钱草总生物碱能明显抑制HSC-T6细胞的增殖,其抑制作用与药物终浓度呈量效关系,求得IC50为337μg/m L;并显著降低HSC-T6细胞生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1,PDGF含量,与空白对照组比较,P0.05或P0.01。结论:排钱草总生物碱对HSC-T6细胞增殖有显著抑制作用,并能降低COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF的含量。     

肝乐颗粒对肝纤维化大鼠纤维化指标的影响

目的观察肝乐颗粒对肝纤维化大鼠纤维化指标的影响。方法将大鼠随机分为6组,除正常组外,其余各组采用CCl4诱导肝纤维化模型。于造模第7周起,给药组分别灌胃给予相应的受试药物,正常组和模型组灌胃生理盐水,疗程6周。实验结束后,放射免疫法测定血清透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)、四型胶原(CⅣ)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量;RT-PCR技术测定肝组织中Ⅰ型前胶原mRNA的表达。结果肝乐颗粒各剂量组能明显降低肝纤维化大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ和TGF-β1的含量,抑制肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ型前胶原mRNA的表达。结论肝乐颗粒能有效抑制CCl4诱导的肝纤维化大鼠纤维化指标的表达。     

扶肝化纤汤含药血清对TGF-β1诱导HSC-T6细胞增殖及TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的探讨扶肝化纤汤抗肝纤维化的可能作用机制。方法将40只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、扶肝化纤汤组,每组20只,扶肝化纤汤组以16. 78g/kg扶肝化纤汤灌胃,正常对照组予等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续7天,末次给药后于大鼠腹主动脉取血制备含药血清。培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,设置空白对照组及1%、2%、5%、8%、10%、15%、20%扶肝化纤汤含药血清组,检测不同浓度扶肝化纤汤含药血清对转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导的HSC-T6活化增殖的影响,确定15%扶肝化纤汤含药血清为最佳给药浓度。细胞实验分为空白对照组(HSC-T6细胞)、正常组(HSC-T6细胞+正常对照血清+TGF-β1)、中药组(HSC-T6细胞+15%扶肝化纤汤含药血清+TGF-β1);阻断组1 (HSC-T6细胞+SIS3)、阻断组2 (HSC-T6细胞+正常对照血清+TGF-β1+SIS3)及阻断组3 (HSC-T6细胞+15%扶肝化纤汤含药血清+TGF-β1+SIS3),培养24 h后比较各组HSC-T6细胞增殖抑制率及细胞中Smad 3、Smad 7、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原mRNA表达。结果与空白对照组比较,正常组、中药组、阻断组2、阻断组3 HSC-T6细胞增殖抑制率差异有统计学意义(P 0. 01)。与正常组比较,中药组、阻断组2、阻断组3HSC-T6细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P 0. 01)。与中药组比较,阻断组3抑制率明显升高(P 0. 01)。与空白对照组比较,中药组、阻断组2、阻断组3均可下调Smad 3、Ⅰ型胶原mRNA表达,上调Smad 7、α-SMA mRNA表达(P 0. 01);正常组可上调Smad 3、α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA表达,下调Smad 7mRNA表达(P 0. 01)。与正常组比较,中药组、阻断组2、阻断组3均可下调Smad 3、α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA表达,上调Smad 7 mRNA表达(P 0. 01)。与中药组比较,阻断组3可下调Smad 3、α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA表达,上调Smad 7 mRNA表达(P 0. 01)。结论扶肝化纤汤能够抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的活化增殖,其可能通过影响TGF-β1/Smad信号转导通路发挥抗肝纤维化作用。     

扶正通络消积三方对肺纤维化大鼠肺组织上皮间质转化的影响

目的:探讨扶正通络消积三方(养清抗纤方、保肺化纤方、金水缓纤方)对肺纤维化大鼠肺组织上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:180只雄性SPF级SD大鼠随机分为空白组、模型组、吡非尼酮组、养清抗纤组、保肺化纤组及金水缓纤组,每组30只,采用气管内滴注博来霉素(5mg/kg)的方法制备肺纤维化模型。以造模日为第0天,各组于造模后第1~13天、15~27天、29~41天采用上述药物灌胃,第14、28、42天每组取10只取材。采用Masson染色检测肺组织病理变化和评分;免疫组化测定肺组织Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)和Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)表达;分子生物学技术检测肺组织转化生长因子(TGF)-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cad)mRNA和蛋白表达。采用R值综合评价法评价扶正通络消积三方对肺纤维化大鼠EMT的影响。结果:在各个时间点,与空白组比较,模型组大鼠肺组织纤维化评分、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及TGF-β1、α-SMA mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.01),E-cad表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,各治疗组在各个时间点均不同程度改善,第14天,养清抗纤组肺纤维化评分降低(P<0.05),肺组织TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达较金水缓纤组和保肺化纤组显著降低(P<0.05,P<0.01);第28天,保肺化纤组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表达较吡菲尼酮组显著降低(P<0.05),α-SMA mRNA较养清抗纤组和金水缓纤组显著降低(P<0.05);第42天,金水缓纤组肺纤维化评分显著降低(P<0.05),α-SMA mRNA、TGF-β1蛋白表达较养清抗纤组显著降低(P<0.01)。结论:扶正通络消积三方在不同疾病发展阶段均能改善肺纤维化,保肺化纤方和金水缓纤方在中、晚期改善纤维化尤为显著。     

金匮肾气丸对腺嘌呤致肾间质纤维化大鼠的影响

目的:研究金匮肾气丸对腺嘌呤致大鼠肾间质纤维化的保护作用,并探讨其作用机制。方法:96只SD大鼠随机分成正常组、模型组、氯沙坦组(5 mg·kg-1)和金匮肾气丸高、中、低剂量组(2.4,1.2,0.6 g·kg-1),采用腺嘌呤灌胃(200 mg·kg~(-1)·d~(-1))诱导肾间质纤维化大鼠模型,2 h后灌胃给予相应药物,造模连续9周;给药连续16周。采用生化法测定血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肾脏组织病理改变情况;马松(Masson)染色观察大鼠肾脏胶原沉积情况;以实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)测定大鼠肾脏组组转化生长因子-β1(TGF-β1),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),钙黏蛋白(E-cadherin),Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ),Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ),Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ),基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-2(MMP-2),基质金属蛋白酶-9(MMP-9),基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1),基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)mRNA的表达;以免疫组化法测定大鼠肾脏TGF-β1,α-SMA和E-cadherin的表达。结果:与正常组比较,模型组中SCr和BUN显著升高(P0.01),给予金匮肾气丸干预后SCr和BUN水平降低(P0.05);HE染色和Masson染色结果显示,与正常组比较,模型组肾间质损伤严重且肾间质胶原物质大量沉积,给予金匮肾气丸干预后肾间质小管损伤减轻,肾间质胶原物质沉积减少;Real-time PCR结果显示,与正常组比较,模型组TGF-β1,α-SMA,Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,Col-Ⅳ,TIMP-1,TIMP-2mRNA表达上调(P0.05),模型组E-cadherin,MMP-1,MMP-2,MMP-9 mRNA表达下调(P0.05),给予金匮肾气丸干预后E-cadherin,MMP-1,MMP-2,MMP-9 mRNA的表达上调(P0.05),TGF-β1,α-SMA,Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,Col-Ⅳ,TIMP-1,TIMP-2mRNA的表达明显下调(P0.05);免疫组化结果显示,与正常组比较,模型组E-cadherin蛋白表达下调(P0.01),TGF-β1和α-SMA蛋白表达上调,金匮肾气丸干预后E-cadherin蛋白表达上调(P0.05),TGF-β1和α-SMA蛋白表达下调(P0.05)。结论:金匮肾气丸可有效改善肾间质纤维化并对肾脏有一定的保护作用,其改善肾间质纤维化的机制可能与降低基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1,TIMP-2)活性,TGF-β1蛋白表达,α-SMA蛋白表达,升高基质金属蛋白酶(MMP-1,MMP-2,MMP-9)活性,E-cadherin蛋白表达,从而减少胶原物质的沉积有关。     

柴竭抑肝纤对大鼠肝星状细胞增殖和TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:研究保肝护肝中药复方柴竭抑肝纤(CJYGX)通过肝星状细胞治疗肝纤维化的作用机制。方法:培养肝星状细胞T6(hepatic stellate cell T6,HSC-T6),设空白组、秋水仙碱1.0 mg·L~(-1)组和200,100,50,25,12.5,6.25 mg·L~(-1)质量CJYGX组,作用24 h后通过细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)检测HSC-T6细胞的增殖情况,筛选合适的CJYGX药物浓度;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测CJYGX(200,100,50 mg·L~(-1))作用HSC-T6细胞24 h后转化生长因子-β1(TGF-β1),信号转导蛋白Smad2,Smad3,Smad4,Smad7 mRNA表达变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CJYGX(200,100,50 mg·L~(-1))作用HSC-T6细胞24 h后TGF-β1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化。结果:(1)与空白组比较,200,100,50 mg·L~(-1)CJYGX对HSC-T6细胞具有显著的抑制增殖作用(P0.05)。(2)200,100,50 mg·L~(-1)CJYGX显著下调TGF-β1,Smad2,Smad3 mRNA的表达(P0.05);200,100 mg·L~(-1)CJYGX显著下调Smad4 mRNA表达,并显著上调Smad7 mRNA表达(P0.05)。(3)200,100 mg·L~(-1)CJYGX显著下调HSC-T6细胞TGF-β1和α-SMA蛋白表达(P0.05)。结论:CJYGX能抑制HSC-T6细胞的增殖,其作用机制与TGF-β1/Smad通路有关。