吡格列酮促进大鼠骨髓内皮祖细胞的增殖

背景：内皮祖细胞具有增殖、迁移和分化为内皮细胞的特征,对冠状动脉硬化性心脏病及糖尿病心血管并发症的发生、发展可能起着重要作用。目的：探讨选择性过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂吡格列酮对大鼠骨髓内皮祖细胞增殖的影响及相关机制。方法：①采用密度梯度离心法和差速贴壁法培养大鼠骨髓内皮祖细胞,置于含0,1,10,50,100,200μmol/L吡格列酮的培养基中培养,观察吡格列酮促进内皮祖细胞增殖的最佳浓度。②将培养7d的内皮祖细胞随机分5组：对照组加含二甲基亚砜的培养液;吡格列酮组加入50μmol/L吡格列酮;PPAR-γ拮抗剂组加入50μmol/L吡格列酮及10μmol/L过氧化物酶体增殖物激活受体γ拮抗剂GW9662;PI3K/Akt阻滞剂组加入50μmol/L吡格列酮及50μmol/L磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通道阻滞剂Wortmannin;ERK阻滞剂组加入50μmol/L吡格列酮及20μmol/L细胞外调节蛋白激酶通道阻滞剂PD98059,观察不同组内皮祖细胞的增殖情况。结果与结论：倒置显微镜下见培养前4d细胞增殖不明显,第5-10天迅速增殖,并可见细胞集落及线状结构形成,第10天可达80%融合。培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能。10-200μmol/L的吡格列酮均可明显促进内皮祖细胞的增殖（P〈0.01）,以50μmol/L吡格列酮的作用最明显。进一步阻断相关信号通路发现,Wortmannin和GW9662可明显拮抗吡格列酮的促细胞增殖作用,而PD98059对吡格列酮的作用无影响。说明吡格列酮促进大鼠骨髓内皮祖细胞增殖的作用是通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路介导的。     

脑源性神经营养因子通过AKT和ERK1/2信号通路诱导内皮细胞血管生成

本研究探讨脑源性神经营养因子（BDNF）促进血管新生的作用及其参与的信号通路,为抗肿瘤血管生成的研究提供新的实验依据。以人脐静脉内皮细胞为对象,采用Western blot方法检测细胞内磷酸化Akt、ERK1/2蛋白质的表达;采用Transwell小室迁移实验和管腔形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力,MTT法检测内皮细胞增殖活性,FITC-Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞术分析细胞调亡。结果表明：BDNF以时间依赖性的方式激活PI3K/Akt和MEK1/ERK信号通路。应用PI3K激酶抑制剂Ly294002、MEK1激酶抑制剂PD98059可以明显阻断BDNF对PI3K/Akt、MEK1/ERK信号通路的激活。100ng/ml的BDNF体外促内皮细胞血管新生能力与25ng/ml血管内皮生长因子（VEGF）相当,其中BDNF诱导的细胞迁移分别被Ly294002和PD98059阻断,其抑制率分别约为74%和36%;同样,Ly294002、PD98059可部分阻断BDNF诱导的小管形成效应,其阻断率分别约57%和37%;而BDNF的促增殖效应仅被PD98059拮抗,抑制凋亡效应仅受Ly294002影响。结论：BDNF在体外有促血管新生的作用。PI3K/Akt和MEK1/ERK信号通路以不同机制共同调节这一过程,其中PI3K/Akt信号通路起着更为重要的调节作用。     

重组人促红细胞生成素与骨髓间充质干细胞的迁移及黏附☆

背景:促红细胞生成素可促进内皮祖细胞的增殖分化并增强其黏附性。目的:观察重组人促红细胞生成素干预对人骨髓间充质干细胞迁移和黏附能力及相关细胞信号传导通路的影响。方法:体外培养人骨髓间充质干细胞,使用重组人促红细胞生成素干预第6代人骨髓间充质干细胞。分别用PI3K/Akt通路特异抑制剂Ly294002或p38MAPK通路特异激动剂anisomycin或ERK1/2通路特异抑制剂U0126预处理。结果与结论:重组人促红细胞生成素可使人骨髓间充质干细胞的PI3K/Akt通路磷酸化水平升高,抑制p38MAPK通路磷酸化水平,对人骨髓间充质干细胞的ERK通路和总Akt、总p38MAPK水平无明显影响。重组人促红细胞生成素作用组中迁移细胞数目显著高于对照组(P<0.01),黏附细胞数亦明显增加(P<0.01),PI3K/AKT通路特异抑制剂Ly294002预处理后重组人促红细胞生成素对迁移能力的作用消失,p38MAPK通路特异激动剂anisomycin预处理对两种作用影响均不明显。提示重组人促红细胞生成素具有增强人骨髓间充质干细胞迁移和黏附能力的作用,其增强迁移能力的作用与激活人骨髓间充质干细胞的PI3K/Akt通路有关,但是它对黏附能力的作用与PI3K/Akt和p38MAPK通路均无关。     

骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化中电磁场激活ERK通路的作用

背景：研究表明电磁场可调节骨髓间充质干细胞的增殖和分化,但其具体机制尚不清楚。目的：从ERK信号途径探讨电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨的作用。方法：取第3代生长良好的大鼠骨髓间充质干细胞,暴磁组给予15Hz、1mT的正弦波电磁场刺激,PD98059＋暴磁组在电磁场刺激前给予20μmol/L ERK阻断剂PD98059,PD98059组仅给PD98059不进行电磁场刺激,对照组正常培养。电磁场刺激后,收集各组细胞,Western blot法检测ERK通路的活性,MTT法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论：电磁场刺激后,细胞ERK1/2磷酸化水平、细胞的增殖活性、及碱性磷酸酶活性均明显升高（P〈0.01）;PD98059可明显抑制ERK1/2磷酸化水平及细胞增殖活性的升高（P〈0.01）,而在一定程度上提高细胞的碱性磷酸酶活性（P〈0.01）。说明电磁场刺激可通过激活骨髓间充质干细胞ERK信号通路,并且主要通过该途径促进骨髓间充质干细胞的增殖;而在脉冲电磁场促进骨髓间充质干细胞分化成骨的过程中,激活ERK信号通路所起的作用较小。     

骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化中电磁场激活ERK通路的作用

背景:研究表明电磁场可调节骨髓间充质干细胞的增殖和分化,但其具体机制尚不清楚.目的:从ERK信号途径探讨电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨的作用.方法:取第3代生长良好的大鼠骨髓间充质干细胞,暴磁组给予15 Hz、1 mT的正弦波电磁场刺激,PD98059+暴磁组在电磁场刺激前给予20 μmol/L ERK阻断剂PD98059,PD98059组仅给PD98059不进行电磁场刺激,对照组正常培养.电磁场刺激后,收集各组细胞,Western blot法检测ERK通路的活性,MTT法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性.结果与结论:电磁场刺激后,细胞ERK1/2磷酸化水平、细胞的增殖活性、及碱性磷酸酶活性均明显升高(P < 0.01);PD98059可明显抑制ERK1/2磷酸化水平及细胞增殖活性的升高(P < 0.01),而在一定程度上提高细胞的碱性磷酸酶活性(P < 0.01).说明电磁场刺激可通过激活骨髓间充质干细胞ERK信号通路,并且主要通过该途径促进骨髓间充质干细胞的增殖;而在脉冲电磁场促进骨髓间充质干细胞分化成骨的过程中,激活ERK信号通路所起的作用较小.     

氧化低密度脂蛋白诱导内皮祖细胞凋亡的机制探讨

目的:探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉血内皮祖细胞(EPCs)凋亡的信号途径.方法:密度梯度离心法获取人脐静脉血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞分成以下各组:(1)空白对照组:不作任何处理,以RPMI1640培养液继续培养48 h;(2) ox-LDL各浓度组(共3组):EPCs培养24 h后,再分别换用含5,10,20 mg/L ox-LDL的RPMI 1640培养液继续培养24 h;Western blot检测细胞内Akt、磷酸化Akt的蛋白表达时加上一组.(3) Wortmannin组:EPCs培养24 h后,换用含Wortmannin 100 μmol/L RPMI1640培养液继续培养24 h.采用MTI法检测EPCs增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率;提取细胞RNA,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测Bcl-2mRNA表达;采用免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白表达水平;采用Western blot检测磷酸化Akt的蛋白表达.结果:Ox-LDL呈浓度依赖性抑制EPCs增殖、诱导EPCs凋亡(P＜0.01),基础状态下内皮祖细胞表达Bcl-2mRNA及蛋白,ox-LDL处理能抑制其表达,降低磷酸化Akt的表达,并存在量效关系(P＜0.05).结论:Ox-LDL抑制EPCs增殖、诱导EPCs凋亡的作用是通过抑制Akt活化,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2实现的;Ox-LDL的作用机制至少部分是依赖PI3K/Akt信号通路实现,这可能影响血管内皮的修复及新生血管的形成.     

电磁场激活细胞外信号调节激酶通络在骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨中的作用

目的探讨电磁场作用于大鼠骨髓间充质干细胞对细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的影响，并进一步研究电磁场诱导所致ERK信号通路变化在骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨中的作用。 方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，取第3代细胞，分为对照组、暴磁组、PD98059组和PD98059+暴磁组。采用Western blotting法检测ERK通路的活性变化，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞的增殖活性，按照碱性磷酸酶（ALP）试剂盒说明书步骤检测各组细胞ALP活性。 结果①暴磁后5 min，ERK1/2磷酸化水平即明显高于对照组，1 h后仍处于较高水平（P<0.01）；PD98059作用可明显抑制ERK1/2磷酸化水平的升高，提示PD98059可有效阻断ERK通路的激活。②MTT法检测结果提示，暴磁后细胞的增殖活性明显升高，PD98059可明显抑制这种效应。③暴磁组ALP活性明显高于对照组，PD98059+暴磁组ALP活性较暴磁组高（P<0.01），差异有统计学意义。 结论在15 Hz、1 mT的正弦波电磁场作用下，骨髓间充质干细胞ERK信号通路很快被激活，引起细胞增殖活性和ALP活性的改变，这为进一步研究磁场对骨髓间充质干细胞的促增殖和分化成骨机制提供了指导意义。     

普伐他汀对H2O2诱导的人骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的:探讨普伐他汀干预对H2O2诱导的人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)凋亡的影响及其相关细胞信号传导通路。方法:应用普伐他汀干预体外培养的第6代人MSCs,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测作用前后ERK1/2、p38MAPK及PI3K/Akt通路蛋白的表达及磷酸化情况。将10μmol/L普伐他汀预处理人MSCs 1 h后,换用含1 mmol/L H2O2的完全培养基培养1 h,观察细胞形态,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;进一步在普伐他汀干预前用特异的细胞信号通路抑制剂或激动剂阻断或激活ERK1/2、p38MAPK及PI3K/Akt途径,观察其对普伐他汀作用的影响。结果:普伐他汀可使人MSCs的PI3K/Akt通路磷酸化水平升高,使p38MAPK通路磷酸化水平降低,而其对人MSCs的ERK1/2通路和总Akt、总p38MAPK蛋白水平无显著影响。普伐他汀能抑制H2O2诱导的人MSCs的凋亡(P<0.05),PI3K/Akt通路特异抑制剂Ly294002预处理后这种作用消失,p38MAPK通路特异激动剂anisomycin预处理对这种作用影响不显著。结论:普伐他汀可激活人MSCs的PI3K/Akt通路,抑制p38MAPK通路,并可抑制H2O2诱导的人MSCs凋亡。PI3K/Akt通路的激活参与了其抗凋亡作用的调控。     

脑溢安对谷氨酸致神经元损伤的保护作用

目的：探讨中医平肝熄风，凉血泻火治法的抗神经损伤机理。方法：建立谷氨酸致体外培养的大鼠海马神经元兴奋毒性损伤模型，并用脑溢安含药血清、细胞外调节蛋白激酶（ERK）阻滞剂PD98059进行干预，分别检测各组神经元活化的ERK、cjun氨基末端激酶（JNK）水平及上清液LDH活性。结果：脑溢安含药血清能上调谷氨酸损伤后的大鼠海马神经元ERK水平，下调JNK水平，PD98059能阻断脑溢安对受损经元的保护作用。结论：以平肝熄风、凉血泻火为主要治法的脑溢安含药血清对谷氨酸致培养大鼠海马神经元损伤后的保护作用与MAPK信号转导途径有关，脑溢安上调ERK表达，下调JNK表达，促进细胞生存。     

血必净注射液对大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用部分通过PI3K/Akt信号通路介导

目的证明血必净注射液(XBJ)对大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用部分是通过PI3K/Akt途径介导的。方法采用大脑中动脉闭塞(MCAO)方法制作Sprague-Dawley(SD)大鼠的缺血性脑损伤模型。选用5组大鼠,观察一定浓度(10ml/kg)的XBJ对脑缺血再灌注损伤的保护作用。采用渥曼青霉素(Wortmannin)(0.25mg/kg)检测XBJ的神经保护作用是否与PI3K/Akt信号通路的激活有关。检测24h后脑梗死体积、神经功能缺损评分、裂解caspase-3及p-Akt蛋白表达。结果 XBJ可明显增加大鼠24h后的p-Akt蛋白的表达,缩小脑梗死体积,裂解caspase-3,降低神经功能缺损评分。然而,Wortmannin在很大程度上逆转了XBJ的这些作用。结论 XBJ通过增加p-Akt蛋白的表达,减少梗死范围,降低神经功能缺损评分,减少caspase-3的裂解而发挥神经保护作用,其作用部分是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。     

Differential roles of signaling pathways for proliferation and migration of rat pancreatic stellate cells

Activated pancreatic stellate cells (PSCs) have recently been implicated in the pathogenesis of pancreatic fibrosis and inflammation. Accumulation of PSCs is a fundamental feature of pancreatic fibrosis, and platelet-derived growth factor (PDGF)-BB is the most potent mitogen for PSCs. But, the molecular mechanisms responsible for PDGF's actions in PSCs are largely unknown. In hepatic stellate cells, it has been established that activation of both phosphatidylinositol (PI) 3-kinase and extracellular-signal regulated kinase (ERK) pathways is required for PDGF-BB-induced proliferation and migration. The aim of this study was to elucidate the signaling pathways mediating PDGF-BB's actions in PSCs. PSCs were isolated from rat pancreas tissue and used in their culture-activated, myofibroblast-like phenotype. Culture-activated PSCs expressed PDGF alpha- and beta-receptors. PDGF-BB induced autophosphorylation of its receptor, followed by the activation of PI 3-kinase, Akt, and ERK pathways. Activation of PI 3-kinase was not required for PDGF-BB-induced ERK activation. PDGF-BB induced approximately five-fold increase in proliferation and chemotaxis of PSCs. Inhibition of ERK pathway with PD98059 completely blocked proliferation, whereas PD98059 had a modest inhibitory effect on cell migration (approximately 50%). On the other hand, inhibition of PI 3-kinase pathway with wortmannin or LY294002 almost completely inhibited migration, but did not affect proliferation of PSCs. In conclusion, our results suggest that ERK pathway regulates proliferation and migration in response to PDGF-BB, whereas PI 3-kinase mediates cellular migration, but not proliferation of PSCs.     

黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响

背景：前期研究证实黄芪通过P38MAPK通路促进内皮祖细胞增殖,其影响是否通过PI3K/Akt/eNOS途径实现？目的：观察黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶表达的影响。方法：采用密度梯度离心法获取糖尿病患者外周血单个核细胞,培养7d后鉴定内皮祖细胞。观察0,50,200,800,3200,6400mg/L黄芪多糖分别干预6,12,24,48h对内皮祖细胞影响的量效和时效关系;用黄芪多糖及黄芪多糖与PI3K抑制剂LY294002联合干预糖尿病患者内皮祖细胞,Western blot检测磷酸化Akt及磷酸化内皮型一氧化氮合酶的表达水平。以未进行任何处理健康人内皮祖细胞作为对照组。结果与结论：糖尿病患者内皮祖细胞的增殖能力较对照组明显下降（P〈0.05）。黄芪多糖显著增加糖尿病患者内皮祖细胞的增殖能力,当黄芪多糖在200～800mg/L质量浓度范围,干预6～24h可呈时间及剂量依赖性增强内皮祖细胞的增殖能力（P〈0.01）,并呈剂量依赖性升高内皮祖细胞磷酸化Akt及磷酸化内皮型一氧化氮合酶的表达（P〈0.05）;PI3K抑制剂LY294002能阻断黄芪多糖诱导的Akt、内皮型一氧化氮合酶的磷酸化（P〈0.05）。说明黄芪多糖通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路促进内皮祖细胞增殖和向内皮细胞的分化。     

Rosiglitazone suppresses human lung carcinoma cell growth through PPARgamma-dependent and PPARgamma-independent signal pathways

Peroxisome proliferator-activated receptors gamma (PPARgamma) exert diverse effects on cancer cells. Recent studies showed that rosiglitazone, a synthetic ligand for PPARgamma, inhibits cell growth. However, the exact mechanisms underlying this effect are still being explored, and the relevance of these findings to lung cancer remains unclear. Here, we report that rosiglitazone reduced the phosphorylation of Akt and increased phosphatase and tensin homologue (PTEN) protein expression in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) cells (H1792 and H1838), and this was associated with inhibition of NSCLC cell proliferation. These effects were blocked or diminished by GW9662, a specific PPARgamma antagonist. However, transfection with a CMX-PPARgamma2 overexpression vector restored the effects of rosiglitazone on Akt, PTEN, and cell growth in the presence of GW9662. In addition, rosiglitazone increased the phosphorylation of AMP-activated protein kinase alpha (AMPKalpha), a downstream kinase target for LKB1, whereas it decreased phosphorylation of p70 ribosomal protein S6 kinase (p70S6K), a downstream target of mammalian target of rapamycin (mTOR). Of note, GW9662 did not affect the phosphorylation of AMPKalpha and p70S6K protein. The inhibitory effect of rosiglitazone on NSCLC cell growth was enhanced by the mTOR inhibitor rapamycin; however, it was blocked, in part, by the AMPKalpha small interfering RNA. Taken together, these findings show that rosiglitazone, via up-regulation of the PTEN/AMPK and down-regulation of the Akt/mTOR/p70S6K signal cascades, inhibits NSCLC cell proliferation through PPARgamma-dependent and PPARgamma-independent signals.     

PI3K与ERK1/2信号传导通路在吡格列酮保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制

目的研究PI3K与ERK1/2信号传导通路在吡格列酮介导大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制。方法取一日龄Wistar大鼠乳鼠心室肌细胞进行体外培养,建立缺血再灌注损伤模型。分正常对照组(Co组)、缺血再灌注组(Ⅰ组)、Ⅰ组+吡格列酮预处理组(Pi组)、Pi组+PI3K特异性抑制剂LY294002组(Pi+LY组)。采用免疫细胞化学法检测细胞内ERK1/2、p-ERK1/2的分布与变化,Western-bloting检测细胞内p-ERK1/2蛋白表达水平变化。结果免疫细胞化学法结果显示各组ERK变化不大(P>0.05);免疫细胞化学法和Western-bloting结果显示Pi组p-ERK1/2的表达水平高于Ⅰ组(P<0.05),此变化被LY294002抑制(P<0.05);Ⅰ组p-ERK1/2的表达比Co组多,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论吡格列酮通过PI3K/ERK1/2信号通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤起保护性作用。     

胰岛素急性刺激对 PI3K／Akt 和 ERK 通路的分子调节作用

【目的】研究胰岛素（insulin）急性刺激对PI3K/Akt和ERK信号的调节作用及其意义。【方法】HepG2细胞、6只8周龄BALB/C雄性小鼠分别都给予急性胰岛素刺激和磷酸盐缓冲液（PBS）刺激,细胞提取总蛋白、小鼠提取肝组织总蛋白用 Western blotting 法分析 Akt磷酸化水平和 ERK 磷酸化水平,并用免疫沉淀法检测TERT磷酸化水平。【结果】胰岛素急性刺激组 HepG2细胞和肝组织p-Akt、p-ERK水平均较PBS组上调,抑制PI3K/Akt信号通路后 TERT 活性下降。【结论】胰岛素急性刺激可以激活 PI3K/Akt和 ERK信号通路,抑制PI3K/Akt通路可减弱端粒酶活性,这可能为临床肝癌的诊断与治疗提供依据。