致敏树突状细胞抗乳腺癌作用的实验研究

目的 探讨负载肿瘤抗原DC诱导的CTLs对乳腺癌细胞的杀伤作用.方法 以负载肿瘤细胞抗原的DCs体外诱导CTLs,用ELISA法检测IFN-γ和IL-12的表达水平,用LDH法检测CTL对乳腺癌细胞的杀伤作用.结果 负载肿瘤抗原DC组IFN-γ和IL-12的浓度高于未致敏DC组、抗原组及单核细胞对照组(P＜0.05),且负载抗原DC组所刺激的CTLs的杀伤作用也强于未致敏DC组、抗原组及单个核细胞组(P＜0.01)及对照的HT-29组(P＜0.01).结论 采用乳腺癌细胞冻融抗原体外致敏DC,诱导产生肿瘤抗原特异性CTLs具有显著的抑瘤效应,实验证明致敏DC治疗乳腺癌是一种有效的方法 ,有望成为乳腺癌免疫治疗的新疗法.     

牛膝多糖刺激的DC联合CIK细胞对SW480的杀伤作用研究

从中药材牛膝中提取牛膝多糖(ABPS),用ABPS和/或SW480肿瘤抗原刺激的树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK)对结肠癌细胞株SW480进行杀伤试验,研究ABPS刺激的DC联合CIK细胞的抗肿瘤效果.分离人外周血单个核细胞培养成DC和CIK细胞.①把DC分成4个组合:单纯DC组作为对照组,ABPS刺激DC实验组(ABPS刺激的质量浓度为50 mg·L-1),SW480肿瘤抗原刺激DC实验组,ABPS(50 mg·L-1)和SW480肿瘤抗原联合刺激DC实验组,流式检测比较各组DC细胞表面分子CD80,CD86,CD11c,CD40,HLA-DR的阳性率的差异(每组均为6例样本).②以上述4个组合的DC与CIK细胞以1∶5比例混合共同作为效应细胞;以SW480肿瘤细胞株为靶细胞,设置效靶比分别为30∶1,20∶1及10∶1,进行细胞杀伤活性试验,用CCK-8试剂盒检测、比较各组细胞杀伤活性的差异.③ELISA检测并比较上述细胞杀伤活性试验中效靶比为30∶1的实验组各反应孔(3个复孔)上清液中细胞因子IL-2,IL-12p70,IL-17及TNF-α的分泌水平的差异.结果显示:①ABPS和SW480肿瘤抗原联合刺激的DC表面CD80,CD11c,HLA-DR的阳性率显著高于其他实验组的DC(P＜0.05);CD86,CD40的阳性率显著高于单纯DC实验组(P＜0.05),与其他实验组无显著差异.②在效靶比分别为30∶1,20∶1及10∶1细胞杀伤活性试验中,ABPS刺激的DC+ CIK细胞组、SW480肿瘤抗原刺激的DC+ CIK细胞组对SW480肿瘤细胞株的杀伤活性显著高于DC+ CIK细胞组(P＜0.05);ABPS+ SW480肿瘤抗原+DC+ CIK实验组对SW480肿瘤细胞株的杀伤活性均显著高于其他实验组(P＜0.05).③效靶比为30∶1的细胞杀伤活性试验中,ABPS+ SW480抗原+DC+ CIK细胞组上清液中IL-12p70,TNF-α的分泌水平高于其他实验组,差异具有统计学意义(P＜0.05);IL-2,IL-17的分泌水平各组之间无显著差异.说明ABPS刺激的DC+ CIK细胞对SW480肿瘤细胞株的杀伤活性显著提高,ABPS和SW480肿瘤抗原共同刺激DC能协同CIK提高对SW480肿瘤细胞株的杀伤活性.     

香菇多糖诱导CIK细胞对肺癌A549细胞杀伤作用的研究

目的:明确香菇多糖对CIK细胞(细胞因子诱导的杀伤细胞)体外增殖及抗肿瘤活性的影响,为临床应用香菇多糖提高CIK细胞过继免疫治疗疗效提供理论数据。方法:于CIK细胞培养第11天加入不同浓度香菇多糖,诱导培养72h后比较细胞密度,流式细胞仪检测CIK细胞CD3、CD56双阳率,CCK8法检测比较经不同浓度香菇多糖诱导后的CIK细胞对肺癌A549细胞的杀伤率。结果 :诱导72h后,加入5、25、50μg/m L香菇多糖的CIK细胞密度虽有上升但与未加入香菇多糖的空白对照组比较无统计学差异(P0.05)。经5μg/m L香菇多糖诱导的CIK细胞CD3、CD56双阳性率与空白对照组相当(P0.05);而经25、50及75μg/m L香菇多糖诱导的CIK细胞CD3、CD56双阳性率较空白对照组明显升高(P0.05),以50μg/m L香菇多糖诱导组的差异最为明显。经5μg/m L香菇多糖诱导的CIK细胞对肺癌A549细胞的杀伤率与空白对照组相当(P0.05);而经25、50及75μg/m L香菇多糖诱导的CIK细胞对肺癌细胞杀伤率明显高于空白对照组(P0.05),以50μg/m L香菇多糖诱导组对肺癌细胞的杀伤率最高。结论:香菇多糖对CIK细胞的体外增殖无促进作用,高浓度香菇多糖反而抑制CIK细胞增殖;适当浓度的香菇多糖处理CIK细胞能使CD3、CD56双阳性率上升,同时可提高CIK细胞对肺癌A549细胞株杀伤率。香菇多糖诱导CIK细胞的最适浓度在50μg/m L。     

六味地黄汤对细胞诱导的杀伤细胞体外扩增及抗骨肉瘤细胞的影响

目的:探讨六味地黄汤对不同人群来源的多种细胞诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)细胞增殖及其对骨肉瘤细胞毒活性的作用。方法:实验分为6组,通过向10名健康男性的外周血单个核细胞(PBMC)中分别加入在白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-1(IL-1)、抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)及不同浓度中药血清,诱导CIK细胞,检测其形态及表型,测定CIK细胞对骨肉瘤细胞的细胞毒性作用。结果:单纯中药含药血清对CIK无诱导作用,细胞因子联合含药血清培养的CIK增殖倍数明显高于无药血清和无血清培养(P<0.05),而在联合培养中中剂量中药的CIK增殖速度高于低和高剂量血清培养(P<0.05),且对CIK细胞CD3+CD5 6+表达最为稳定;各组对骨肉瘤细胞均有一定杀伤作用,其中联合培养含药血清中剂量培养CIK细胞对骨肉瘤细胞杀伤效果最好。结论:单纯六味地黄汤含药血清对CIK细胞基本无诱导作用,联合细胞因子有促进CIK细胞的体外扩增作用,对骨肉瘤细胞有较强的杀伤活性,但与浓度相关。     

甲胎蛋白表位肽锚定的DC–CIK对AFP+肝癌细胞抗肿瘤活性的影响

目的:探讨甲胎蛋白(AFP)表位肽锚定的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞共培养对AFP+的肝癌HepG2细胞杀伤活性的影响。方法:用AFP与Ii融合多肽锚定体外诱导的健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)产生的DC,用肿瘤坏死因子–α(TNF–α)诱导DC成熟后,与CIK细胞共培养9 d。采用流式细胞术检测共培养体系中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3+CD25+表型细胞比例,用乳酸脱氢酶(LDH)方法和酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测共培养细胞对肝癌细胞HepG2的杀伤作用以及培养上清液中白细胞介素(IL)–12和干扰素(IFN)–γ水平。结果:与未负载AFP–Ii锚定抗原的DC–CIK比较,AFP锚定抗原的DC–CIK体系中CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性分子表达增高,对HepG2细胞具有更强的杀伤活性,差异具有统计学意义(P 0.01),且其上清液中检测到的IL–12和IFN–γ较对照组高,差异具有统计学意义(P 0.01)。结论:AFP锚定抗原的DC细胞能显著加强CIK细胞对肝癌细胞系的抗肿瘤效应。     

黄芪多糖诱导成熟的树突状细胞肿瘤疫苗体外抗肿瘤作用的实验研究

目的探讨经黄芪多糖（astragalus polysacharin,APS）诱导成熟的树突状细胞（dendritic cell,DC）肿瘤疫苗体外抗肿瘤作用及其机制。方法分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,制备DC细胞,加入营养液体外诱导为未成熟的DC细胞,培养第5天,黄芪多糖组加入终浓度为100μg/mL的黄芪多糖,细胞因子组加入终浓度为20 ng/mL重组人肿瘤坏死因子（rhTNF）-α诱导DC成熟,观察树突状细胞形态及表型变化;成熟DC以SGC-7901肿瘤抗原致敏,与同种异体T细胞共培养,采用MTT法检测T淋巴细胞增殖功能,E LISA法检测共培养上清IL-12、IFN-γ水平;经DC激活的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）细胞与SGC-7901肿瘤细胞共培养,采用LDH释放法检测CLT对靶细胞特异性杀伤能力。结果黄芪多糖诱导的DC经形态学观察和表型鉴定,符合成熟DC的特征。黄芪多糖诱导成熟的DC能刺激同种异体T淋巴细胞增殖,T细胞增殖指数随刺激细胞与效应细胞比值的增加而增加（P〈0.05）;DC与T细胞共培养上清IL-12、IFN-γ的水平显著增加且呈时间依赖性（P〈0.05）;经致敏DC激活的CTL能显著杀伤肿瘤细胞,随着效靶比的增加,杀伤作用增强。结论黄芪多糖可在体外诱导DC成熟,并促进其抗原递呈能力,有效活化CTL,增强机体抗肿瘤功能。     

桃仁蛋白对树突细胞抗原递呈功能的影响

目的:探讨桃仁蛋白(psp)对树突细胞抗原递呈功能的影响。方法:制备荷S180小鼠模型,psp组给以腹腔注射桃仁蛋白,并设空白对照组;分离小鼠骨髓细胞,经IL-4、GM-CSF诱导其DC成熟,并以冻融S180抗原预致敏;在含IL-2培养体系中加入小鼠脾细胞,观察负载S180抗原T细胞对S180杀伤作用。结果:psp组对S180杀伤作用明显优于空白对照组(效靶比为40∶1时,0.638±0.044vs0.743±0.060;效靶比为20∶1时,0.561±0.041vs0.668±0.074;效靶比为10∶1时,0.461±0.036vs0.586±0.054)。结论:桃仁蛋白能够增强小鼠DC抗原递呈功能。     

黄芪甲苷联合树突状细胞瘤苗抗胃癌免疫的体外实验研究

目的 通过体外实验观察中药单体黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AⅣ)联合树突状细胞(DC)瘤苗对机体免疫功能的调节作用.方法 外周血单个核细胞体外诱导、培养,负载胃痛SGC7901冻融抗原.制备DC瘤苗,分别观察AⅣ联合DC瘤苗、DC瘤苗、AⅣ淋巴细胞增殖情况及其激活的效应细胞在体外杀伤胃癌细胞的活性.结果 ...     

淫羊藿素对人卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制及促凋亡作用

基于PI3K/Akt信号通路,观察人卵巢癌SKOV3细胞在不同浓度淫羊藿素(icaritin)干预下的增殖与凋亡变化过程,探讨可能存在的分子机制。研究对象为人卵巢癌细胞SKOV3,设置空白对照组和淫羊藿素不同浓度组(5,10,20μmol·L^-1),药物干预48 h,采用cell counting kit-8(CCK-8)法检测淫羊藿素对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制效果;通过EdU试验检测SKOV3细胞增殖能力;采用Hoechst 33342荧光染色法观察各组SKOV3细胞凋亡形态变化,通过流式细胞术检测各组细胞周期分布状况和细胞凋亡率;实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR)法检测各组细胞中PTEN,PI3K,Akt基因的表达情况;Western blot法检测PTEN,PI3K,Akt,p-Akt蛋白的表达情况。结果显示,与空白对照组比较,各浓度淫羊藿素组SKOV3细胞增殖抑制率升高(P<0.05),Edu阳性细胞率均降低(P<0.05),SKOV3细胞均呈现凋亡形态学改变,SKOV3细胞凋亡率均显著上升(P<0.05),SKOV3细胞G0/G1期细胞比例均降低(P<0.05),S期细胞比例均升高(P<0.05),SKOV3细胞中PTEN的基因和蛋白表达升高,PI3K和Akt的基因表达下降,PI3K和p-Akt的蛋白表达下降(P<0.05)。结果表明,淫羊藿素可能通过调控PI3K/Akt信号通路,抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖、诱导细胞发生凋亡并影响细胞周期分布。     

姬松茸多糖对小鼠骨髓来源树突状细胞抗肿瘤作用的影响

目的:研究姬松茸多糖对小鼠骨髓来源树突状细胞抗肿瘤功能的影响,为临床应用提供理论依据。方法:体外培养小鼠骨髓来源DC,加入ABP溶液,流式细胞仪检测DC表面CD86和CD11a的表达,混合淋巴细胞反应检测ABP对DC抗原提呈能力的影响,MTT法检测ABP对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对H22肝癌细胞杀伤功能的影响。结果:中剂量ABP组(100μg/mL)DC表面CD86、CD11a表达上调;CTL对肿瘤细胞的杀伤率升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:适当浓度的ABP能促进DC分化成熟,增强DC的抗肿瘤作用。     

扶正消瘤颗粒对SKOV3荷瘤模型鼠的抑瘤作用及其对免疫功能的影响

目的:建立人卵巢癌SKOV3荷瘤鼠模型,通过检测扶正消瘤颗粒对SKOV3荷瘤鼠的抑瘤作用以及对免疫系统功能的影响,来研究该药对卵巢癌的抗肿瘤作用。方法:人卵巢癌SKOV3细胞皮下接种于40只小鼠背部,3周后成荷瘤鼠模型。分组给药,各组分别灌胃给药(ig)0.25mL连续10天。用碳粒廓清法检测扶正消瘤颗粒对动物模型网织内皮细胞系统的影响, 并用流式细胞仪检测其对模型鼠NK细胞活性的影响。结果:(1)肿瘤细胞接种后1周即可触及肿瘤结节,3周后瘤体积达(107.7±20.1)mm3,给药后扶正消瘤颗粒3个剂量组的抑瘤率均明显高于模型组(P<0.01);(2)给药10天后3个剂量组K值均有非常明显性提高,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01);(3)流式细胞仪检测可见,NK细胞的标志分子在模型组明显低于空白对照组(P<0.05),中剂量和大剂量组各标志均显著高于模型组(分别为P<0.05和P<0.01)。结论:扶正消瘤颗粒对人卵巢癌SKOV3荷瘤鼠模型具有抑瘤作用,并可提高网织内皮细胞系统和NK细胞系统的活性。     

增免抑瘤颗粒剂干预卵巢癌大剂量化疗后免疫及骨髓抑制的实验研究

目的探讨增免抑瘤颗粒剂对卵巢癌SKOV3荷瘤小鼠顺铂（DDP）化疗后免疫及骨髓抑制的改善情况。方法建立卵巢癌SKOV3荷瘤小鼠模型,测定小鼠单次腹腔注射DDP的LD50。取40只造模成功的荷瘤鼠,随机分为DDP组、ZMYL高、中、低剂量合并DDP组,每组10只,各组均予DDP LD50值单次腹腔注射。注射后次日开始灌胃给药,ZMYL高、中、低剂量组的给药剂量分别为24.0g/kg、12.0g/kg、6.0g/kg,DDP组灌以等量的0.9%NaC l溶液,共干预8天。观察荷瘤小鼠存活时间、存活率、脾脏指数及骨髓DNA含量、血常规等指标变化情况,应用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞仪测定外周血T淋巴细胞亚群比例。结果①DDP腹腔注射LD50为16.36 mg/kg,95%可信限为13.22mg/k-20.39 mg/kg。②各组生存时间以及存活率差异均无统计学意义（P〉0.05）。③与DDP组比较,各剂量ZMYL＋DDP组均可提高荷瘤小鼠脾脏指数,中高剂量组还可提高骨髓DNA含量,差异均有统计学意义（P〈0.05）。④与DDP组比较,各剂量ZMYL＋DDP组均可提高荷瘤小鼠外周血中白细胞数,差异均有统计学意义（P〈0.05）。⑤与DDP组比较,各剂量ZMYL＋DDP组的CD3、CD4、CD8及CD4/CD8差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 ZMYL对顺铂大剂量化疗引起的荷瘤小鼠外周血白细胞减少及骨髓DNA含量、脾脏指数的降低有明显的升高作用,能调节机体紊乱的免疫功能,改善骨髓抑制。     

百里醌抑制卵巢癌生长及其机制研究

目的研究百里醌对卵巢癌生长的影响及其作用机制。方法百里醌作用卵巢癌细胞株SKOV3后,CCK-8法检测细胞增殖;ELISA法检测细胞凋亡;荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western blotting检测胞核蛋白Nrf2、胞浆蛋白Keap1、Akt、p-Akt、NQO1、GCLC的表达;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中NQO1和GCLC mRNA水平。制备裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,观察百里醌对肿瘤生长的影响;免疫组化检测肿瘤组织Nrf2、NQO1和GCLC的阳性表达。结果与对照组比较,百里醌明显抑制SKOV3细胞生长(P0.05、0.01),并诱导细胞凋亡(P0.01);升高细胞内ROS水平(P0.05);下调胞核Nrf2蛋白及胞浆p-Akt蛋白表达(P0.05),上调Keap1蛋白表达(P0.001);下调NQO1、GCLC的mRNA和蛋白表达(P0.05、0.01)。百里醌抑制裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的生长(P0.01),降低肿瘤组织中Nrf2、NQO1、GCLC的阳性表达(P0.05、0.01)。结论百里醌抑制卵巢癌生长,其机制可能是抑制胞核Nrt2蛋白表达,促进癌细胞内ROS的产生,诱导细胞凋亡。     

蛇床子素对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

目的:探讨蛇床子素对卵巢癌SKOV3细胞增殖与凋亡的影响以及其潜在的机制。方法:不同浓度蛇床子素作用于卵巢癌SKOV3细胞,采用MTT法检测蛇床子素对细胞增殖的影响;Hoechst 33258染色和流式细胞术检测蛇床子素对细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot检测Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平。结果:蛇床子素明显抑制SKOV3细胞的增殖;蛇床子素干预后,有典型的凋亡小体形成,SKOV3细胞的凋亡率随着药物浓度的增加而增加,80mg/L处理组细胞的凋亡率达到(24.90±5.35)%;qRT-PCR和Western Blot结果显示各浓度蛇床子素对SKOV3细胞促凋亡因子Bax mRNA和蛋白水平表达均有上调作用,而抗凋亡因子Bcl-2mRNA和蛋白表达均下调。结论:蛇床子素能够抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与其下调抗凋亡因子Bcl-2和上调促凋亡因子Bax的表达有关。     

银杏内酯B下调切除修复交叉互补基因1表达及增加耐药卵巢癌细胞对顺铂敏感性体外研究

目的:研究银杏叶提取物银杏内酯B(GB)增加耐顺铂卵巢癌细胞株(SKOV3/DDP-luc)对顺铂(CDDP)敏感性的作用及相关机制。方法:分别以DMSO及25μmol/L的GB处理SKOV3/DDP-luc细胞3、7及14d,溴化噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞经不同浓度CDDP作用72h后的活性,并据此计算出各组细胞对CDDP的IC50;同时提取上述作用时间点各组细胞的总蛋白,Western Blot检测DNA损伤修复相关蛋白ERCC1的表达情况。结果:GB作用3、7、14d后,SKOV3/DDP-luc细胞对CDDP的IC50分别降为24.2(与对照组相比P=0.07)、18.2(与对照组相比P=0.001)、11.6μmol/L(与对照组相比P=0.0004);在上述处理过程中,肿瘤细胞中ERCC1的表达逐渐下降(P0.01)。结论:GB可显著增加耐药卵巢癌细胞株对CDDP的敏感性,这一作用通过下调肿瘤细胞中ERCC1蛋白的表达而实现,提示GB可能成为临床卵巢癌化疗过程中的一种辅助药物。     

罗勒多糖对人卵巢癌细胞SKOV3细胞骨架的影响

目的:观察罗勒多糖对人卵巢癌细胞SKOV3细胞骨架的影响,探讨罗勒多糖抗卵巢癌细胞侵袭转移的可能机制。方法:将卵巢癌SKOV3细胞分为4组,A组为不加罗勒多糖处理的空白对照组,B、C、D组分别用不同浓度罗勒多糖处理,以罗丹明-鬼笔环肽标记微丝,免疫荧光法标记微管,用荧光显微镜观察。结果:罗勒多糖作用的SKOV3细胞微丝重排、伪足减少、微管蛋白弥散分布、细胞骨架的网络结构发生改变;这一作用与剂量呈正相关。结论:罗勒多糖可能通过影响人卵巢癌SKOV3细胞微丝、微管来调节其运动性和侵袭力。     

莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞胀亡及Bcl-2表达的影响

目的观察莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞胀亡指数及Bcl-2表达的影响,探讨莪术油注射液致人卵巢癌SKOV3细胞胀亡的机制。方法以不同浓度莪术油注射液作用人卵巢癌SKOV3细胞后,通过荧光显微镜观察细胞核变化、透射电镜计算细胞胀亡指数、琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA断裂情况、免疫组化观察细胞Bcl-2基因的表达。结果人卵巢癌SKOV3细胞经莪术油注射液作用48 h后,荧光显微镜观察到胀亡细胞出现细胞肿胀,体积增大,胞膜面积缩小,核染色质分散扩大;细胞胀亡指数随浓度的增加而增大,呈量效关系;电泳观察DNA呈弥漫型;Bcl-2基因表达下调。结论莪术油注射液可使人卵巢癌SKOV3细胞随浓度的增加而胀亡指数增大,并可下调Bcl-2基因表达,提示下调Bcl-2基因表达可能是莪术油注射液致SKOV3细胞胀亡的作用机制之一。     

低氧环境下罗勒多糖对卵巢癌细胞生物学行为的影响

目的:观察不同氧环境下中药罗勒多糖对人卵巢癌细胞株SKOV3生物学行为的影响,探讨其抗卵巢癌作用的可能机制。方法:罗勒多糖分别在常氧(21%O2、5%CO2)和乏氧(1%O2、5%CO2和94%N2)环境中作用于人卵巢癌细胞株SKOV3,形态学观察不同氧环境下各组细胞形态差异;细胞凋亡-Hoechst33258染色检测药物对人卵巢癌细胞凋亡情况的影响;MTT法检测各组细胞增殖能力的变化。结果:与对照组相比,乏氧环境下罗勒多糖能够促进人卵巢癌细胞株SKOV3的凋亡,抑制SKOV3细胞增殖,而常氧环境下罗勒多糖作用相反。结论:罗勒多糖在常氧及乏氧环境下对人卵巢癌细胞株SKOV3生物学行为的影响效应截然相反,提示抗肿瘤药物及生物疗法的体外机制研究设计应充分考虑氧环境的影响。