人胚肋软骨静止区细胞的体外培养及生物学特性研究

目的：研究体外培养的人胚肋软骨静止区细胞的生物学特性及分化规律，为组织工程生长板的研究提供种子细胞。方法：采用Ⅱ型胶原酶消化的方法获取人胚肋软骨静止区细胞．观察细胞形态学变化；测定细胞生长曲线；借助特殊染色、免疫荧光染色的方法了解糖胺聚糖、碱性磷酸酶、Ⅱ型胶原酶的合成情况。结果：贴壁后细胞呈多角形，从第6代开始绝大多数细胞转变为成纤维细胞状，细胞培养至第2代开始分泌大量Ⅱ型胶原。结论：体外单层培养的人胚肋软骨静止区细胞具有正常的生长增殖与分化能力，可分化至成熟期软骨细胞。     

大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究

目的:建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,并探讨获得的脂肪干细胞的部分生物学特性。方法:取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪,I型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞,接种至含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养并适时传代,每日在倒置显微镜下观察记录细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验。第3代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化,进行VonKossa染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化,进行油红O染色。结果:从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞,其在体外生长增殖迅速,呈成纤维样细胞生长。生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力最强,可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下,表现出成骨细胞特性,VonKossa染色出现矿化结节;在IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、吲哚美辛、胰岛素的诱导下,表现出脂肪细胞特性,油红O染色后发现胞浆内有脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后,其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论:成功建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛,具有多向分化能力,可以方便地保存,有望作为细胞治疗和组织工程的种子细胞。在分离大鼠的脂肪干细胞时,NH4Cl裂解红细胞这一步可以省略,地塞米松在成脂诱导过程中不是必需的。     

人胚肋软骨静止区细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:研究体外培养的人胚肋软骨静止区细胞的生物学特性及分化规律,为组织工程生长板的研究提供种子细胞.方法:采用Ⅱ型胶原酶消化的方法获取人胚肋软骨静止区细胞,观察细胞形态学变化;测定细胞生长曲线;借助特殊染色、免疫荧光染色的方法了解糖胺聚糖、碱性磷酸酶、Ⅱ型胶原酶的合成情况.结果:贴壁后细胞呈多角形,从第6代开始绝大多数细胞转变为成纤维细胞状,细胞培养至第2代开始分泌大量Ⅱ型胶原.结论:体外单层培养的人胚肋软骨静止区细胞具有正常的生长增殖与分化能力,可分化至成熟期软骨细胞.     

大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究

目的：建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法，并探讨获得的脂肪干细胞的部分生物学特性。方法：取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪，Ⅰ型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞，接种至含10％胎牛血清的DMEM培养液，培养并适时传代，每日在倒置显微镜下观察记录细胞形态和增殖特征，测定其生长曲线，进行冻存复苏实验。第3代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化，进行Von Kossa染色；使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化，进行油红O染色。结果：从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞，其在体外生长增殖迅速，呈成纤维样细胞生长。生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力最强，可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下，表现出成骨细胞特性，Von Kossa染色出现矿化结节；在IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）、吲哚美辛、胰岛素的诱导下，表现出脂肪细胞特性，油红O染色后发现胞浆内有脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后，其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论：成功建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法，获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛，具有多向分化能力，可以方便地保存，有望作为细胞治疗和组织工程的种子细胞。在分离大鼠的脂肪干细胞时，NH4Cl裂解红细胞这一步可以省略，地塞米松在成脂诱导过程中不是必需的。     

原代人胚成肌细胞体外培养增殖及分化特性

目的 分离培养人胚胎成肌细胞,观察原代细胞体外增殖与分化特性。方法 选择健康妇女损赠的胎儿骨骼肌标本,参照Blau等的胰蛋白酶与胶原酶混合、多步消化法分离成肌细胞。经美速贴壁法纯化后,在含20％胎牛血清的生长培养基中培养,以生长曲线评价及其增殖情况;含5％胎牛血清的融合培养基中培养,以磷酸肌酸激酶－MM型合成量及成肌细胞融合率评价及其分化能力。通过光镜、透射电镜、免疫细胞化学方法（小鼠抗人肌球蛋白单克隆抗体）鉴定所得细胞。结果 电镜下可见所得细胞含大量游离核糖体,肌球蛋白免疫细胞化学染色强阳性,能合成磷酸肌酸激酶,能融合形成肌小管,证明其为骨骼肌成肌细胞。在生长培养基中原代细胞倍增时间为4．8天,在融合培养基作用下,肌小管融合率及磷酸肌酸激酶合成量明显增加。结论 多步酶消化法与差速贴壁法能获得足量、纯净成肌细胞,所得细胞增殖能力强,能表达骨骼肌特异的收缩蛋白;融合培养基能促进其体外分化。     

侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞的体外培养及其生物学特性

目的建立人侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞分离培养的方法，探讨其生物学特性及其在垂体瘤侵袭性生长中的作用。方法差速贴壁筛选法分离培养侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞，进行原代及传代培养，倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性，免疫组化染色进行成纤维细胞鉴定，MTT法绘制传代细胞的生长曲线，电镜观察其超微结构。结果侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力。细胞胞体较大，形态不规则，细胞质中可见丰富的粗面内质网和核糖体，高尔基复合体发达，Ⅰ型胶原及波形蛋白表达率在95％以上。结论应用差速贴壁筛选法成功培养出侵袭垂体腺瘤成纤维细胞，其具有旺盛的增殖能力，可能在垂体瘤侵袭性生长过程中起重要作用。     

人增生性瘢痕成纤维细胞的间充质干细胞表型及多向分化潜能

目的 探讨人增生性瘢痕来源的成纤维细胞的细胞表型及分化潜能,以进一步研究其在增生性瘢痕形成中的作用.方法 从手术切除的增生性瘢痕中提取并分离培养成纤维细胞,以倒置显微镜观察其细胞形态及生长特点.待细胞培养传代至第3代,采用Vi-CELL细胞计数仪检测细胞生长情况,流式细胞仪检测成纤维细胞间充质干细胞表型标志CD73、CD44、CD105、CD90、CD34、CD45、CD14的表达情况;通过免疫细胞化学检测该细胞CK19、Oct 4、Vementin的表达情况及免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白;诱导分化检测细胞向成骨、成软骨和成脂细胞方向分化能力.结果 细胞原代培养初期贴壁散在分布,生长曲线显示细胞1 ～2d生长较慢,从3～5d左右细胞生长较快,6～7d细胞进入平台期;第2代第5天细胞多为长梭形,呈放射状、漩涡状排列.细胞流式结果显示细胞表型CD90、CD44、CD105、CD73呈高表达,CD45、CD34、CD14不表达;免疫细胞化学检测间充质细胞标记物Vementin、多能干细胞标志物Oct 4均呈阳性表达,免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白呈阳性表达,上皮细胞标志物CK19呈阴性表达,多向诱导分化实验该细胞可向成骨、成软骨和成脂细胞分化,具有多向分化潜能.结论 人增生性瘢痕来源成纤细胞具有间充质干细胞样生物学特性,该生物学特性可能在增生性瘢痕的形成以及创面修复中发挥至关重要的作用.     

不同代次小鼠脂肪干细胞增殖能力及体外成脂能力的实验研究

目的观察不同代次小鼠脂肪干细胞(mASCs)增殖能力及体外成脂能力,为组织工程种子细胞的合理选用提供实验依据。方法采用胶原酶消化小鼠腹股沟皮下脂肪组织,贴壁培养,体外传代扩增。实验采用原代(P0)、第2代(P2)和第5代(P5)细胞。观察不同代次mASCs的细胞形态及增殖能力;经高密度接种培养4周及成脂诱导2周,通过油红染色、RT-PCR检测,探讨其诱导成脂分化潜能及自发成脂能力。结果小鼠脂肪干细胞经传代后,外观主要呈长梭形及不规则形,不同代次的mASCs均具有很强的体外增殖能力;P0细胞具有极强的体外自发成脂能力,P2细胞自发成脂能力明显降低,至P5时基本没有体外自发成脂能力;P0、P2、P5细胞具有相似的诱导成脂分化潜能。结论随着培养代次的增加,mASCs自发成脂能力降低而诱导成脂分化潜能基本不变,扩增至第5代时仍维持了较强的增殖能力及良好的干细胞特性。在一定范围内mASCs体外传代扩增能明显减少其脂肪前体细胞的含量,有助于间充质干细胞纯化。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养诱导成骨能力的研究

目的：观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养生长时的生物学特性，及诱导分化为成骨细胞的能力。方法：取成年大鼠2只，处死后分离、培养骨髓基质细胞，第8天时添加矿化液诱导培养，细胞经传代后绘制生长曲线。应用倒置相差显微镜、透射电镜观察其生长特性，并进行甲苯胺蓝染色，Won Kossa染色，碱性磷酸酶染色。结果：培养的大鼠骨髓基质细胞呈成纤维细胞样生长，增殖活跃。经诱导后，细胞碱性磷酸酶活性高，连续培养30天，Von-KaSSR染色显示有局灶状钙盐沉积。结论：MSCs易于分离培养，体外扩增速度快，在矿化条件下，骨髓基质细胞在体外即具有很强的成骨能力，为研究其作为骨组织工程种子细胞植入体内成骨奠定基础。     

角质形成细胞、成纤维细胞与脂肪干细胞在创面愈合中的协同作用

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)因来源丰富,获取方式简单、且分离后的细胞容易增殖并在多代后仍保持其特性等优点,成为再生医学的研究热点。ADSCs可分化为多种参与创面愈合的细胞(角质形成细胞和成纤维细胞),减少炎症,并显示出促进血管形成的能力。角质形成细胞(keratinocytes, KC)是表皮的主要成分,而成纤维细胞是真皮的主要成分,它们与创面愈合密切相关。近年来研究者们发现,ADSCs不仅可以分化成为KC和成纤维细胞,并且可以促进这两种细胞的增殖和迁移,结合两者的优势开发了多种用以实现创面愈合的生物材料。综述了KC、成纤维细胞与ADSCs协同促进创面愈合的机制,并展望了两者与ADSCs结合在再生医学和皮肤替代物研发中的潜力。     

体外培养对骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的 :研究成人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下 ,传代次数与细胞凋亡的关系。方法 :采用An nexinV/PI双染色法 ,在流式细胞仪上检测不同传代数的成人骨髓间充质干细胞的凋亡情况。结果 :传代次数越多 ,骨髓间充质干细胞的凋亡率及死亡率越高 ,存活的正常细胞越少。结论 :第 4代以内的细胞增殖能力强 ,凋亡率低 ,适宜于组织工程研究     

兔胚胎关节软骨细胞体外培养的研究

目的 探讨兔胚胎软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 对孕4周兔胚胎关节软骨用酶消化法分离培养细胞。观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学改变。结果 兔胚胎软骨细胞可从胚胎软骨组织中消化分离出来，经鉴定具有软骨细胞的特性。原代兔胚软骨细胞存活率达97％以上，细胞贴壁率达80％以上，从原代到第4代都有高增殖力，到第8代时增殖力降低。到第12代时几乎丧失细胞增殖。结论 体外培养的胚胎软骨细胞前4代适合于作修复关节软骨缺损的组织工程细胞。     

骨形成蛋白对骨骼肌卫星细胞增殖与胶原蛋白合成的影响

目的　探讨骨形成蛋白 (BMP)对骨骼肌卫星细胞增殖与胶原蛋白合成的影响。　方法　体外获取与培养 Wistar大鼠骨骼肌卫星细胞 ,分别用含 BMP浓度为 0、50、1 0 0、50 0和 1 0 0 0 ng/ml的诱导培养基培养 72小时。通过 MTT法测定细胞的增殖 ,光镜观察细胞融合率 ,3 H-脯氨酸掺入法测定细胞胶原蛋白合成量。　结果　 BMP可促进骨骼肌卫星细胞的增殖 ,降低其细胞融合率 ,同时增加胶原蛋白的合成量。这种作用在 BMP浓度为 50 0 ng/ml即可表现出来 ,并随着浓度的增加越明显。　结论　 BMP可促进骨骼肌卫星细胞的增殖 ,抑制成肌表型促进向成骨细胞分化     

长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞生物学特性的影响

目的通过观察长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞(ADSCs)生物学特性的影响,鉴定ADSCs作为组织工程种子细胞的优越性。方法通过流式细胞技术观察长期体外培养对人ADSCs表面抗原表达和凋亡的影响。通过碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及RT-PCR检测长期体外培养对人ADSCs成骨分化潜能的影响。结果原代ADSCs表面高表达间充质干细胞表面标记物,而不表达血源性细胞表面标记物,标记物不随传代次数变化。早期ADSCs凋亡率为1%～2%,随传代次数增多凋亡率逐渐增加．但幅度不大。碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色和RT-PCR检测显示ADSCs传至第8代时仍能保持成骨分化潜能。结论ADSCs生物学特性稳定,是较为理想的组织工程及再生医学研究的种子细胞。     

Interstitial fluids associated with wound repair support proliferation but not differentiation of neonatal rat myoblasts in vitro.

The ability of wound fluids to support events required for skeletal muscle regeneration was examined. Wound fluids were obtained from polyvinyl alcohol sponges 1, 3, 5, 10, and 15 days after implantation. Neonatal rat L8 myoblasts were used to test the ability of early wound fluids to promote myoblast proliferation and late wound fluids to promote myoblast differentiation-two characteristics deemed critical for effective skeletal muscle regeneration. Early wound fluids (1- and 3-day) stimulated DNA replication by myoblasts, as judged by tritiated thymidine uptake, up to ninefold (p < 0.05). Later wound fluids (5-, 10-, and 15-day) displayed decreasing ability to stimulate proliferation, with 15-day wound fluid failing to significantly stimulate proliferation. In contrast, myoblast differentiation, as judged by myotube fusion and creatine kinase activity, was progressively reduced by wound fluids of increasing age. In fact, late wound fluids (5, 10, and 15 days) reduced myotube fusion by 88% to 100% and depressed creatine kinase activity by 60% to 75% (p < 0.05). Thus, wound fluids from a repair environment appear to support myoblast proliferation early but suppress myoblast differentiation later. These characteristics suggest that the wound repair environment cannot fully support skeletal muscle regeneration.     

不同代数软骨细胞及其在支架上的生物学特性

目的 观察不同代数软骨细胞及其在支架上的生物学特性，为软骨组织工程提供理想的种子细胞，方法 将2周齿的新西兰大白兔软骨细胞置盖玻片上进行原代和传代培养，同时，把相应代数的软骨细胞种植于明胶海绵上，应用倒置显微镜和电镜观察不同代数细胞形态学变化和增殖能力。以及不同代数软骨细胞种植于支架后的生长和黏附情况，应用HE染色鉴别及免疫组化观察Ⅱ型胶原的分泌情况。结果 （1）软骨细胞在体外单层培养，传5代后细胞形态由多角形变成梭形，逐渐丧失表型。（2）第4代软骨细胞在单层培养时，增殖能力最强，分泌功能旺盛。（3）传代细胞贴壁时间短于原代。（4）第4代软骨细胞种植于支架上形成软骨细胞-支架复合体所需的时间最短，软骨细胞于海绵支架上的黏附最紧密。结论 软骨细胞在体外培养第4代左右可以作为组织工程的最佳种子细胞，其形成的软骨细胞-支架复合体的质量最佳，时间最短。     

Differential effect of BMP4 on NIH/3T3 and C2C12 cells: implications for endochondral bone formation.

After intramuscular implantation, BMP4-expressing NIH/3T3 fibroblasts and BMP4-expressing C2C12 myoblasts can promote ectopic cartilage and bone formation. Fibroblasts tend to undergo chondrogenesis, whereas myoblasts primarily undergo osteogenesis. These results suggest that endochondral bone formation may involve different cell types, a finding that could have major implications for the tissue engineering of bone and cartilage. INTRODUCTION: The delivery of BMP4 through cell-based gene therapy can trigger ectopic endochondral bone formation in skeletal muscle. We hypothesized that, when stimulated with or transduced to express BMP4, different types of cells residing within skeletal muscle might participate in different stages of endochondral bone formation. MATERIALS AND METHODS: We compared the responses of a fibroblast cell line (NIH/3T3), a myoblast cell line (C2C12), primary fibroblasts, and primary myoblasts to BMP4 stimulation in vitro. We then transduced the four cell populations to express BMP4 and compared their ability to promote ectopic endochondral bone formation in skeletal muscle. RESULTS: Under the influence of BMP4 in vitro and in vivo, NIH/3T3 cells differentiated toward both chondrogenic and osteogenic lineages, whereas most C2C12 cells underwent primarily osteogenic differentiation. NIH/3T3 cells genetically modified to express BMP4 induced delayed but more robust cartilage formation than did genetically modified C2C12 cells, which promoted rapid ossification. These differences in terms of the timing and amount of cartilage and bone formation persisted even after we introduced a retrovirus encoding dominant negative Runx2 (DNRunx2) into the C2C12 cells, which interferes with the function of Runx2. Superior osteogenic potential was also displayed by the primary myoblasts in vitro and in vivo compared with the primary fibroblasts. The different proliferation abilities and differentiation potentials exhibited by these cells when influenced by BMP4 may at least partially explain the differing roles that BMP4-expressing myogenic cells and BMP4-expressing fibroblastic cells play in endochondral bone formation. CONCLUSIONS: Our findings suggest that the process of endochondral bone formation in skeletal muscle after delivery of BMP4 involves different cell types, including fibroblastic cells, which are more involved in the chondrogenic phases, and myoblastic cells, which are primarily involved in osteogenesis. These findings could have important implications for the development of tissue engineering applications focused on bone and cartilage repair.     

兔组织工程肌的构建与研究

目的　探讨用同种异体兔成肌细胞和小肠黏膜下层( small instestinel submucosa,SIS)复合,体外培养构建兔组织工程肌。　方法　取出生7d内幼兔四肢肌组织,经多步酶消化法与差速贴壁法获得足量、纯净成肌细胞,用Brd U标记,与SIS体外复合培养构建组织工程肌,植入15只异体兔体内修复腓肠肌1.5 cm×1.0 cm大小的骨骼肌缺损作为实验组;用单纯SIS修复对侧同样骨骼肌缺损作为对照组。术后4、6和8周各处死5只动物取材,行大体和组织学观察、局部细胞免疫定量分析和免疫组织化学检测。　结果　体外培养成肌细胞与SIS均复合良好,体内植入4周见材料与周围肌组织接合紧密,周围炎性反应明显;6周和8周材料开始部分降解,炎性反应逐渐减轻。局部细胞免疫定量分析显示实验组和对照组4、6周评分与8周评分比较有统计学意义( P<0 .0 5 )。实验组4、6和8周均可见材料周围新生肌组织形成,Brd U及肌球蛋白免疫组织化学染色阳性,对照组染色结果呈阴性。　结论　成肌细胞与SIS复合构建的组织工程肌,植入体内可存活、增殖并形成新的肌组织     

人端粒酶逆转录酶真核表达质粒转染人成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

目的　　分析人端粒酶逆转录酶 (h TERT)真核表达质粒 p GRN14 5转染人成纤维细胞的生物学特性。方法　体外分离培养小儿包皮成纤维细胞 ,脂质体法将构建的 p GRN14 5转染人成纤维细胞 ,经潮霉素 B筛选 ,扩增培养阳性克隆。 RT- PCR法、TRAP- PCR法分析细胞端粒酶活性。流式细胞术检测细胞增殖周期及细胞凋亡率 ,对转染后细胞行染色体核型分析及免疫组织化学法检测胶原分泌能力。结果　转染后培养的人成纤维细胞形态与转染前相比无明显改变 ,转染细胞稳定地表达端粒酶活性 ,流式细胞术分析转染前后成纤维细胞的增殖周期无明显改变 ,细胞凋亡率较转染前降低。经 p GRN14 5转染的人成纤维细胞保持正常的二倍体核型 ,具有正常分泌 、 型胶原的能力。结论　 p GRN14 5转染的人成纤维细胞稳定地表达端粒酶活性 ,细胞寿命明显延长。初步证实了用这种方法建立组织工程标准化种子细胞系的可行性