大鼠胰腺导管上皮细胞体外分离与定向分化

目的分离和纯化大鼠的胰腺导管上皮细胞，在体外培养并诱导其向胰岛细胞定向分化。方法采用胶原酶逆行灌注法消化、密度梯度离心结合不同细胞贴壁差异性分离和纯化胰腺导管上皮细胞；以角蛋白-19（CK-19）免疫细胞化学染色进行鉴定；用RMPI1640＋含体积分数为10％的胎牛血清（FBS）培养基培养促进胰导管上皮细胞增殖，1周后，更换无血清培养基DMEM／F12并加入角朊细胞生长因子等进一步促进其增殖，细胞达80％汇合时传代，加入高糖及尼克酰胺促进胰导管上皮细胞向胰岛细胞定向分化；对胰岛样结构行双硫腙染色。结果CK-19染色结果证实所获细胞绝大多为导管上皮细胞。体外培养中导管上皮细胞24h开始贴壁，14-21d达80％融合并形成细胞克隆，第28d胰岛细胞样结构形成，且被双硫腙染成猩红色。结论采用密度梯度离心结合差异贴壁法可获得纯化的大鼠胰腺导管上皮细胞，在体外培养与诱导分化条件下可生成胰岛样结构。     

三维及二维培养大鼠胰腺导管来源干细胞的体外对比实验研究

目的观察在不同培养模式下大鼠胰腺导管来源干细胞(PDSC)的生物学特性。方法以大鼠胰腺组织为材料,采用动力性三维培养及传统二维培养方法进行细胞培养,获得原代PDSC,并连续传代,纯化PDSC,比较动力性三维培养及传统二维培养细胞间连接及细胞凋亡周期的差异。结果动力性三维培养的大鼠PDSC在培养第2天即可沿三维支架贴壁生长,在第7天即可形成细胞团,并沿三维支架多向贴壁生长;二维培养的PDSC在培养第5天贴壁生长。三维培养与二维培养相比,二维培养的细胞间连接少见,三维培养的细胞连接结构丰富。三维培养与二维培养相比,三维培养的G1期细胞增多,G2期细胞相对减少(P<0.01),三维培养早期自发凋亡细胞比例相对减少(P<0.05),晚期自发凋亡与坏死细胞比例两种培养方式间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论动力性三维细胞培养较传统二维细胞培养,在细胞贴壁时间、细胞连接以及细胞凋亡方面具有明显的优势。     

大鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定

目的：分离培养大鼠胰腺星状细胞,为体外研究胰腺纤维化提供细胞模型。方法：采用酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离胰腺星状细胞,通过倒置显微镜观察细胞形态,油红O染色和免疫细胞化学染色desmin,α-SMA进行细胞鉴定,并绘制传代后细胞生长曲线。结果：原代培养的大鼠胰腺星状细胞呈星形或梭形生长;原代胰腺星状细胞油红O染色胞浆均可见红色密集脂滴,直至传代后消失;原代胰腺星状细胞培养48 h后,desmin表达开始减弱,α-SMA表达开始增强;传代后desmin基本不表达,α-SMA阳性表达100%;传代后第3 d-5 d的胰腺星状细胞处于快速增殖阶段。结论：酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离培养大鼠胰腺星状细胞纯度高,重复性好,可以满足体外研究的需要。     

大鼠MSCs体外分离培养及骨向分化的实验研究

目的:建立骨髓MSCs体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导,以证实其多向分化潜能,为骨髓MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法:用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对骨髓MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果:用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。结论:采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,并能够向成骨细胞分化。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养和分化的研究

目的探讨脊髓源性神经干细胞的培养方法和体外分化特性. 方法从孕龄15天的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清限定性培养基培养并进行干细胞体外分化,细胞免疫荧光化学方法鉴定分化结果. 结果胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,培养10天左右可获得干细胞球;用细胞免疫荧光化学法鉴定干细胞分化,可见其中含有神经元和星形胶质细胞. 结论无血清限定性培养基是脊髓源性神经干细胞的良好培养基;脊髓源性神经干细胞体外可诱导分化为神经元和神经胶质细胞.     

胰岛发育和胰腺干细胞研究进展

胰腺移植手术可使糖尿病患者得到治愈,但供体不足成为制约其开展的瓶颈.胰腺干细胞移植治疗糖尿病是极具潜力的治疗方案,有希望克服尸体胰岛移植供体不足和需免疫抑制治疗的缺陷.众多研究者尝试利用不同来源的干细胞分化或转分化形成胰岛或β细胞,并努力寻找胰腺干细胞的特异性标志以确证和分离纯化胰腺干细胞.本文综述了近年胰岛发育和胰腺干细胞研究领域的一些研究进展.     

成人胰腺干细胞分离及转分化为胰岛的研究

目的 通过对成人胰腺干细胞分离和转分化为胰岛过程的研究以便更进一步了解及改进胰腺干细胞分离、培养、鉴定方法。方法 成人胰腺组织以胶原酶消化，密度梯度离心法获得纯化的胰腺外分泌细胞、导管上皮细胞和胰岛。导管上皮细胞在体外共培养27d，观察细胞形态学变化及干细胞特异性转录基因PDX—1，CK—19蛋白等的表达。结果 上述方法可获得大量胰腺导管上皮细胞。体外培养第1天即可见PDX—1，CK—19阳性细胞，胰腺导管上皮细胞迅速分裂增殖并转变为有分化能力的干细胞继而转分化为三维结构的胰岛细胞。培养27d后，平均每克胰腺组织可生成760个胰岛。结论 用改进的方法可获得大量成人胰腺导管上皮细胞，并可在体外转分化为大量具有内分泌功能的胰岛，可能为克服胰岛移植的供体短缺提供一条新途径。     

胰腺干细胞和胰岛移植

胰岛移植是治疗糖尿病行之有效的方法，但是胰岛移植需要解决两大难题：首先，每位受体需要移植大约10万个胰岛，所以要有足够量的胰岛供体，而目前胰腺供体相当匮乏；其次是免疫排斥问题，当前所采用的免疫移植剂治疗都有严重的副作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化研究的体外实验

目的 分离培养较高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,检测其多向分化潜能.方法 采用密度梯度离心结合差速贴壁法分离培养大鼠BMSCs,观察细胞形态,检测表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90表达情况,及其成骨、成脂、成神经诱导后茜素红染色、油红O染色和NSE、GFAP免疫荧光染色情况.结果 细胞呈典型的成纤维细胞样形态,CD44和CD90呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达,细胞纯度＞98%.成骨、成脂、成神经诱导后,茜素红染色、油红O染色、NSE和GFAP免疫荧光均为阳性.结论 密度梯度离心结合差速贴壁法可分离、培养出高纯度的大鼠BMSCs,该细胞具有成脂、成骨、成神经多向分化潜能,是脊髓损伤修复的一种较理想的种子细胞.     

巢蛋白和神经元素3在人胚胎胰腺中的表达和分布

目的探讨胰腺干细胞标志巢蛋白（nestin）和神经元素3（Ngn3）在人胚胎胰腺组织中的表达及其与内分泌细胞、导管细胞和外分泌细胞标志的共表达情况。方法以因病理因素行药物引产的12周-14周前人胚胎胰腺14例为材料,应用免疫荧光染色和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测nestin和Ngn3的表达情况,免疫荧光染色检测胰腺内分泌标志胰岛素、胰高血糖素和外分泌标志CK-PAN和CK-19。结果nestin和Ngn3在12～14周人胚胎胰腺组织均广泛表达。nestin和Ng．3阳性细胞中均无胰岛素及胰高血糖素表达;在胰岛中未见到nestin与Ngn3共表达,但在导管中可见共表达。RT—PCR结果显示12～14周人胚胎胰腺中均有nestin和Ngn3的表达。结论Ngn3和nestin在人胚胎胰腺未分化细胞中表达,而具有分泌功能的内分泌细胞无表达。     

动力性三维细胞培养系统建立大鼠胰腺导管来源干细胞系的研究

目的 利用动力性三维细胞培养技术建立大鼠胰腺导管来源干细胞( PDSC)系.方法 以大鼠胰腺组织为材料,采用V型胶原酶原位消化分离大鼠胰腺组织,通过不连续密度梯度离心使胰腺导管细胞与胰岛细胞初步分离,采用动力性三维培养技术进行培养,获得原代PDSC,并进行扩增培养、连续传代和纯化,建立PDSC系.对原代分离的PDSC进行鉴定,包括形态学的鉴定及表达特性的鉴定.结果 通过胶原酶消化、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养,可分离培养出大鼠PDSC,并经过动力性三维培养,可以建立大鼠PDSC系.形态学方面,PDSC呈单个核;生长行为方面,PDSC在三维载体上沿纤维贴壁生长;表达特性方面,通过流式细胞仪分选结果显示,PDSC高表达CD29、CD73,CD90、CD105,不表达CD14、CD19、CD34、CD45,证实P DSC为间充质干细胞.结论 通过采用原位胶原酶消化法、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养系统,可分离培养出大鼠PDSC,成功建立PDSC细胞系.     

大鼠椎间盘巢源性干细胞的体外分离、培养和特性鉴定

目的:对大鼠椎间盘干细胞巢来源的干细胞(ISN-SCs)进行体外分离、培养和特性鉴定。方法:以10周龄雄性SD大鼠作为研究对象,按照解剖区域分离椎间盘干细胞巢组织(骺板外周软骨膜部分),用Ⅱ型胶原酶消化获取细胞后进行体外培养,选用第四代细胞进行干细胞相关特性的鉴定:采用流式细胞技术测定细胞周期;MTT法测定增殖曲线;流式细胞技术检测干细胞相关表型;q PCR检测干细胞相关基因的表达水平;细胞三系诱导分化培养后采用茜素红染色及钙钴染色检测成骨分化能力,阿利新蓝染色检测成软骨分化能力,油红O染色检测成脂肪分化能力,q PCR检测多向分化相关基因的表达水平。结果:大鼠ISN-SCs呈成纤维样细胞,多触角,具有贴壁能力,是一种慢周期细胞,高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD29、CD90、CD44,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子CD34、CD45、CD19、CD11b;成骨诱导分化后茜素红染色和钙钴染色均为阳性,成软骨分化后阿利新蓝染色阳性,成脂肪分化后油红O染色阳性,且各分化相关基因(成骨:Runx2、OPN、OCN;成软骨:SOX-9、COL2a1、ACAN;成脂肪:PPARγ、C/EBPα)表达水平较对照组显著增高,其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有相似的干细胞相关基因(NANOG、SOX-2、OCT-4)表达水平。结论:ISN-SCs具备干细胞的生物学特性,在体外经诱导后可以向软骨细胞及脂肪细胞转化,可为椎间盘的自体生物学修复研究提供良好的细胞来源。     

人脐血CD133+血管内皮祖细胞的培养、鉴定与分化研究

目的探讨从人脐血中分离、体外培养CD133^＋血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及其生长特性和鉴定。方法采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133^＋细胞,进行流式细胞仪检测纯度,予EBM-2培养液接种培养,观察其生长特性;利用Dil-LDL及FITC-Lectin摄取实验、细胞免疫组织化学等进行鉴定。结果经流式细胞仪检测CD133^＋细胞平均占单核细胞的（1．13±0．10）％,磁珠分选所得CD133^＋细胞平均纯度为（91．45±1．04）％;CD133^＋细胞贴壁生长,可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落;CD133^＋细胞培养过程中Dil-LDL及FITC-Lectin摄取阳性,双染阳性率为（95．83±1．72）％;CD133^＋细胞培养1周后经免疫组织化学检测CD34、Ⅷ因子阳性率分别为（95．83±2．23）％和（95．92±1．43）％,与人脐静脉内皮细胞比较差异无统计学意义;CD133^＋细胞体外培养4d、1周可形成小血管结构。结论免疫磁珠分选法可获取较高纯度CD133^＋血管内皮祖细胞,在生长因子作用下诱导其分化为成熟血管内皮细胞。     

bFGF和IGF对体外培养骨髓基质干细胞增殖及分化的影响

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)对体外培养骨髓基质干细胞(BMSc)增殖、分化的影响.方法 3～6月龄的雄性SD大鼠处死后,取双侧股骨、胫骨的骨髓进行体外培养.将含有不同细胞因子的培养基分为4组:①bFGF组;②IGF组;③bFGF IGF组;④对照组.以上各组均含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、青霉素、链霉素.显微镜下观察BMSc的生长特性,用MTT法测得的细胞相对值绘制生长曲线.采用改良Gomori氏钙钴法计数碱性磷酸酶(ALP)阳性率的细胞.结果 BMSc在传代培养前两天,各组的细胞数量无明显变化,从第二至第八天,bFGF组、IGF组、bFGF IGF组的细胞数量均高于对照组,并且bFGF IGF组明显高于其它3组.含细胞因子3组的ALP阳性率均高于对照组,bFGF IGF组的阳性率最高.结论 bFGF、IGF都能促进BMSc增殖及向成骨细胞分化,并且两者同时运用优于单独使用;bFGF、IGF在促进BMSc增殖与分化时起协同作用.     

大鼠小肠Cajal间质细胞的体外分离、培养及鉴定

目的：探讨大鼠小肠Cajal间质细胞（ICC）的原代分离、培养及鉴定方法。 方法：出生后5~10 d的SD乳大鼠,颈椎脱臼处死。无菌条件下取出小肠,在解剖显微镜下剥去小肠系膜、肠黏膜和黏膜下层,将小肠平滑肌层组织剪成小块后接种于含有干细胞因子的DMEM培养基中进行培养。倒置显微镜下连续观察组织块周围细胞的游出情况及细胞的形态,用酪氨酸蛋白激酶受体c-kit特异性抗体免疫荧光染色鉴定细胞类型。 结果：培养1周后,倒置显微镜下可见组织块周围长出细胞,呈梭形、三角形,有多个短突起;随着培养时间的延长,突起细长化并彼此相互连接形成网络。该类细胞c-kit抗体免疫荧光染色呈阳性。 结论：该研究成功建立了一套由大鼠小肠平滑肌组织块原代培养ICC的方法,为ICC的生物学特性及其与胃肠道动力障碍性疾病关系的研究奠定了基础。     

大鼠胰腺部分切除后导管细胞增殖规律研究

目的　探讨大鼠胰腺大部分切除术后残余胰腺组织导管上皮细胞增殖的时空规律 ,明确胰腺干细胞组织定位。方法　手术切除大鼠胰腺 90 %组织 ,不同时间点处死动物后取材 ,免疫组织化学染色 ,5 溴脱氧嘧啶核苷 (BrdU )标记 ,观察不同分类胰腺导管上皮细胞以及腺泡细胞着色并计算染色指数。结果　建模后第 1天主胰管、大胰管、小胰管细胞均出现增殖高峰 ,其中小胰管增殖持续到大鼠建模后第 5天 ,与对照组比较差异有非常显著性 (P <0 .0 0 1) ;腺泡细胞仅在建模后第 5天出现小的增殖峰 ;建模后第 7天破坏的小叶结构基本恢复 ,胰腺导管周围有新生胰岛形成。结论　大鼠胰腺大部分切除后 ,胰腺再生过程中出现了胰腺干细胞增生与分化 ,而且胰腺干细胞主要位于导管上皮细胞中。     

人胚胎嗅球嗅鞘细胞的体外培养

目的探讨人胚胎嗅球嗅鞘细胞的分离和培养方法。方法：选取家属同意下引产的4-5月胎儿，分离原代嗅球成鞘细胞，利用差速贴壁法结合无血清饥饿培养法对细胞进行纯化，计算其纯度。结果通过差速贴壁法结合无血清饥饿培养法，可获得纯度70％-80％嗅鞘细胞．显微镜下观察细胞形态，以双极和三极细胞为主，亦有少许多极及梭形细胞。结论应用差速贴壁法与无血清饥饿培养法分离培养人胚嗅球成鞘细胞是一种较为稳定可靠的方法。     

不同胚龄人神经干细胞的分离和培养

目的 探索不同胚龄人神经干细胞分离和培养的适宜条件。方法 在多种培养条件下，采用无血清培养和单细胞克隆技术，从7周和13周人胚脑中分离和培养神经干细胞，应用免疫荧光染色予以鉴定。结果 从两个不同胚龄的人胚脑中分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，未包被组7周的人胚脑除高密度县浮培养法生长不良，其它密度及培养法均有克隆球形成；13周的人胚脑仅中等密度悬浮培养法及高密度贴壁培养法有克隆球形成；包被组各种密度培养均生长不良。结论 人胚脑中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞，随着胚龄增大，培养难度逐渐加大，高密度贴壁培养法适宜各胚龄神经干细胞的分离培养。     

大鼠外周血内皮前体细胞体外程序化培养的研究

目的探讨从大鼠外周血中获取内皮前细胞的方法，为缺血性心脏病细胞移植治疗提供新的移植材料。方法首先应用密度梯度离心法分取大鼠外周血中的单个核细胞，然后以IMEM、胎牛血清、马血清、VEGF、bFGF等混合而成的培养基，进行体外培养。最后将此方法收获的细胞经一系列免疫荧光染色，并检测其结合UEA-1、摄取acLDL的能力。结果细胞CD31、CD34、Flk-1和vWF免疫荧光染色阳性，并能结合UEA-1、摄取acLDL。同时结合细胞的形态学变化特点，证实得到的细胞为内皮前细胞。结论通过一定的体外分离、培养途径，可以从大鼠外周血获得较为纯化的内皮前细胞。