脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及其表达与纯化

目的构建大鼠全长脂联素(fAd)和球状域脂联素(gAd)重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行纯化和鉴定。方法将纯化的脂联素克隆产物与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌M15感受态细胞中,并用IPTG诱导表达,并通过亲和层析、去盐、去除内毒素等纯化蛋白。结果PCR获得长度分别为684bp(fAd)和402bp(gAd)的目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank中脂联素序列(序列号:NM_144744)完全一致;含重组脂联素质粒的大肠杆菌在30℃经0.5mmol.L-1IPTG诱导6h时,可溶性蛋白表达量最高。结论成功克隆大鼠脂联素基因,并在大肠杆菌中获得有效表达。     

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法:利用PCR技术扩增人脂联素基因完全编码序列,选用Gateway原核表达体系,经过BP反应、LR反应两步反应,将PCR产物克隆入pET-DEST42质粒,构建融合表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达脂联素融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,NDSB201高效复性后,使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞,RT-PCR法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖-6-磷酸酶转录水平的影响。结果:成功构建了表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,DNA序列测定结果与预期一致。IPTG诱导表达的融合蛋白经纯化后Western Blot鉴定具有人脂联素抗原性,并可使培养的肝细胞中葡萄糖-6-磷酸酶转录水平下降。结论:获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。     

人脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人脂联素（adiponectin）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出adiponectin蛋白进行鉴定。方法：从人皮下脂肪组织提取总RNA，确认其正确性后经RT-PCR扩增得到全长cDNA片段，此片段经纯化回收后克隆至pMD 18-T载体，经行DNA序列分析，进一步克隆构建到表达载体至pET-DEST42中，用IPTG在大肠杆菌中诱导表达。结果：含重组adiponeetin质粒的大肠杆菌经0．4mmol／L的IPTG诱导6h后有高表达。结论：adiponeetin基因的克隆构建和在大肠杆菌中的表达获得成功。     

绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的人脂联素（Adiponectin）真核表达质粒。方法：用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体pMD18—T／Adiponeetin为模板，结合已设计好的特异性引物。采用PCR方法克隆出Adiponectin目的片段，将该目的片段再连至真核表达载体pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO上，转化入TOP10感受态细胞中，通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO—Adiponectin。结果：PCR获得长度为736bp的目的片段，经pcDNA3．1／CT—GFP-TOPO真核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与genebank检索的人脂联素cDNA序列（Accession NM-004797）100％配。结论：绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

人TIMP-2基因的克隆及其原核表达

目的 构建人TIMP-2重组表达载体,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达.方法 提取人肝癌细胞(Hep G2)总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,插入克隆载体pMD18-T;酶切鉴定和测序后将TIMP-2导入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-TIMP-2.将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21 (DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达后用SDS-PAGE电泳检测并用western blot验证(蛋白质印迹法).结果 成功构建原核重组表达载体pGEX-TIMP-2,并在原核宿主BL21中大量表达融合蛋白GST-TIMP-2.结论 克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表达.     

新基因Betatrophin原核重组蛋白表达及纯化

目的 构建人Betatrophin基因(h-Betatrophin)原核表达载体,诱导Betatrophin重组蛋白表达及纯化,为制备Betatrophin蛋白多克隆抗体及其功能研究打下基础.方法 体外克隆Betatrophin cDNA序列,酶切后连接到PET32 a(+)原核表达载体上,构建重组载体h-Betatrophin-PET 32 a,然后转入大肠杆菌BL 21(DE 3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色及Western blotting检测蛋白表达情况,然后用Ni-NTA His·Bind(R)Resin纯化目的蛋白.结果 成功构建Betatrophin基因原核表达载体,诱导表达Betatrophin重组蛋白表观分子量正确,经纯化后可以得到纯度较高的Betatrophin重组蛋白.结论 重组载体h-Betatrophin-PET 32 a转入大肠杆菌BL 21后通过诱导及纯化可获取到纯度很高的Betatrophin重组蛋白,为后期研究Betatrophin基因功能奠定基础.     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

TAT-BDNF载体构建及融合蛋白表达

目的构建重组表达载体TAT-BDNF,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白,为研究TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。方法经RT-PCR获得编码人BDNF的全基因序列,连接到原核表达载体pTAT上,得到重组表达载体pTAT-BDNF,转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-BDNF融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了TAT-BDNF融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白。结论为进一步研究TAT蛋白转导作用奠定了基础。     

超抗原VEGF-SEA融合基因的克隆与表达

目的:构建血管内皮生长因子-葡萄球菌肠毒素A(VEGF-SEA)基因的原核表达质粒,获得VEGF-SEA融合蛋白。方法:制备VEGF-SEA基因片段,插入pET40b构建重组质粒pET40b-VEGF-SEA,经序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达蛋白的相对分子质量及表达形式,并对产物采用His·Bind Buffer kit试剂盒纯化。结果:获得VEGF-SEA基因片段长1130bp,经序列分析与预期完全一致,其表达出目的蛋白的大小约为66.2ku,以包涵体形式表达,经纯化,纯度达到90%以上。结论:表达载体pET40b-VEGF-SEA构建成功,VEGF-SEA融合蛋白获得高效表达,本实验为进一步研究VEGF-SEA蛋白的活性及其功能,探讨超抗原抑制肿瘤生长作用奠定了基础。     

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的 利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin，并对其进行生物学活性鉴定。方法 采用RT—PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA，将其克隆入pGEM—T Easy克隆载体中；经全自动序列分析仪测序确证后，将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450—1，构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒；将该重组质粒转化入大肠杆菌TG1中进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定；表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果 成功获得549bp 人 endostastin基因，测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白，此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论 人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达，并具有抗血管生成活性，为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

Persephin基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :获取Persephin(PSP)基因并实现其高效表达。 方法 :利用PCR方法以染色体DNA为模板 ,扩增编码人PSP成熟蛋白的基因片段 ,将其克隆于 pUC19质粒 ,进行序列分析 ,将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA并进行表达。结果 :序列分析结果与文献报道一致 ,表达的hPSP占菌体总蛋白质 15 %左右。结论 :人PSP基因在大肠杆菌Top10中获得了高效、稳定表达 ,为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础。     

人肥大细胞羧肽酶分泌型真核表达载体的构建

目的:构建人肥大细胞羧肽酶(hMC-CP)分泌型真核表达载体pcDNA3.1/CP.方法:用免疫球蛋白k链的信号肽序列置换hMC-CP自身的信号肽序列,设计并合成引物,以hMC-CP基因为模板,扩增带有分泌信号肽的hMC-CP基因,DNA测序鉴定正确后,将PCR扩增产物定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1,通过酶切和DNA测序进行鉴定.结果:琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增出一条特异条带,酶切鉴定和序列测定结果表明大小为1269bp的DNA片段插入表达载体.结论:成功构建了hMC-CP分泌型真核表达载体,为进一步制备真核表达的重组hMC-CP奠定了基础.