RNAi沉默STAT3基因联合化疗对人喉鳞癌细胞增殖的影响

目的利用RNAi沉默STAT3基因联合化疗,探讨其对喉鳞癌细胞凋亡的影响。方法体外培养人喉鳞状细胞癌hep—2细胞株,重组质粒脂质体包裹转染Hep-2细胞,实验分为五组。MTT法检测不同实验组转染24h、48h及72h的细胞增殖情况。流式细胞技术检测不同实验组转染后的细胞周期变化情况,及不同实验组转染后p-STAT3及其靶基因产物CyclinD1的蛋白表达水平。结果 （1）STAT3-siRNA增强了DDP对Hep-2细胞的增殖抑制作用和对细胞周期的阻滞作用;（2）转染72h后,流式细胞仪检测结果显示,重组质粒转染＋化疗组的STAT3信号传导通路相关蛋白的表达受到明显的抑制。结论 RNAi沉默STAT3基因能够降低相关调控蛋白的表达,提高人喉鳞状细胞癌hep—2细胞株对化疗的敏感性。     

肺腺癌A549细胞STAT3基因沉默对细胞周期分布和凋亡水平变化的影响

目的：研究沉默STAT3基因表达前后肺腺癌A549细胞的细胞周期分布状况和细胞凋亡水平变化及其意义。方法：利用流式细胞仪（FCM）检测RNA干扰（RNAi）技术沉默STAT3基因表达前后肺腺癌A549细胞的细胞周期状况和细胞凋亡水平变化。结果：STAT3沉默后,肺腺癌A549细胞大量处于G0／G1期（P〈0．05）,而S、G2／M期的细胞相对减少（P〈0．05）;并且细胞凋亡明显增多,前48h增长明显（R0．05）,48h后增长趋于平稳（P〉0．05）,但仍能较长时间维持较高水平。结论：STAT3siRNA能阻断A549细胞的细胞周期,使细胞周期停留在G0／G1期,不能进入S期,不能完成DNA的合成,无法进入M期,未完成细胞的分裂,并能诱导肺腺癌A549细胞的凋亡,提示STAT3的表达与A549细胞的细胞周期和凋亡密切相关。     

cyclin E基因siRNA抑制K562细胞生长的研究

目的 应用RNAi技术，研究cyclin E基因小干扰RNA(siRNA)对K562细胞生长的抑制作用。方法 针对cyclin E mRNA设计siRNA序列，经PCR方法体外扩增，得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物．以Lipofectamine^TM 42000脂质体法转染K562细胞，分别设置为干扰组、阴性对照组以及空白对照组，转染48h后进行细胞计数、RT-PCR及通过PI染色进行流式细胞仪检测，观察其干扰效果。结果 干扰组与阴性对照组和空白对照组相比，活细胞计数减少约80％，G1期细胞百分比增高30％，细胞基本停止增殖。干扰组cyclin E mRNA表达明显减弱，相对阴性对照组及空白对照组，干扰组mRNA表达下降70％。阴性对照组与空白对照组无显著性差异。结论 应用RNAi技术可以有效地干扰cyclin E基因的表达，并进一步抑制细胞的生长，但对于干扰的长期有效性尚无实验结论，需通过长效表达载体实验验证．     

STAT6基因沉默对结肠癌细胞增殖的影响

目的:研究细胞信号传导子和转录激活子6(STAT6)信号传导通路与结肠癌细胞增殖的关系及其可能机制。方法:构建STAT6特异的shRNA慢病毒表达载体,转染人结肠癌细胞HT-29,以阻断STAT6信号通路;用RT-PCR方法检测STAT6 mRNA表达和流式细胞术检测磷酸化STAT6蛋白(pSTAT6)表达来验证构建效果;流式细胞术分析细胞周期变化;MTT法检测肿瘤细胞增殖状况;RT-PCR和Western blot观察p21^(WAF1)、p27(WAF1)、p27^(KIP1)基因表达。结果:成功构建STAT6特异的shRNA慢病毒表达载体;STAT6基因沉默的结肠癌细胞中细胞增殖受到明显抑制(F=62.527,P<0.001);STAT6信号通路被阻断的结肠癌细胞中p21(KIP1)基因表达。结果:成功构建STAT6特异的shRNA慢病毒表达载体;STAT6基因沉默的结肠癌细胞中细胞增殖受到明显抑制(F=62.527,P<0.001);STAT6信号通路被阻断的结肠癌细胞中p21^(WAF1)、p27(WAF1)、p27^(KIP1)基因表达明显增多(P<0.01)。结论:STAT6信号传导通路能促进结肠癌细胞增殖,可能是通过调节p21(KIP1)基因表达明显增多(P<0.01)。结论:STAT6信号传导通路能促进结肠癌细胞增殖,可能是通过调节p21^(WAF1)、p27(WAF1)、p27^(KIP1)基因的表达起作用。     

cyclin E基因siRNA抑制K562细胞生长的研究

目的 应用RNAi技术,研究cyclinE基因小干扰RNA(siRNA)对K562细胞生长的抑制作用。方法 针对cyclinEmRNA设计siRNA序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物,以LipofectamineTM2000脂质体法转染K562细胞,分别设置为干扰组、阴性对照组以及空白对照组,转染48h后进行细胞计数、RT-PCR及通过PI染色进行流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果 干扰组与阴性对照组和空白对照组相比,活细胞计数减少约80%,G₁期细胞百分比增高30%,细胞基本停止增殖。干扰组cyclinEmRNA表达明显减弱,相对阴性对照组及空白对照组,干扰组mRNA表达下降70%。阴性对照组与空白对照组无显著性差异。结论 应用RNAi技术可以有效地干扰cyclinE基因的表达,并进一步抑制细胞的生长,但对于干扰的长期有效性尚无实验结论,需通过长效表达载体实验验证。     

RNAi沉默STAT3基因联合mTOR抑制剂rapamycin诱导BEL-7402肝癌细胞凋亡

目的：探讨PI3K/AKT/mTOR和JAK/STAT3 2条信号转导途径共同作用对肝癌细胞凋亡的影响,为肝癌基因治疗提供依据。方法：选取对数生长期BEL-7402细胞,随机分为对照组、mTOR抑制剂rapamycin(Rapa)组、阴性质粒组、阴性质粒+ Rapa组、STAT3-siRNA质粒组和STAT3-siRNA 质粒+Rapa组,应用LipofectamineTM 2000转染试剂将含有目的基因的质粒转染BEL-7402细胞,同时应用rapamycin,分别采用流式细胞术和Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡率和形态学的变化,JC-1 荧光染色观察线粒体膜电位(ΔΨm)变化,Western blotting法检测活性caspase-3蛋白表达水平。结果：STAT3-siRNA+Rapa组细胞凋亡率为60.22%±0.87%,明显高于其他各组(P<0.05),且细胞ΔΨm明显降低(27.28%±1.82%,P<0.05);Hoechst33258荧光染色检测,见STAT3-siRNA有大量细胞出现细胞核聚集、边缘化和核
碎裂等典型细胞凋亡形态;Western blotting检测,STAT3-siRNA+Rapa组活性caspase-3蛋白表达水平明显高于其他各组（P<0.05）。结论：RNAi沉默BEL-7402肝癌细胞STAT3基因联合rapamycin可促进BEL-7402肝癌细胞的凋亡,二者具有明显的协同作用。     

STAT3-siRNA对人结直肠癌细胞SW480的干涉作用

【目的】应用经小干扰RNA（shortinterfereRNA，smNA）表达盒介导的RNAj对结直肠癌细胞中的STAT3基因进行干涉作用以研究STAT3-siRNA对STAT3基因表达阳性的结直肠癌细胞凋亡的影响。【方法】用脂质体转染试剂将STAT3-siRNA表达盒（STAT3-siRNA expression cassettes，STAT3-SECs）体外转染至人结直肠癌SW480细胞及人成纤维细胞中。于48h后收集细胞，先经荧光染色方法观察细胞表象变化，再通过流式细胞仪检测人结直肠癌SW480细胞凋亡情况，最后分别提取细胞总RNA，用RT—PCR测定STAT3基因在mRNA水平的表达。【结果】SW480STAT3-SECs组的细胞可见凋亡小体，出现明显的凋亡现象，而其它实验组均未出现明显的凋亡现象。流式细胞术结果显示SW480STAT3-SECs组中凋亡细胞百分比由0．2％增加至26．0％；S期细胞比率由32．3％下降至9．2％。在mRNA水平上，SW480STAT3-SECs组细胞的STAT3基因表达减少了（62．16±12．50）％，显著低于SW480对照组（P〈0.01）。【结论】应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低人结直肠癌SW480细胞中STAT3的表达，诱导细胞的凋亡。     

RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的：研究pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,阐明RNA干涉技术在卵巢癌生物治疗领域中的作用。方法：应用人卵巢癌细胞系SKOV3对15例裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为3组：对照组（生理盐水）、空质粒对照组及重组质粒组（pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3）。应用电子穿孔仪将质粒转入裸鼠移植瘤内,观察重组质粒注射后第7、14、21和28天各组裸鼠皮下移植瘤体积变化。利用Western blotting检测重组质粒对STAT3蛋白表达的影响,采用HE及TUNEL染色方法观察肿瘤组织形态变化及细胞凋亡情况。结果：重组质粒瘤内注射对SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用,与2个对照组比较,重组质粒组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢（P<0.01）。重组质粒组瘤体内STAT3及CyclinD1、VEGF、survivin、c-myc蛋白表达明显低于2个对照组（P<0.01）。HE染色显示,重组质粒组肿瘤细胞出现大片细胞坏死,2个对照组肿瘤细胞以正常形态居多。TUNEL染色显示,重组质粒组癌组织有大量细胞凋亡,2个对照组几乎均为TUNEL阴性反应细胞。结论：pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长。     

RNAi重组体抑制白血病K562细胞系中NPM1基因的表达

目的 构建核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)特异性的RNAi真核表达载体,观察对白血病K562细胞系NPM1表达的抑制作用.方法 采用RT-PCR检测白血病细胞系(THP1和K562)和急性髓系白血病(AML)细胞NPM1 mRNA水平.设计合成2条针对NPM1基因并具有小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链.再克隆至载体pGenSil-1中构建含NPM1的RNAi重组体,经酶切及测序鉴定后通过脂质体转染K562细胞,同时设立pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组.采用RT-PCR检测各组转染细胞中NPM1的mRNA水平.结果 白血病细胞系和AML细胞均高表达NPM1 mRNA.针对人NPM1基因的RNAi重组体构建成功,并能够稳定转染K562细胞,导致白血病细胞NPM1 mRNA相对表达量下降64%,而pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组未能下调NPM1表达.结论 白血病细胞高表达NPM1基因,其mRNA表达水平能够被靶向NPM1的RNAi重组体特异性地下调.     

bcr-abl融合基因特异性siRNA对K562细胞生物学特性的影响

目的 应用特异性siRNA(小干涉RNA)抑制慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因表达,观察其对K562细胞生物学特性的影响。方法 以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21ntsiRNA,应用Western blot法检测bcr-abl融合基因的表达;^3H-TdR掺入法检测K562细胞的增殖活性;Annexin V-FITC／PI染色法检测K562细胞的存活状况;流式细胞仪法检测K562细胞周期变化以及联苯胺染色法检测K562细胞的分化状况;应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-xL／Bax的表达。结果 (1)RNA干涉组：K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降;(2)RNA干涉组的CPM值(每分钟脉冲数)在siRNA转染K562细胞第24h,48h,72h和96h均明显低于对照组(下降率依次为33．06％,52．25％,57．64％,70．87％),(3)RNA干涉组转染48h时有43．2％的K562细胞发生凋亡;(4)RNA干涉组：K562细胞凋亡相关蛋白Bcl-xL的表达水平下调,但Bax的表达无明显变化;(5)RNA干涉组：K562细胞联苯胺染色阳性比例增加,部分K562细胞向红系分化;(6)RNA干涉组K562细胞出现明显的G1期阻滞。结论 特异性siRNA分子可以显著抑制bcr-abl融合基因的表达,影响：K562细胞的基本生物学特性,最终导致K562细胞分化或凋亡。     

硫化砷诱导K562细胞凋亡

研究硫化砷（Ａｓ２Ｓ２）对Ｋ５６２细胞凋亡的诱导作用。采用Ｋ５６２细胞体外培养，应用流式细胞仪（ＦＣＭ）分析细胞周期，鉴定凋亡细胞，检测线粒体膜蛋白Ａｐｏ２．７的表达。结果显示：Ａｓ２Ｓ２能够诱导Ｋ５６２细胞凋亡，使细胞周期中的Ｓ期细胞减少，Ｇ２／Ｍ期细胞升高，提示：Ａｓ２Ｓ２具有促凋亡效应。     

氯化锂对K562白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的 :研究氯化锂 (LiCl)在体外对K5 6 2白血病细胞增殖及凋亡的影响。方法 :采用液体培养试验 ,四唑盐 (MTT)比色试验 ,集落培养试验为指标观察LiCl对K5 6 2细胞增殖的影响 ,采用DNA片段凝胶电泳及细胞形态学改变为指标检测细胞凋亡。结果 :①不同浓度的LiCl(10～ 5 0mmol/L)对K5 6 2细胞具有抑制增殖的作用 ,这种增殖抑制作用呈剂量依赖关系。②在LiCl(30mmol/L)作用下 ,K5 6 2细胞形态学上可见凋亡细胞 ,且DNA琼脂糖凝胶电泳谱可见“梯形带”(DNAladder)。结论 :LiCl能抑制K5 6 2白血病细胞增殖和诱导其凋亡。     

酪氨酸激酶抑制剂STI571对K562细胞生长和凋亡的影响

目的:探讨酪氨酸激酶(TPK)抑制剂STI571对K562细胞生长和凋亡的影响. 方法:取对数生长期K562细胞,分4组培养.Ⅰ组不加任何药物,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别加0.5 μmol/L、1 μmol/L和2 μmol/L 的STI571,继续培养5 d.每d行细胞计数,台盼蓝拒染法检测细胞活力,连测5 d.培养36 h时,取细胞,双缩脲法检测细胞蛋白含量,采取蛋白免疫印迹法进行Procaspase-3及Bcl-xL检测.结果:Ⅱ组、Ⅲ组细胞数低于同-时间段Ⅰ组细胞数(P＜0.05),但高于Ⅳ组细胞数(P＜0.05).与Ⅰ组比较,Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组Procaspase-3和Bcl-xL蛋白表达降低(P＜0.01);与Ⅱ组和Ⅲ组比,Ⅳ组2者表达量更低(P＜0.01).结论:STI571通过下调Bcl-xL,激活Procaspase-3,诱导K562细胞凋亡,从而抑制K562细胞的生长.     

RNA干扰survivin基因对K562细胞化疗敏感性的影响及机制

目的应用小分子干扰RNA（siRNA）技术抑制survivin基因的表达,观察其对K562细胞化疗敏感性的影响,为临床白血病治疗提供理论依据。方法实验分为RNA干扰组、脂质体对照组、空白对照组。转染48h后用RT—PCR法,免疫组化法分别检测survivin在mRNA及蛋白水平的表达;MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性;流式细胞仪检测细胞内阿霉素的药物浓度;免疫组化法检测K562细胞中3种耐药相关蛋白P—gP、TOPO-2、GST-π的表达。结果①RNA干扰组K562细胞的survivin基因表达水平明显下降;②RNA干扰组K562细胞对阿霉素敏感性增高;③RNA干扰组K562细胞中阿霉素浓度增高;④RNA干扰组K562细胞耐药蛋白GST-π表达水平下降,而P-gP,TOPO-2的表达与对照组比较无显著差异。结论特异性siRNA能够有效抑制survivin基因的表达,并可能通过降低耐药蛋白GST-百的表达增加K562细胞对阿霉素的敏感性。     

人参皂甙单体Rg3对人红白血病细胞株K562细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨人参皂甙单体Rg3对人红白血病细胞株K562细胞增殖及凋亡的影响.方法 将人红白血病细胞株K562细胞传代培养至对数生长期,分组加入不同浓度的人参皂甙单体Rg3,并设置空白对照组.用MTT比色法观察Rg3对体外培养的K562细胞生长的抑制作用;在光学显微镜下观察不同浓度人参皂甙单体Rg3对K562细胞的凋亡作用及计数凋亡率(AR);硝基四氮唑(nitroblue tetrazolium,NBT)还原能力测定试验检测分化指标;DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型的DNA梯形条带图谱.结果 MTT比色法测定显示,人参皂甙单体Rg3作用于K562细胞后可以抑制其增殖并诱导其凋亡,且呈剂量依赖性.结论 人参皂甙单体Rg3能抑制体外培养的K562细胞增殖并诱导其凋亡.     

槲皮素诱导人白血病细胞K562的凋亡

目的:研究槲皮素对人白血病细胞株K562增殖抑制和诱导凋亡作用. 方法:四氮甲唑蓝(MTT)观察细胞的生长状况,应用彗星分析法、TUNEL技术和流式细胞仪检测细胞凋亡. 结果:槲皮素在(1～8)×10-5 mol/L浓度范围内能明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性,8×10-5 mol/L槲皮素作用72 h的K562细胞株A值最低;彗星分析法显示经槲皮素作用的K562细胞出现长的彗尾条带;原位细胞凋亡可见细胞变小,核固缩为一个或多个染色质团块;流式细胞仪检测细胞凋亡主要发生在G1/S期. 结论:槲皮素在体外一定浓度范围内能抑制K562细胞增殖,诱导凋亡.     

大黄素诱导白血病K562细胞凋亡及对Caspase-3基因表达的影响

目的：探讨大黄素对人白血病K562细胞的增殖抑制与诱导凋亡作用．方法：采用四唑蓝比色试验（MTT）检测大黄素对K562细胞的增殖抑制作用;通过电子显微镜观察细胞的形态学变化;运用原位缺口末端标记技术检测大黄素对K562细胞的凋亡效应;采用流式细胞技术检测细胞周期变化与凋亡情况;通过比色法检测Caspase-3的相对活性,RT—PCR检测细胞内凋亡相关基因Caspase-3的转录水平．结果：大黄素能显著抑制K562细胞的增殖,作用24,72h后的半数抑制率浓度分别为80,40μmol／L;处理组细胞可见典型的凋亡形态学改变;TUNEL法检测到K562细胞在大黄素的诱导下出现凋亡;流式细胞仪结果分析发现,处理组的K562细胞被阻滞于G0／G1期,与对照组相比,凋亡率明显升高并呈现时间-剂量依赖性（P〈0．01）;大黄素可触发Caspase-3的活性增高（P〈0．01）,并呈现剂量依赖性;RT—PCR结果显示,Caspase-3 mRNA表达上调．结论：大黄素能有效地抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡,可能与Caspase-3活化有关．     

环孢菌素A对HL-60和K562细胞增殖的影响

目的 探讨环孢菌素A对HL-60、K562细胞增殖的影响。方法 应用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）观察环孢菌素A对HL-60、K562细胞增殖的抑制率，应用电镜进行凋亡的检测。结果 癌细胞在环孢菌素A作用下，细胞增殖被阻遏，并呈现时间剂量效应关系。同时发现环孢菌素A能诱导HL-60、K562细胞凋亡。结论 环孢菌素A可以通过诱导细胞凋亡而抑制HL-60和K562细胞增殖。