IGF-1对猪关节软骨细胞合成糖胺多糖的作用

目的观察胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-1)对猪软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)含量的影响。方法采用Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种6×106/ml于培养皿,在细胞贴壁后更换培养基时,加入IGF-110ng/ml,每周传代1次,连续5周,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌GAG的变化;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果体外培养的软骨细胞传代后合成GAG基质,第二代传代细胞分泌GAG的能力最强;加入IGF-1能明显增强传代软骨细胞合成GAG的能力。结论IGF-1能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成GAG基质。     

周期性张应变力对不同年龄兔关节软骨细胞产生糖胺多糖的影响

目的 观察周期性张应变力(CTS)对体外培养不同年龄兔软骨细胞产生糖胺多糖(GAG)的影响。方法 选取雄性新西兰大白兔9只,按照年龄分为幼年组（2月龄）、成年组（8月龄）及老年组（31月龄）（每组3只）,无菌条件下取双膝关节,将各年龄组兔膝软骨细胞进行消化分离和体外培养。将每个年龄组兔原代软骨细胞分别培养于2个BioFlex 6孔培养板上,随机分为CTS组和对照组（每组6个样本）,同置于培养箱内,CTS组每天CTS (sin1 0％,0.5 Hz,6h/次)作用6h,对照组不予特殊处理。CTS组与对照组在首次作用后第12、24、36、48、60、72小时分别吸取培养细胞上清液,Alcian blue染色沉淀法测定上清液GAG含量,比较两组GAG分泌的变化。结果 CTS组与对照组相比,各年龄组兔软骨细胞GAG增加量在不同时间]点差异均有统计学意义(P＜0.05)。老年组在起始时,两组GAG的增加量与年轻组的增加量无明显差异,但从第48小时起老年组增加量开始低于年轻组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 CTS可以促进兔软骨细胞产生GAG,且CTS刺激后年轻细胞比老年细胞产生更多的GAG。     

β-连环蛋白在膝关节原发性骨关节炎关节软骨中的表达

目的通过检测β-连环蛋白(β-catenin)在膝关节原发性骨关节炎(osteoarthritis,OA)不同退变程度关节软骨中的表达,探讨其在原发性膝关节OA发生与发展中的作用。方法取2010年10月-2011年5月行人工全膝关节置换术的40例OA成年患者及10例创伤后行截肢术及股骨髁骨折成年患者自愿捐赠的膝关节软骨,于股骨髁切取包含全层软骨及少量软骨下骨组织块进行实验。组织切片行固绿-番红O染色,观察软骨退变情况,参照改良Mankin评分标准对软骨标本进行分级;行免疫组织化学染色及Western blot检测不同软骨组织中β-catenin表达。结果根据改良Mankin评分标准进行分级:正常软骨10例,轻度退变12例,中重度退变28例。组织学观察见轻度退变软骨浅表层裂隙形成,软骨细胞数减少,排列紊乱,潮线复制;中重度退变软骨深层裂隙形成,软骨细胞数目显著减少,成簇,甚至全层缺失。正常软骨中β-catenin表达呈阴性;OA软骨均有表达,主要位于细胞核,中重度退变软骨表达显著多于轻度退变软骨(P<0.05)。结论β-catenin与膝关节原发性OA发病机制及病情进展程度密切相关,其机制可能是Wnt/β-catenin信号通路活化后促进炎性基因转录,导致关节软骨破坏。     

咖啡酸苯乙酯干扰β-连环蛋白通路对大肠癌的影响

目的 观察咖啡酸苯乙酯(CAPE)对大肠癌SW480细胞β-连环蛋白相关通路中β-连环蛋白、c-myc和细胞周期蛋白D1基因表达的影响.方法 采用RT-PCR和Western blot方法 检测不同浓度CAPE作用24、48 h后,细胞β-连环蛋白、c-myc及细胞周期蛋白D1 Mrna和蛋白表达的变化.结果 经不同浓度的CAPE作用后,SW480细胞β-连环蛋白、c-myc、细胞周期蛋白D1 Mrna和蛋白表达均有不同程度的下降,分别从1.05±0.26下降到0.67±0.10、0.87±0.09下降到0.51±0.14、0.63±0.09下降到0.32±0.14和204±52下降到52±16、111±11下降到52±16、87±7下降到32±12,与对照组(CAPE浓度为0 mg/L)比较差异有统计学意义(F=5.724,6.793,7.026,15.936,14.889,14.162,31.147,28.881,6.322,17.647,9.584,P<0.05),并呈剂量和时间依赖性.结论 CAPE可干扰β-连环蛋白相关通路,下调β-连环蛋白及通路靶基因c-myc和细胞周期蛋白D1的转录和表达.CAPE抗肿瘤作用可能与下调β-连环蛋白通路相关基因表达有关.     

bFGF对猪关节软骨细胞合成氨基葡聚糖的作用

[提要]目的:观察bFGF对软骨细胞外分泌基质氨基葡聚糖含量的影响。方法:通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种6×106个细胞于培养皿,在细胞贴壁后更换培养基时,加入bFGF10ng/ml,每周传代一次,连续5周,留取所有培养液用阿利新蓝法(AlcianBlue)测定软骨细胞外分泌基质氨基葡聚糖(GAG)的变化;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果:体外培养的软骨细胞从传代后合成氨基葡聚糖类基质,第二代传代细胞分泌GAG的能力最强;加入bFGF能明显促进传代软骨细胞合成大量的氨基葡聚糖类基质。结论:bFGF能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的氨基葡聚糖类基质。     

血清对体外培养成年人关节软骨细胞生长的影响

目的观察不同血清及血清浓度对成人关节软骨的细胞（AHAC）生长的影响，为软骨细胞移植的临床应用提供血清选择。方法用无血清、胎牛血清（FBS）和人AB血清及不同浓度血清在加或不加生长因子条件下培养成年人关节软骨细胞，比较细胞增殖和生长情况。结果对于AHAC，人AB血清培养优于FBS；合适的人AB血为10％；合适的FBS浓度为20％；无血清培养细胞增殖非常缓慢；不加因子用人AB血清培养细胞梭形化明显，加用生长因子后与使用FBS在形态上一致。结论10％浓度的人血清是AHAC体外培养的合适血清和浓度选择。     

几丁糖作为软骨细胞培养支架的实验研究

目的：探讨几丁糖作为组织工程技术中软骨细胞培养支架的可行性。方法：采用几丁糖无纺网作为细胞培养支架,使用前首先用10%多聚赖氨酸包埋以增加其对软骨细胞的吸附性,然后把几丁糖支架与软骨细胞一起进行体外培养,在倒置显微镜下观察几丁糖对软骨细胞生长的影响。结果：包埋后的几丁糖支架与软骨细胞一起进行体外培养,在倒置显微镜下观察几丁糖对软骨细胞生长的影响。结果：包埋后的几丁糖支架与软骨细胞一起体外培养10d,软骨细胞数目增加约6倍,并且与几丁糖支架牢固结合不易丢失。结论：几个糖无纺网经10%多聚赖氨酸包埋后,对软骨细胞吸附性增强,并且几丁糖具有良好的生物学特性,因此几丁糖符合组织工程对细胞培养支架的要求。有可能成为组织工程中一种良好的细胞培养支架。     

正常和病变椎间盘髓核的糖胺多糖研究

蛋白多糖是椎间盘髓核的主要基质成分 ,为研究蛋白多糖代谢变化与椎间盘退变、突出的关系 ,我们对椎间盘髓核中蛋白多糖的水解提取物———糖胺多糖 (Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ,ＧＡＧ)进行了生化研究。1　材料与方法1 1　取材 :正常椎间盘髓核标本取自急性脑外伤死后 1ｈ的男性青年 (平均年龄 2 6 9岁 )共 34个标本 ,肉眼及解剖观察无明显变性和椎间盘突出。退变标本取自腰椎间盘突出症手术患者 ,共 33个 ,患者平均年龄 2 8岁。1 2　ＧＡＧ提取 :将标本称取重量后切碎 ,放人编号试管中 ,依顺序加入0 1ＭＮａＯＨ1 5ｍｌ,制成…     

β-连环蛋白与肠干细胞增殖分化机制

β-连环蛋白(β-catenin)是近年来发现的一种信号传导分子,它可通过以下途径来调节肠上皮干细胞的增殖分化:(1)β-连环蛋白可在Wnt途径失活时,通过磷酸化和泛素化而降解,从而维持胞浆内低水平;Wnt途径激活时,磷酸化和泛素化被抑制,β-连环蛋白在胞浆内积聚,随后进入核内与Tcf-4结合成转录复合体,并促进与肠干细胞增殖有关的基因表达。(2)β-连环蛋白还可通过酪氨酸残基的磷酸化与云磷酸化实现其活性和量的调节,并且在调控肠干细胞增殖及其子代细胞的分化、迁移过程中起着重要的作用。     

转化生长因子β对白介素-1β诱导人骨关节炎软骨细胞表达NO的影响

目的 探讨转化生长因子β(TGF-β)对白介素-1β(IL-1β)诱导人骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞表达一氧化氮(mitrlc oxide,NO)的影响.方法 体外培养OA患者软骨细胞,施以不同浓度的IL-1β,收集细胞培养液,检测其上清液表达NO的情况;选取某一合适浓度的IL-1β,然后施以不同浓度的TGF-β,检测其上清液表达N0的情况.结果 IL-1β诱导下,软骨细胞增加NO的表达,并呈剂量依赖关系;而TGF-β可抑制IL-1β诱导软骨细胞表达NO的作用,随着TGF-β剂量的加大,抑制N0的作用愈明显.结论 TGF-β具有抑制IL-1β诱导人骨关节炎OA软骨细胞表达NO的作用.TGF-β可能是OA的一种保护因子.     

猪脱细胞真皮基质影响蛋白激酶B/β-连环蛋白信号通路小鼠创面的研究

目的:观察猪脱细胞真皮基质(pADM)在小鼠创面修复过程中对蛋白激酶B(Akt)及β-连环蛋白(β-catenin)表达水平的影响。方法:猪皮经脱细胞处理后制成微粒皮,15只C57BL/L小鼠在脊柱左右各制作直径为6 mm的圆形皮肤缺损,左侧以纱布覆盖,常规护理,右侧以pADM覆盖,不作特别处理,按处理方法分为pADM...     

自由基对体外培养人胚关节软骨细胞的影响

采用体外培养人胚关节软骨细胞的方法，研究黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶系产生的自由基对软骨细胞生长的影响。倒置显微镜下，软骨细胞生长缓慢、形态异常、没有集落形成。通过测定软骨细胞ＤＮＡ、蛋白质、蛋白多糖及胶原的含量变化，发现自由基要显著抑制ＤＮＡ、蛋白质及蛋白多糖的合成。采用流式细胞仪对软骨细胞周期进行了分析，发现ＤＮＡ合成后期（Ｇ２＋Ｍ期）细胞数显著增加。显然，自由基通过对软骨细胞ＤＮＡ的损伤，从而影响细     

β-连环蛋白介导流体剪切力对成骨细胞增殖影响的实验研究

目的探讨β-连环蛋白(β-catenin)和细胞周期素D1(cyclinD1)在流体剪切力促进小鼠胚胎成骨细胞系MC3T3-E1细胞增殖过程中的作用。方法通过流体小室系统对体外培养成骨细胞爬片施加不同强度及时间梯度的流体剪切力,应用免疫荧光双标记法检测不同大小及时间流体剪切力作用下体外培养MC3T3-E1细胞中β-catenin及cyclinD1的表达;利用流式细胞技术检测增殖指数,分析β-catenin介导下流体剪切力对MC3T3-E1细胞G1→S期转化的影响。结果中等大小的流体剪切力(12dyn/cm2)作用下MC3T3-E1细胞中β-catenin及cyclinD1的表达较静置组、低应力组(6dyn/cm2)和高应力组(18dyn/cm2)明显增多(F=4.26,P=0.022;F=6.59,P=0.004),增殖指数也显著升高(F=5.84,P=0.037),且β-catenin与cyclinD1的表达呈正相关关系(r=0.65,P0.05)。结论流体剪切力通过引起β-catenin在胞浆内积聚,进而核转位发挥转录因子的作用,引起目标蛋白cyclinD1表达增加,在G1→S期转化过程中发挥了重要作用。中等大小的流体剪切力有显著促进细胞增殖作用。     

β-连环蛋白在骨折愈合期间的信号传导作用及其机制

目的 观察β-连环蛋白在骨折愈合期间变化,探讨其在骨折愈合期间发挥信号传导作用机制.方法 对32只鼠进行随机分组,制作胫骨骨折模型.应用Western blot分析对骨折愈合不同时间点β-连环蛋白水平进行测定,逆转录-聚合酶链反应(RT-PeR)技术检测骨折愈合期间Wnts和它们受体表达,组织形态学测量观察β-连环蛋白信号传导拮抗剂Dkk-1对骨折愈合影响.结果 β-连环蛋白在骨折愈合期间高表达.Dkk-1腺病毒处理骨痂样本显示β-连环蛋白水平低于未用Dkkl骨痂样本.Wnt-4、Wnt5b以及受体Fz-1和Lrp-6骨折愈合期间呈高表达.Ad-Dkk1组和对照组的骨和软骨占整个骨痂组织量比例、小梁骨直径(μm)、数量(每毫米)、小梁骨间隔(μm)分别为(11.33±2.52)%/(35.67±3.06)%、(14.33 ±2.51)%/(47.33±4.04)%、(720.00±77.70)μm/(189.33 ±83.36)μm、13.67±2.05/32.33 ±2.62、(1.25 ±0.96)μm/(4.00±0.82)μm.两组差异有统计学意义(P<0.01).结论 β-连环蛋白在骨折愈合中发挥重要作用,激活β-连环蛋白的治疗措施可能有助于骨折的愈合.     

胰岛素样生长因子-1对猪关节软骨细胞糖胺多糖的作用

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对软骨细胞分泌糖胺多糖的作用。方法:通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种5×106个细胞于培养皿,在传代细胞培养皿中加入100μg/L的IGF-1,每周传代1次,连续4周,留取培养液,用阿利新蓝法(Alcian Blue)测定软骨细胞糖胺多糖(GAG)的变化;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果:软骨细胞从传代后开始合成糖胺多糖,第二代传代细胞分泌GAG的能力最强;浓度为100μg/ml的IGF-1能明显促进传代软骨细胞合成糖胺多糖。结论:IGF-1能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖。     

IL-1β对人的软骨细胞Bax mRNA表达的作用及意义

目的　探讨白介素 - 1 β (IL - 1 )对人的透明软骨细胞BaxmRNA基因表达的作用及相关意义。方法　应用逆转录PCR(RT -PCR)方法检测IL - 1 β作用下传代培养的人的透明软骨细胞BaxmRNA的含量 ;并且应用实时荧光定量方法 ,进行BaxmRNA的相对含量。结果　对于传代培养的人的软骨细胞 ,IL - 1 β浓度为 1ng/ml,1 0ng/ml,1 0 0ng/ml作用 1 2h ,其对BaxmRNA调节作用存在剂量依赖关系 ,各组之间存在显著性差异。结论　IL - 1 β可以按照剂量依赖方式正向调节软骨细胞BaxmRNA基因的表达 ,并通过对细胞凋亡的调控参与骨关节炎的发生、发展     

特异性敲除β-连环蛋白基因对小鼠肝缺血再灌注损伤的影响

目的 通过构建特异性敲除小鼠模型观察β-连环蛋白(β-catenin)基因在小鼠肝缺血再灌注损伤中的作用.方法 应用Cre-lox系统构建肝细胞特异性敲除β-catenin基因小鼠模型,90 min半肝血流阻断制造肝脏缺血再灌注小鼠模型,分为β-catenin基因敲除组及对照组,再灌注后0、3、6、20 h测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及其肝脏组织学改变.结果 肝细胞特异性敲除β-catenin基因小鼠基因表型为:ctnnb纯合(loxP/loxP)并且Alb-Cre阳性表达,Western blot 方法证实其β-catenin蛋白表达丰度明显低于对照组.再灌注3、6、20 h敲除组小鼠血清ALT水平分别为282、405及128 U/ml;对照组分别为221、295及101 U/ml.敲除组AST水平分别为603、805及396 U/ml;对照组分别为421、398及336 U/ml,各时间点两组间差异均有统计学意义(P＜0.05).其肝细胞坏死、窦状隙充血以及炎细胞浸润程度明显重于对照组.结论 β-catenin对肝脏缺血再灌注引起的肝损伤起保护作用.

Abstract：

Objective To study the role of β-catenin in liver ischemia-reperfusion injury used a conditional knockout approach to delete p-catenin in the liver. Methods We adapted the Cre-lox recombination system to create the p-catenin conditional knockout (KO) mice and liver ischemia-reperfusion injury were made by 90min hemiliver blood supply block. Experimental animal were randomized into two groups:p-catenin conditional knockout group (KO group) and control group (C group). 0,3,6,20 h after reperfusion,serum samples were used for measurement of serum alanine transaminase ( ALT) and aspartate aminotransferase (AST) ,liver sections were subjected to hematoxylin-eosin staining. Results Genotyping identified that β-catenin KO mice showed ctnnb homozygosis ( - / - ) and Alb-Cre positive. Western blotting analysis showed an obviously lower expression of p-catenin in KO group. Three,6,20 h after reperfusion,KO group ALT level were 282,405 and 128 U/ml. C group were 221,295 and 101 U/ml. KO group AST level were 603,805 and 396 U/ml,C group were 421,398 and 336 U/ml. Hematoxylin and Eosin (HE)staining showed significant sinusoid inflation and congestion, extensive acidophilic necrosis, focal hemorrhages , hepatic lobula structure disorder and slightly lymphocyte inflammatory cells infiltration in KO group. In C group, HE staining show slightly sinusoid inflation and congestion, limited acidophilic necrosis and focal hemorrhages, hepatic lobula structure nearly integrity, slightly lymphocyte inflammatory cells infiltration.Conclusion β-catenin may play a protect role in liver ischemia-reperfusion injury.     

K+、Cl-离子通道阻滞对体外培养兔关节软骨细胞基质合成代谢的影响

目的 观察阻断体外培养兔关节软骨细胞膜上的K+、Cl-离子通道对其糖胺多糖(GAG)、Ⅱ型胶原基质合成代谢的影响.方法 2个月龄新西兰白兔,无菌条件下切取双膝关节软骨,酶解法分离软骨细胞,以5 ×104/孔接种于24孔板中.正常培养2 d细胞贴壁后换液,并以12个孔为1组随机分为3组,对照组:用DMEM/F12正常培养;K+离子通道阻滞组(简称4-AP组):利用含1 mmol/L 4-氨基吡啶(4-AP)的DMEM/F12培养,特异性阻断电压门控型K+离子通道;Cl-离子通道阻滞组(简称SITS组):利用含1 mmol/L4-乙酰氨基-4'-异硫氰基-2,2'-乙拌磷酸均二苯乙烯(SITS)的DMEM/F12培养,阻断阴离子通道,主要是Cl-离子通道.分别在换液后第3、6、9天留取各孔上清液并分为2份,1份以阿尔新蓝法检测其GAG的含量,同时另1份以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测Ⅱ型胶原的含量(n=12).结果 4-AP组在第3天时与对照组比较GAG含量明显下降(P＜0.05),但第6天和第9天差异无统计学意义(P＞0.05),同时在第3天和第6天Ⅱ型胶原含量显著增加(P＜0.05),第9天时有下降趋势,但差异无统计学意义(4-AP组GAG含量分别为17.23±1.47、20.98±2.61、33.13±8.13;Ⅱ型胶原含量分别为0.793±0.214、0.789±0.084、0.715±0.388);SITS组在第3、6、9天与对照组比较GAG含量都显著增加(P＜0.05),同时在第3天和6天Ⅱ型胶原含量显著增加(P＜0.05),第9天仍然有增加的趋势,但差异无统计学意义(SITS组GAG含量分别为54.30±4.43、56.47±3.14、58.71±2.50;Ⅱ型胶原含量分别为0.793±0.125、0.853±0.060、0.925±0.053).结论　阻断K+、Cl-离子通道后显著促进软骨细胞GAG、Ⅱ型胶原的合成,尤其是阻断Cl-离子通道后,GAG的合成增加尤为明显.

Abstract：

Objective To observe the effects of potassium and chloride channel blockers on the glycosaminoglycan (GAG) and collagen type Ⅱ synthesis of rabbit articular chondrocytes in vitro. Methods Two-month-old New Zealand rabbits were killed and their knee joints were taken out under the aseptic condition. The chondrocytes were isolated by enzymolysis method and cultivated into a 24-well plate ( seeded 5 × 104 cells per well). Then the chondrocytes were divided into three groups randomly after culture for 2 days when the cells were adherent. In the control group the cells were cultured by DMEM/F12, in the potassium channel blocking group [4-aminopyridine (4-AP) group] the cells were cultured in the medium containing 1 mmol/L 4-AP, and in the chloride channel blocking group [4-acetamido-4-isothiocyano-2,2-disulfonic acid stilbene (SITS) group] the cells were cultured in the medium containing 1 mmol/L SITS.The GAG synthesis was measured by Alician Blue method and collagen type Ⅱ synthesis was estimated by the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in the media at the 3rd, 6th and 9th day after medium change ( n = 12). Results As compared with the control group, the GAG content in 4-AP group was significantly decreased at the 3rd day ( P ＜ 0. 05 ), but showed no significant difference at 6th and 9th day (P ＞0. 05); the collagen type Ⅱ content was significantly increased at 3rd and 6th day (P ＜0. 05), and showed a decrease tendency at 9th day without significant difference ( GAG: 17.23 ± 1.47, 20. 98 ± 2. 61,33. 13 ± 8. 13; collagen type Ⅱ: 0. 793 ± 0. 214, 0. 789 ± 0. 084, 0. 715 ± 0. 388). The GAG content in the SITS group was significantly increased at the 3rd, 6th and 9th day (P ＜0. 05), while the collagen type Ⅱ content was significantly increased at 3rd and 6th day ( P ＜0. 05), and showed an increase tendency at 9th day without significant difference ( GAG: 54. 30 ±4. 43, 56. 47 ± 3. 14, 58.71± 2. 50; collagen type Ⅱ: 0. 793 ±0. 125, 0. 853 ±0. 060, 0. 925 ±0. 053). Conclusion The blockage of potassium and chloride channels can increase the GAG and collagen type Ⅱ synthesis of chondrocytes in vitro, especially when chloride channel is blocked, the GAG synthesis was significantly increased.     

椎间盘纤维环中糖胺多糖的实验研究

目的　研究正常和退变腰椎间盘纤维环中糖胺多糖 (GAG)含量及其主要成份百分组成 ,探讨椎间盘退变的发生机理。方法　对 34个正常纤维环和 35个椎间盘突出症纤维环标本中GAG含量进行测定 ,并用醋酸纤维素膜电泳和光密度扫描的方法对GAG主要成份百分组成进行测定。结果　正常纤维环GAG含量为 4 17± 0 94g/10 0 g ,退变纤维环GAG含量为 3 5 7± 0 98g/10 0g ,低于正常组 (P <0 0 5 ) ;退变组GAG中硫酸软骨素 (CS)百分值低于正常组 (P <0 0 5 ) ;而其透明质酸 (HA)和硫酸角质 (KS)高于正常组 (P <0 0 5 )。结论　椎间盘纤维环中GAG含量下降 ,是引起纤维环胶原纤维稳定性降低 ,影响纤维环板层滑动 ,导致椎间盘退变、突出症发生的重要原因之一。退变纤维环GAG含量下降由其主要成分CS含量下降所致