空肠弯曲菌CadF蛋白的原核表达与产物分析

目的构建空肠弯曲菌cadF基因重组表达质粒pET30a(+)-cadF,分析其在大肠埃希菌中的表达情况及其融合蛋白的抗原性。方法用PCR方法扩增cadF基因,构建重组克隆质粒和表达质粒,经菌落PCR、双酶切和测序鉴定后在E.coli(DE3)原核表达系统中诱导表达,SDS-PAGE和飞行时间质谱鉴定表达蛋白,Western blot分析其抗原性。结果含重组表达载体pET-30a(+)-cadF中的cadF基因序列经测序证实与出发菌株cadF基因序列100%同源,并成功诱导表达CadF蛋白,Westernblot显示该CadF融合蛋白能被抗空肠弯曲菌多克隆兔血清识别。结论成功构建了空肠弯曲菌cadF基因重组表达载体,表达产物具有抗原性。     

弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及免疫分析

目的 克隆刚地弓形虫ROP18基因,进行原核表达及重组蛋白的免疫分析。方法 提取弓形虫RH株基因组DNA,经PCR获得ROP18基因片段,经双酶切分别连入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+),构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测。结果 PCR得到约1 665 bp目的基因片段,单、双酶切及PCR鉴定结果显示成功构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18;经IPTG诱导后,ROP18基因在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,pET28a-ROP18在相对分子质量约60 kD的位置出现目的蛋白条带,pET32a-ROP18在相对分子质量约83 kD的位置出现目的蛋白条带,均与理论值相符;Western-blot结果显示重组蛋白与弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性。结论 成功克隆和表达了ROP18基因,所表达的重组蛋白具有免疫效应,为其功能研究奠定基础。     

小鼠瘦素基因的原核表达及产物纯化

目的 应用大肠杆菌表达系统进行小鼠瘦素基因的克隆、表达、产物纯化与鉴定.方法应用聚合酶链扩增技术,以含有小鼠瘦素cDNA序列的质粒pMET mouse leptin为模板,扩增后克隆至载体pET-28a(+)构建重组表达载体pET-28a-lep,酶切、测序正确后,转化大肠杆菌E. coli BL21,构建工程菌株BL21-pET-lep.使用0.1mmol/L异丙基-硫代半乳糖苷,在不同的时间段诱导蛋白表达,利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳和Western Blotting检测瘦素蛋白的分子质量以及最佳表达时间.使用0.5%十二烷基肌氨酸钠溶解包涵体后通过Ni2+亲和层析柱纯化.结果 正确构建了表达载体pET-28a-lep.0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导BL21-pET-lep 6 h具有最高蛋白表达量,含量占菌体总蛋白的39.2%.SDS-PAGE以及Western Blotting检测显示所表达的小鼠瘦素为携带组氨酸标签的融合蛋白,分子质量约为22.5 kDa.使用Ni2+层析柱纯化后的蛋白纯度为1.086 g/L.结论 应用大肠杆菌原核表达系统成功进行了小鼠瘦素基因的克隆、表达、产物纯化与鉴定.     

鼠疫耶尔森氏菌caf1和pH6基因的原核表达

目的利用DNA重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌caf1及p H6抗原基因。方法利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中表达鼠疫菌重要功能蛋白caf1及p H6蛋白,根据云南玉龙菌株(D106004)全基因组序列设计引物,PCR扩增目的基因片段;采用p ET-32a(+)作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒;IPTG诱导,使重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中表达。结果根据酶切鉴定和PCR产物测序结果显示,目的基因caf1及p H6已成功连接到表达载体p ET-32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物的相对分子质量约为34.2 ku和35.5 ku,与理论分子量一致。结论成功克隆并构建了p ET32a-caf1及p ET32a-p H6重组基因原核表达系统,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

小鼠Lewis肺癌细胞与旋毛虫相关抗原基因sHSPs的原核表达及鉴定北大核心CSCD

目的对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞与旋毛虫(Trichinella spiralis)相关抗原基因sHSPs进行原核表达,对表达产物进行抗原性鉴定。方法利用噬菌体文库展示技术筛选旋毛虫与LLC细胞相关抗原基因并分析,获得sHSPs(DQ 986457)基因。以旋毛虫cDNA为模板,PCR扩增sHSPs基因,连接至表达载体pET-32a(+)后转化入感受态BL21(DE3),以IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。结果重组表达质粒pET-32a(+)-sHSPs经双酶切及测序鉴定证明克隆载体构建正确,SDS-PAGE检测其表达重组蛋白相对分子质量约为36×10~3。Western blot检测重组蛋白可被抗LLC细胞多抗血清识别。结论成功构建了pET-32a(+)-sHSPs克隆载体,其表达的重组蛋白可与抗LLC细胞多抗血清反应即具有反应原性,为该蛋白的研究奠定了基础。     

刚地弓形虫Peroxiredoxin多克隆抗体的制备及鉴定

目的 原核表达刚地弓形虫过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxin,Prx)并制备多克隆抗体。方法 PCR技术扩增弓形虫cDNA中的prx基因,克隆至pET-28a(+)载体,构建prx/pET-28a(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)Rosetta中诱导表达。亲和层析纯化重组Prx蛋白,并制备兔多克隆抗体,蛋白印迹技术对多克隆抗体进行鉴定。结果 成功从弓形虫cDNA中扩增出prx目的基因,构建了prx/pET-28a(+)重组质粒,获得抗Prx重组蛋白的多克隆抗体。蛋白印迹技术检测出弓形虫Prx的特异性条带。结论 重组弓形虫Prx制备的多克隆抗体能检测Prx在弓形虫速殖子表达。     

小鼠Lewis肺癌细胞与旋毛虫相关抗原基因sHSPs的原核表达及鉴定

目的对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞与旋毛虫(Trichinella spiralis)相关抗原基因sHSPs进行原核表达,对表达产物进行抗原性鉴定。方法利用噬菌体文库展示技术筛选旋毛虫与LLC细胞相关抗原基因并分析,获得sHSPs(DQ 986457)基因。以旋毛虫cDNA为模板,PCR扩增sHSPs基因,连接至表达载体pET-32a(+)后转化入感受态BL21(DE3),以IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。结果重组表达质粒pET-32a(+)-sHSPs经双酶切及测序鉴定证明克隆载体构建正确,SDS-PAGE检测其表达重组蛋白相对分子质量约为36×10~3。Western blot检测重组蛋白可被抗LLC细胞多抗血清识别。结论成功构建了pET-32a(+)-sHSPs克隆载体,其表达的重组蛋白可与抗LLC细胞多抗血清反应即具有反应原性,为该蛋白的研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原SAG3基因的克隆与表达

目的克隆表达弓形虫RH株SAG3基因,为深入研究其结构及功能奠定基础。方法从弓形虫RH株基因组DNA中特异性扩增出编码SAG3基因的片段,相应酶切后克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建pET-SAG3重组质粒。将pET30-SAG3重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经EcoRⅠ、Hind III酶切及测序鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。结果体外扩增的SAG3基因片段与目的片段大小相符约1 155bp,成功构建了重组表达质粒pET30-SAG3,SDS-PAGE、Western blot显示SAG3-His融合蛋白的分子量大小约为50kd。结论弓形虫表面抗原SAG3基因在大肠杆菌中成功表达,为进一步研究SAG3的结构和功能奠定基础。     

幽门螺杆菌GGT基因在胃癌上皮细胞中的表达和定位

目的:克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)基因,实现GGT基因在人胃癌上皮细胞SGC-7901中的表达和定位.方法:本实验从胃癌患者胃黏膜组织中分离培养获得H.pylori,提取其基因组DNA,对GGT基因进行PCR扩增,将利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合GGT基因全长序列和成熟肽序列,克隆进pcDNA3质粒中,观察GGT基因表达后在人胃癌上皮细胞SGC-7901中的定位,观察SGC-7901细胞形态、生长以及运动性的变化.推测其可能诱导细胞凋亡的途径.结果:pcDNA3-GGT-EGFP质粒转染SGC-7901细胞后,在SGC-7901细胞中表达外源基因,在显微镜下可见转染的细胞产生明显的病变,细胞由梭形变成圆形、变大、胞核扩大.转染60 h后,在共聚焦显微镜下观察,发现荧光信号主要集中在细胞质中.结论:成功克隆了GGT基因,经酶切和测序验证正确,成功构建了pcDNA3-GGT-EGFP质粒.     

胃癌MG-7抗原模拟表位与HSP70融合基因的构建及表达

目的构建和表达胃癌MG7模拟表位与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法采用加端PCR的方法,将MG7模拟表位(GC23)的编码序列融合到HSP基因的3′端;PCR获得的融合基因片段经TA克隆法克隆到pUCm-T载体上,并进行DNA测序;将融合基因片段从pUCm-T载体上酶切后,亚克隆到表达载体PET-21a(+)上;将重组质粒PET-21a(+)/GC23-hsp转化大肠杆菌,经IPTG诱导后,收集细菌,菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测结果应用PCR方法扩增出约2.0kb的目的片段,序列测定结果证实,模拟表位GC23序列成功地融合到HSP70基因的3′端,GC23及HSP70基因序列均正确;经EcoRⅠ+XhoⅠ酶切及PCR鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体PET-21a(+)上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SSS-PAGE发现在Mr为72000处有表达量明显增多的蛋白条带,Western blot证实,Mr72000处的条带为目的条带.结论成功构建并表达了MG7模拟表位与HSP70的融合基因.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

目的 通过对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hipylori)尿素酶B亚单位在大肠杆菌中表达的研究，探索其免疫反应性。方法 用高保真PCR方法扩增H.pylori ureB基因，并定向克隆人pNEB193中，然后经酶切回收后插入原核表达载体pMAL-C2X进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果 特异PCR和酶切鉴定证实融合基因ureB克隆人表达载体，SDS-PAGE结果显示ureB在大肠杆菌中以融合蛋白形式MBP-ureB高效表达，约占细胞总蛋白量的26.7%。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清发生特异反应。结论 成功构建了高效表达H.pylori ureB的重组菌，为Hp基因工程疫苗的进一步研究奠定了基础。     

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的对微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因进行克隆、表达和反应原性分析。方法以微小隐孢子虫总RNA逆转录的cDNA为模板,克隆S-dsRNA基因,并转化至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET-28a(+)-S,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白与鼠抗微小隐孢子虫阳性血清的反应原性。结果 PCR和双酶切鉴定表明,重组质粒pET-28a(+)-S构建成功。SDS-PAGE结果显示,37℃下经1mmol/L IPTG诱导4h,重组蛋白表达量最大。重组蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为37000,与预期大小一致,重组蛋白约占蛋白总量的72.6%。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能识别抗微小隐孢子虫阳性鼠血清。结论微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因表达成功,重组蛋白具有反应原性。     

巨型艾美耳球虫ADF基因的克隆及原核表达

目的克隆巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)的ADF基因,并进行原核表达。方法采用RT-PCR方法扩增ADF基因,并将其与原核表达载体pET-28a连接,构建原核表达载体pET-28a-ADF,转化入大肠埃希菌Rossata(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定结果正确。表达分子质量单位为17ku的融合蛋白。Western blot检测融合蛋白能被抗E.maxima多克隆抗体识别。结论构建的原核表达载体pET-28a-ADF能表达具有反应原性的蛋白,为其免疫原性研究奠定了基础。     

猪囊尾蚴cDNA文库的筛选与重组蛋白的初步鉴定

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中免疫学筛选阳性蛋白的编码基因,以期获得囊尾蚴病新的免疫学诊断候选分子。方法免疫学筛选cDNA文库,用PCR法扩增出猪囊尾蚴候选蛋白基因编码序列,T载体连接,鉴定后将其亚克隆入pET28a(+)载体中,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21并用IPTG对该重组菌诱导表达,SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。结果通过cDNA文库免疫筛选、测序和EXPASY软件分析,其一个684bp ORF DNA序列为新基因(命名为Ts1),录入号为EU009656;将Ts1基因克隆入pET28a(+)载体中诱导表达,可得到一分子量约28.0kDa融合蛋白,并能被囊尾蚴病人血清识别。结论本试验成功筛选、克隆出一个新囊尾蚴编码基因,并在原核细胞中表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

日本血吸虫四跨膜蛋白6编码基因的克隆、表达与鉴定

目的 为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Tsp6样融合蛋白。 方法 设计特异性引物,PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Tsp6样蛋白基因编码基因序列,T载体连接,再将其亚克隆入pET28a(+)表达载体,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21中,并用IPTG对该重组菌诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。 结果 PCR法扩增出一条大小约为702bp大小的Sj-Tsp6样蛋白的DNA片断,将目的基因转入表达质粒pET28a(+),经SDS-PAGE可见一条约28kDa大小的带有HIS标签的融合蛋白条带,此蛋白可被血吸虫病兔血清所识别。 结论 本实验成功克隆日本血吸虫Sj-Tsp6 样抗原的编码基因,并在原核细胞中进行表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7外膜蛋白A的表达、鉴定和纯化

目的 构建肠出血性大肠埃希菌O157∶H7外膜蛋白A基因重组质粒,研究其在大肠埃希菌中的表达情况. 方法 用RT-PCR法从肠出血性大肠埃希菌O157∶H7菌株克隆OmpA基因,构建重组质粒pET-30a (+)-OmpA,经双酶切及基因测序鉴定后在E.coli BL21(DE3)原核表达系统中诱导OmpA的表达,通过蛋白质电泳技术检测蛋白的表达,用Western blot法测定和分析免疫反应性. 结果 获得的目的 基因为1 041 bp,与预期值相符,测序结果与GenBank公布序列的同源性达100%,重组质粒pET-30a (+)-OmpA在原核系统下可表达OmpA, Western blot分析His-Tag单抗能与OmpA(His-Tag)发生免疫反应. 结论 OmpA重组质粒构建成功,表达产物具有抗原性.     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP基因的克隆表达及蛋白结构分析

目的 利用大肠杆菌对C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白(Impact-like protein)进行克隆表达,运用生物信息学软件进行蛋白结构分析。方法 提取C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA,PCR扩增ILP基因,构建pGM-T重组载体,挑选阳性克隆并进行序列分析;将ILP基因连入原核表达载体pET-28a(+),并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。运用PSIPRED和SWISS-MODEL进行蛋白结构分析。结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-ILP,该基因全长831 bp。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白条带出现在相对分子量约33 kD的位置,与预期相符。Western blot结果表明,大肠杆菌成功表达了重组蛋白。结论 成功克隆、表达并分析C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白,为蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白结构与功能的研究提供了有价值的资料。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP基因的克隆表达及蛋白结构分析北大核心CSCD

目的利用大肠杆菌对C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白(Impact-like protein)进行克隆表达,运用生物信息学软件进行蛋白结构分析。方法提取C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA,PCR扩增ILP基因,构建pGM-T重组载体,挑选阳性克隆并进行序列分析;将ILP基因连入原核表达载体pET-28a(+),并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。运用PSIPRED和SWISS-MODEL进行蛋白结构分析。结果成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-ILP,该基因全长831bp。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白条带出现在相对分子量约33kD的位置,与预期相符。Western blot结果表明,大肠杆菌成功表达了重组蛋白。结论成功克隆、表达并分析C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白,为蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白结构与功能的研究提供了有价值的资料。     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

蓝氏贾第鞭毛虫胞外核酸酶的表达纯化和活性鉴定

目的 克隆、原核表达蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,贾第虫)的胞外核酸酶编码区,并对其蛋白产物进行活性鉴定。方法 对贾第虫胞外核酸酶(GeNuc)蛋白进行生物信息学分析,根据分析结果以C2株贾第虫基因组DNA为模板扩增获得GeNuc去信号肽段编码区序列,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),将酶切和测序验证正确的重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定蛋白产物。Ni-NTA亲和层析纯化GeNuc蛋白,经复性后验证其对质粒DNA的水解能力。结果 成功克隆了长约800 bp的GeNuc编码区并构建了原核表达载体pET-28a(+)-GeNuc,测序结果显示C2株GeNuc序列与WB株相同;在大肠杆菌中诱导表达获得了相对分子量约30.8 kDa的融合蛋白;复性后的纯化GeNuc蛋白具有降解双链DNA的能力,但活性较商品化DNaseⅠ低。结论 证明了GeNuc的存在,为GeNuc抗体的制备及贾第虫致病机制的研究提供了实验材料。