清络通痹颗粒含药血清对体外培养的成骨细胞和破骨细胞的影响

目的：观察清络通痹颗粒（QLTBG）含药血清对体外培养的成骨细胞增殖、碱性磷酸酶（AKP）活性及破骨细胞增殖的影响。方法：（1）取1d龄SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞，取5d龄SD大鼠四肢股骨、胫骨分离培养破骨细胞。（2）MTT法检测成骨细胞、破骨细胞增殖，偶联重氮盐法测定成骨细胞AKP活性。结果：QLT以7．2，14．4g／kg给药的大鼠含药血清对成骨细胞的增殖能力有明显增强作用，能明显增加AKP活性；QLT以3．6，7．2，14．4g／kg给药的大鼠含药血清对破骨细胞均有明显的抑制作用。结论：清络通痹颗粒含药血清可促进成骨细胞增殖、增强成骨细胞的AKP活性，抑制破骨细胞增殖。     

清络通痹方对佐剂性关节炎大鼠破骨细胞分化相关miRNA表达的影响

目的观察清络通痹方(Qingluo Tongbi Compound,QTC)对佐剂性关节炎(adjuvant induced arthritis,AIA)大鼠骨破坏相关miRNA表达的影响,探讨其治疗类风湿关节炎的机制。方法建立AIA大鼠滑膜成纤维细胞和单核细胞共培养诱生破骨样细胞模型,应用miRNA芯片的方法初步筛选破骨细胞分化后期miRNA的异常表达谱,并采用实时定量PCR(RT-PCR)对芯片结果进行验证。制备QTC含药血清和空白血清,将破骨细胞随机分为空白组、空白血清组及QTC组,采用RT-PCR检测QTC对差异表达miRNA的影响,并应用生物信息学软件对关键性miRNA进行分析。结果与单核细胞比较,破骨样细胞分化过程中存在明显差异表达的miRNAs共211个,其中表达上调88个,表达下调123个。RT-PCR验证结果与芯片检测结果表达趋势一致。RT-PCR结果显示,QTC干预后miR-140-5p表达明显上调,生物信息学分析结果显示miR-140-5p靶基因显著富集在肌动蛋白细胞骨架的调节、Ras信号通路、c AMP信号通路和Rap1信号通路等信号通路上。结论破骨样细胞分化后期存在多种miRNAs失调,QTC可能通过影响miR-140-5p的表达参与调控破骨细胞的分化。     

中药含药血清对体外培养鼠破骨细胞的影响

目的 :研究骨康抑制破骨细胞性骨吸收的机理。方法 :新鲜牛皮质骨经锯式切片机横切成 5 0um厚0 .5cm× 0 .5cm大小骨片 ,参照已建立的破骨细胞分离培养方法 ,从新生SD大鼠四肢长骨分离破骨细胞。原代破骨细胞培养 2 4小时后 ,加入含药血清培养 7天。结果 :发现培养的细胞具有典型破骨细胞的形态特点。结果可见破骨细胞能在骨片表面形成吸收陷窝 ,其形态多样 ,随时间延长 ,陷窝扩大 ,数量增多 ,而骨康含药血清可抑制骨陷窝数量。结论 :这说明含药血清可直接抑制破骨细胞的功能 ,骨康抑制骨吸收的功能可能与其直接抑制破骨细胞功能有关。     

温阳补肾方含药血清对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的:探讨温阳补肾方含药血清对破骨细胞骨吸收功能的影响。方法:体外诱导破骨前体细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞分化,分别用温阳补肾方低、中、高剂量组含药血清和0.9%氯化钠溶液血清干预,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)酶动力法测定各组TRACP活性,实时荧光定量PCR检测温阳补肾方对破骨细胞组织蛋白酶K(Cts K)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA水平。结果:与对照组比较,温阳补肾方含药血清可显著抑制破骨细胞TRACP活性(P<0.01),显著降低破骨细胞骨Cts K、MMP-9 mRNA的表达(P<0.01)。结论:温阳补肾方含药血清可抑制破骨细胞的骨吸收功能,中剂量组效果最佳。     

健骨胶囊含药血清对体外培养破骨细胞活性和骨吸收作用的影响

目的：观察健骨胶囊含药血清对体外培养新生大鼠破骨细胞活性与骨吸收的干预作用。方法：3天给药法制备健骨胶囊含药血清;机械分离培养法将新生大鼠四肢长骨干体外分离和培养破骨细胞,应用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色,阳性破骨细胞计数、骨片吸收陷窝形态分析,评价健骨胶囊对破骨细胞的活性与骨吸收的作用。结果：健骨胶囊能减少体外破骨细胞的TRAP阳性细胞数及骨片吸收陷窝面积。结论：健骨胶囊含药血清对破骨细胞的活性与骨吸收具有抑制作用,为健骨胶囊治疗原发性骨质疏松症提供血清药理学依据。     

壮骨镇痛胶囊含药血浆对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的 探讨壮骨镇痛胶囊含药血浆对破骨细胞( osteoclast,oc)骨吸收功能的影响.方法 取1日龄新生SD大鼠四肢骨髓分离培养OC,实验组加入2.5％含药血浆,对照组采用生理盐水对照血浆,运用重氮盐法检测含药血浆对OC分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)的影响;运用甲苯胺蓝染色法观察含药血浆对OC形成骨吸收陷窝的影响.结果 2.5％含药血浆共育组在48h、72h、96h对OC分泌TRAP的量都小于对照血浆组且呈明显的时效关系,与对照血浆组比较,其差异具有统计学意义(P＜0.01).2.5％含药血浆组在48h、72h、96h OC的存活数低于对照血浆组,且呈明显的时效关系,与对照血浆组比较,其差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 壮骨镇痛胶囊含药血浆能够明显抑制OC的活性.     

清络通痹颗粒对胶原关节炎大鼠滑膜炎的影响

目的：探讨清络通痹颗粒对胶原性关节炎大鼠滑膜细胞的影响及机理。方法：建立胶原性关节炎大鼠（CIA）模型，同时设正常对照组。给药自第7天始，持续21天。取滑膜，检测滑膜细胞增殖能力和滑膜细胞分泌TNF-α的量。结论：一定剂量的清络通痹颗粒可抑制CIA大鼠滑膜细胞的过度增生，这与其调节与滑膜增生相关的细胞因子有关。     

清络通痹颗粒的质量标准研究

目的：建立清络通痹颗粒(生地黄、三七、桑寄生、青风藤等)的质量控制方法。方法：采用薄层色谱法对清络通痹颗粒中的生地黄、三七、桑寄生进行定性鉴别；并采用HPLC法对该药中的青藤碱进行含量测定。结果：鉴别项下的阴性对照无干扰．专属性强；青藤碱在0．125～1．25μg范围内呈良好的线性关系，相关系数r=0．9999，平均回收率为100．9％，RSD=1．76％。结论：该法操作简便、结果准确，重现性好，可以控制清络通痹颗粒的质量。     

清络通痹颗粒给药的关节炎大鼠滑膜上清对软骨细胞的影响

类风湿关节炎（RA）是一种以关节肿胀、滑膜炎和关节破坏为特征的慢性炎症性疾病。关节骨质破坏是关节畸变的重要因素，阻止其发生和进展可直接改善患者的预后。在骨质破坏的过程中，软骨组织作为关节的保护性组织，其破坏较早发生，并表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），从而释放出大量一氧化氮（NO），对关节功能障碍有较关键的作用。前期我们已观察了清络通痹颗粒（QLT）对RA一系列病变的影响，这里我们着重讨论QLT对RA骨质破坏的作用。细胞因子在RA病变中具有重要的作用，     

清络通痹颗粒治疗类风湿性关节炎的分子作用机理研究

目的：探讨清络通痹颗粒治疗类风湿性关节炎的作用机理。方法：复制大鼠佐剂性关节炎模型，观察清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠IL－1、TNF－α、NO及组织病理学的影响。结果：清络通痹颗粒能明显降低佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞产生的IL－1水平，减少佐剂性关节炎大鼠血浆TNF－α、血清NO含量，抑制滑膜细胞分泌TNF－α，并能减轻关节组织和细胞超微结构的病理损伤。结论：上述作用是清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠减轻关节病变，阻止骨质破坏发生，发展的主要机制。     

清络通痹方与精简方的药效学比较

目的:探讨清络通痹方精简前后的药效学作用及影响机制。方法:DBA/1小鼠,复制胶原性关节炎(CIA)模型,随机分为空白组,模型组,清络通痹精简方组(8.4 g·kg-1),清络通痹原方组(13 g·kg-1)及雷公藤多苷片组(9 mg·kg-1),观察一般情况及关节肿胀,ig给药4周后,检测血清中白介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),抗Ⅱ型胶原抗体(抗CⅡ抗体)含量;踝关节HE染色观察病理学改变及病理评分。结果:与正常组比较,模型组小鼠关节肿胀明显,关节炎评分,TNF-α,IL-1β和抗CⅡ抗体水平明显升高(P0.01);与模型组比较,清络通痹精简方及原方、雷公藤多苷均能明显抑制小鼠足肿胀,降低关节炎评分,降低血清中TNF-α,IL-1β和抗CⅡ抗体水平(P0.01,P0.05);病理学检查提示可减轻关节病理损伤,关节总病理评分降低(P0.01)。结论:清络通痹精简方将不同性味、不同功效药物合理配伍,治疗效果和作用机制与原方相似。     

清络通痹颗粒对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞增殖及RANKL表达的影响

目的 观察清络通痹颗粒(QLT)含药血清对类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖及核因子κB受体活化子配体(RANKL)表达的影响.方法 取3～5代FLS,MTT比色法检测含药血清对FLS增殖的影响,RTPCR检测含药血清对FLS RANKL表达的影响.结果 QLT大剂量含药血清作用72 h,RA患者FLS增殖受到抑制,对RANKL表达有抑制作用.结论 QLT大剂量含药血清可抑制RA患者FLS的异常增殖,并下调RANKL的表达,这可能是清络通痹颗粒治疗RA的重要机制之一.     

无机陶瓷膜精制清络通痹水提液的污染机制研究

目的研究无机陶瓷膜滤过中药水提液的污染机制，为进行膜污染的防治研究和膜分离技术在中药领域的产业化进行探索。方法采用氧化铝陶瓷微滤膜对清络通痹水提液进行滤过澄清，考察了不同孔径的氧化铝膜对该体系的适用性，通过扫描电镜对膜面切片污染物进行分析，同时结合膜过程中滤过阻力的测定，分析污染物的存在形态、位置与形成规律。结果对于清络痹水提液，0．2μm孔径的氧化铝膜较为适用，有较高的稳定通量和成分保留率，同时污染较轻；3种孔径的氧化铝膜，膜自身阻力和孔堵塞阻力在总阻力中所占比例较小，浓差极化阻力和表面沉积阻力等可逆阻力为主要阻力。结论优化膜过程工艺参数，采用适当预处理方法和清洗方法可以减少膜的污染，使膜的性能有较大恢复。     

清络通痹汤药效物质“组合筛选”库的制备

目的尝试建立具有"化学多样性"的中药复方药效物质组合库。方法依据中药复方药效物质"组合筛选"思路与方法,以目前报道对类风湿性关节炎具有确切疗效的清络通痹汤为研究体系,以该组方的药味重组合分组并运用膜分离法和大孔吸附树脂分离法等多种分离技术代替组合化学合成路线的多样性,以多种工业化分离技术的产物为"基本构造单元"形成"构件"以创建组合库。结果在制备组合库时,不同构件中的药效物质的量不同。AB-8树脂对青藤碱有较好的吸附和解吸作用,同时对皂苷也有很好的精制作用;各构件中奇任醇的量因组合不同而有一定的差异;各构件中都有较高量的总黄酮。结论配伍组合的不同和分离技术(制药工艺)的不同都能引起化学成分种类与数量的变化,因此需要借助一定的药效学实验对其制备进行评价,并筛选出相关的活性"构件"。     

骨碎补提取液对体外分离破骨细胞性骨吸收的作用

目的 :研究骨碎补对体外分离破骨细胞性骨吸收的作用。方法 :体外分离出破骨细胞 ,与牛骨磨片共同培养 ,通过 Leica图像分析仪观察破骨细胞所形成骨吸收陷窝的数目与面积 ,反映破骨细胞性骨吸收情况。结果用 SPSS软件包分析。结果 :与空白血清组相比 ,2 0 %骨碎补提取液使骨磨片上形成的吸收陷窝数和面积从 ( 2 8.0 5± 2 .75 )个 /片和 ( 1 2 3 9.45± 5 2 3 .2 1 ) μm2减少到 ( 1 3 .2 0± 1 .2 6)个 /片和 ( 683 .1 7± 3 41 .3 8) μm2 ,空白血清组与 2 0 %骨碎补血清组比较差异具有显著性意义 ( P<0 .0 1 ) ,而 1 0 %低浓度骨碎补提取液对破骨细胞在骨磨片上形成的吸收陷窝数和面积从 ( 2 8.0 5± 2 .75 )个 /片和 ( 1 2 3 9.45± 5 2 3 .2 1 )μm2 减少到 ( 2 4.1 5±1 .1 2 )个 /片和 ( 82 3 .5 2± 5 2 7.1 8) μm2 ,二者比较无显著性意义 ( P>0 .0 5 )。结论 :骨碎补提取液对破骨细胞性骨吸收有抑制作用 ,但与浓度有关     

密骨片对破骨细胞基质金属蛋白酶-9mRNA表达的影响

目的:探讨白细胞介素-1(IL-1)诱导的破骨细胞性骨吸收过程中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA 的表达及补肾中药密骨片的调控作用。方法:从出生24 h 的乳鼠长骨中分离破骨细胞,从1月龄大鼠长骨中分离骨髓基质细胞,建立破骨细胞培养和骨髓基质细胞、破骨细胞培养系。在重组 IL-1α(rhIL-α)作用的同时,加入不同剂量的密骨片药液,分别与牛骨片共同培养20 h,计数骨吸收陷窝数及测算陷窝面积;并采用原位杂交技术研究破骨细胞 MMP-9 mRNA 的表达。结果:在基质细胞存在的条件下,IL-1可使骨吸收活性提高2～4倍,MMP-9 mRNA 呈高表达;而用密骨片药液处理后,MMP-9 mRNA 表达下降,作用呈量效关系。结论:密骨片可对抗 IL-1对基质细胞的影响,抑制破骨细胞重要的蛋白分解酶 MMP-9的表达而减少骨吸收。     

HPLC测定龙钻通痹颗粒剂中青藤碱和补骨脂素

目的:建立一种同时测定龙钻通痹颗粒剂中青藤碱和补骨脂素含量的高效液相色谱方法。方法:采用Phenomenex Gemini C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-0.1%三乙胺(47.5∶52.5)为流动相,流速1 m L·min~(-1),检测波长246 nm。结果:青藤碱在1.01~12.12μg呈良好的线性关系(r=0.999 7),补骨脂素在0.024 36~0.292 32μg呈良好的线性关系(r=0.999 8)。青藤碱和补骨脂素的平均回收率为100.49%和97.00%,RSD为3.0%和1.9%。结论:建立了同时测定龙钻通痹颗粒剂中青藤碱和补骨脂素含量的高效液相色谱方法,该方法快速,简便,结果准确,重复性好,可作为龙钻通痹颗粒剂的质量评价方法。     

Inhibitory Effects of French Pine Bark Extract,Pycnogenol®, on Alveolar Bone Resorption and on the Osteoclast Differentiation

Pycnogenol^® (PYC) is a standardized bark extract from French maritime pine (Pinus pinaster Aiton). We examined the inhibitory effects of PYC on alveolar bone resorption, which is a characteristic feature of periodontitis, induced by Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) and osteoclast differentiation. In rat periodontitis model, rats were divided into four groups: group A served as the non‐infected control, group B was infected orally with P. gingivalis ATCC 33277, group C was administered PYC in the diet (0.025%: w/w), and group D was infected with P. gingivalis and administered PYC. Administration of PYC along with P. gingivalis infection significantly reduced alveolar bone resorption. Treatment of P. gingivalis with 1 µg/ml PYC reduced the number of viable bacterial cells. Addition of PYC to epithelial cells inhibited adhesion and invasion by P. gingivalis. The effect of PYC on osteoclast formation was confirmed by tartrate‐resistant acid phosphatase staining. PYC treatment significantly inhibited osteoclast formation. Addition of PYC (1–100 µg/ml) to purified osteoclasts culture induced cell apoptosis. These results suggest that PYC may prevent alveolar bone resorption through its antibacterial activity against P. gingivalis and by suppressing osteoclastogenesis. Therefore, PYC may be useful as a therapeutic and preventative agent for bone diseases such as periodontitis. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.     

结合状态伊班膦酸盐对破骨细胞骨吸收作用的影响

 目的 观察伊班膦酸盐（ibandronate,Iba）与羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）结合后对破骨细胞骨吸收作用的影响。方法 将Iba与HA复合成伊班膦酸盐-羟基磷灰石（Iba-HA）作为实验组,未结合Iba的HA作为对照组。分离、培养、纯化大鼠破骨细胞,Giemsa染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色显示破骨细胞及其细胞核的形态和数目。用两组材料与破骨细胞复合培养,透射电镜观察细胞内结构变化,SNAFL染色测定破骨细胞内氢离子浓度,骨吸收陷窝面积测定并辅以上清液内胶原C端肽片段（CTx）的浓度测定观察破骨细胞骨吸收功能。结果 Gimsa染色标本可见多核的破骨细胞、细胞核染成蓝紫色,TRAP染色标本可见TRAP酶活性的部位被染成红色,分布于破骨细胞胞浆内。透射电镜观察发现,破骨细胞与Iba-HA复合培养后,较之与HA复合培养的破骨细胞生物活性下降。SNAFL染色显示Iba-HA组破骨细胞荧光强度小于HA组,统计学有差异（P<0.05）;骨吸收检测时面积显示,Iba-HA组小于HA组,统计学有差异（P<0.05）,上清液CTx浓度,Iba-HA组小于HA组,统计学有差异（P<0.05）。结论 与ＨＡ处于结合状态的Iba对破骨细胞的骨吸收作用仍有显著影响。     

薄层扫描法测定通痹胶囊中士的宁含量

目的：测定通痹胶囊中士的宁的含量，为其质量控制提供依据。方法：采用日本岛津CS-9000型双波长飞点扫描仪，检测波长为235nm。用薄层扫描法对通痹胶囊中士的宁进行含量测定。结果：在1．0～8．Oμg范围内与峰面积呈良好线性关系；加样回收率为99．43％％，尺SD为1．51％，相关系数为O．9997。结论：该方法操作简便，精密度好，结果准确可靠。