microRNA134对胶质瘤U87细胞增殖及侵袭的影响

目的研究微小RNA-134(miRNA-134)对人脑胶质瘤细胞系U87在侵袭、迁移方面的作用并探讨可能的作用机制。方法通过人工合成miR-134 mimic瞬时转染脑胶质瘤细胞系U87,实时定量荧光聚合酶链式反应(PCR)检测细胞miR-134的表达水平;并通过四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;Transwell小室法检测各组U87细胞株迁移和侵袭能力;实时定量荧光PCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测各组基质金属蛋白酶3(MMP-3)的表达水平。统计学数据处理釆用SPSS 19.0软件处理,组间比较采用单因素方差分析,P0.05有统计学意思。结果荧光显微镜下观察转染效率90%以上,实时定量荧光PCR结果显示与未处理的空白对照组(control)及空白转染组(Mock)比较,miR-134转染组的miR-134表达水平明显上调,可达到对照组的5~6倍(P0.05);MTT实验结果表明miR-134转染组细胞增殖能力明显下降(P0.05),同时Transwell实验也显示miR-134转染组细胞的迁移能力明显降低(P0.05);实时定量荧光PCR及Western blot分析MMP-3表达情况发现,过表达miR-134可以明显减少MMP-3基因及蛋白的表达水平(P0.05)。结论本研究表明miR-134能够抑制胶质瘤U87细胞的增殖及侵袭迁移能力,其机制可能与抑制MMP-3的表达有关,提示miR-134可能成为胶质瘤治疗的新靶点。     

敲低IKKε抑制人胶质瘤细胞U251增殖和侵袭的体外研究

目的 探究敲低IKKε表达对人胶质瘤细胞系U251生物学特征的影响. 方法 采用脂质体介导的IKKε小干扰RNA(IKKε siRNA)转染U251细胞,同时设转染无义序列组和对照组,RT-PCR鉴定转染后IKKε mRNA的表达;MTT法检测转染后细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞周期分布的改变;Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化;Western blotting法检测核增殖抗原(PCNA)、细胞周期素D1 (Cyclin D1)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)和NF-κB P65的表达. 结果 与对照组和无义序列组比较,转染IKKε siRNA组细胞IKKε mRNA的表达和细胞增殖率降低,G0/G1期细胞比例增高,穿膜细胞数明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blotting检测结果显示IKKε siRNA组细胞PCNA、MMP9、Cyclin D1的表达较对照组和无义序列组明显下调,而且NF-κB组分P65从胞浆向胞核的转座减少. 结论 IKKε在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,有望成为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

过表达miR-21通过PI3K-AKT 通路抑制替莫唑胺对胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用

目的 探讨miR-21 过表达在替莫唑胺(TMZ)诱导胶质瘤U87 细胞增殖中的作用及其机制,明确miR-21 过表达在替莫唑胺临床治疗胶质瘤耐药中的作用.方法 Pre-miR-21 过表达载体转染U87 细胞,通过形态学观察,噻唑蓝(MTT)试验检测细胞增殖情况.Western 印迹验证Akt 和p-Akt 表达及检测PI3K 活性.结果 替莫唑胺可显著抑制U87 细胞生长,下调Akt 和p-Akt 表达及抑制PI3K 活性.U87 细胞预转染pre-miR-21 过表达载体后,替莫唑胺的这种效应可部分被miR-21 过表达所抑制.结论 miR-21 过表达可通过活化PI3K-AKT 通路部分抑制替莫唑胺诱导的U87 细胞凋亡,提示胶质瘤中miR-21 过表达可能是替莫唑胺临床治疗胶质瘤药物抵抗的一大新的因素.     

小分子干扰RNA沉默GLI1基因抑制U87胶质瘤细胞的增殖

目的通过研究小分干扰RNA(siRNA)沉默胶质瘤相关癌基因1(GLI1)后对U87胶质瘤细胞的细胞增殖的影响。 方法通过合成并转染siRNA抑制U87细胞内GLI1的表达,并记为GLI1 siRNA组,转染无意义的siRNA和未转染siRNA的细胞作为对照组。采用MTT法分析各组U87细胞的增殖,采用流式细胞技术分析各组细胞周期变化。 结果Western blotting结果显示,与对照组和空白对照组相比,实验组U87细胞内GLI1的表达量显著下降(P<0.05);MTT实验发现,U87细胞的活性与阴性对照组和空白对照组相比显著下降,并且随着培养时间的延长,细胞的活性下降程度越明显(P<0.05);通过流式细胞术分析细胞周期显示,与对照组相比,实验组U87细胞的细胞周期被阻滞于G1期,并且其S期细胞的数量明显下降(P<0.05)。 结论抑制GLI1的表达可有效抑制U87胶质瘤细胞的增殖,提示GLI1可作为胶质瘤的一种潜在治疗靶点。     

RhoE表达上调抑制U87细胞增殖与侵袭

目的探讨RhoE在胶质瘤发生发展过程中的作用。方法将包含RhoE基因的质粒转染U87细胞后,采用四唑盐（MTr）法检测细胞增殖能力的变化;Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力的改变;Westernblot分析细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2和-9的表达变化。结果RhoE蛋白在U87和U251细胞系中表达明显低于正常人脑胶质细胞;上调RhoE表达,U87细胞增殖和侵袭能力明显下降（P〈0．05）;Westernbolt检测显示上调RhoE表达能够降低U87细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平（P〈0．05）。结论上调RhoE的表达能够抑制胶质瘤U87细胞的增殖和侵袭能力。     

下调RNA甲基化酶NSUN2表达对脑胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的 探讨下调NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2(NSUN2)表达对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响。方法体外培养正常胶质细胞HEB、胶质瘤细胞系（A172、U251、U87）,免疫印迹法检测NSUN2蛋白表达水平;用shNSUN2慢病毒（sh-NSUN2组）及shRNA scramble慢病毒（sh-CON组）感染U87细胞下调NSUN2表达,用CCK-8法检测细胞增殖活力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移。结果 与正常胶质细胞HEB相比,胶质瘤细胞系A172、U251、U87的NSUN2蛋白表达量均明显增高（P<0.05）。与sh-CON组比较,sh-NSUN2组NSUN2蛋白表达水平、细胞增殖活力、侵袭能力和迁移能力均明显降低（P<0.05）。结论 胶质瘤NSUN2呈高表达,下调其表达明显抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移。     

芹菜素对脑胶质瘤细胞U87增殖、侵袭及迁移能力的影响

目的 探讨芹菜素对脑胶质瘤U87细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及作用机制。方法 体外培养脑胶质瘤U87细胞,加入20、40、80 μmol/L芹菜素干预,以培养基作为空白对照组。使用MTT法检测U87细胞的增长抑制率,使用Hocst染色法观察细胞凋亡情况;使用Transwell检测U87细胞侵袭能力;划痕实验法检测U87细胞迁移能力;使用免疫印迹法检测U87细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、Bak1、Caspase-3表达水平。结果 与空白对照组比较,芹菜素组细胞抑制率显著增加（P<0.05）、细胞凋亡数目明显增加（P<0.05）、细胞侵袭数目显著下降（P<0.05）、细胞迁移数目明显减少（P<0.05）,U87细胞MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表达显著下降（P<0.05）,Caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.05）;而且均呈浓度依赖性。结论 芹菜素可有效抑制脑胶质瘤U87细胞增殖、促进凋亡,可能与下调MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表达水平,上调Caspase-3表达有关。     

TIMP-2基因对人脑胶质瘤U87细胞周期与增殖的影响

目的探讨金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-2)对人脑胶质瘤细胞的抑制作用,主要是对细胞周期与细胞增殖的作用.方法用含TIMP-2基因的重组腺病毒载体,体外转染人胶质瘤细胞系U87,用Western blot检测目的蛋白的表达.通过细胞生长实验,流式细胞仪分析技术检测U87转染前后细胞增殖、周期与凋亡的变化.结果转染AdTIMP-2病毒后的U87细胞TIMP-2蛋白表达上调,转染后对U87细胞的生长有抑制作用,并出现明显的G0 -G1 期阻滞,但无明显的细胞凋亡峰出现.结论重组腺病毒载体介导的TIMP-2基因在体外对人脑胶质瘤细胞系U87 的生长有抑制作用,可作为胶质瘤治疗的有效工具.     

lncRNA ZNF674-AS1过表达对胶质瘤U87细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）ZNF674-AS1过表达对胶质细胞瘤增殖、侵袭、迁移的影响。方法 体外培养正常星形胶质细胞（HA1800）和胶质瘤细胞（A172、U251、U87、U373）,RT-PCR检测lncRNA ZNF674-AS1表达水平。将ZNF674-AS1 mimics转染U87细胞上调ZNF674-AS1表达,以转染阴性对照序列为对照,CCK8法检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力。Starbase软件预测lncRNA ZNF674-AS1靶基因并应用双荧光素酶报告基因实验验证。结果 与正常星形胶质细胞（HA1800）比较,胶质瘤细胞（A172、U251、U87、U373）lncRNA ZNF674-AS1的表达水平均明显降低（P<0.05）,其中U87细胞表达水平最低。上调U87细胞lncRNA ZNF674-AS1表达,明显抑制U87细胞增殖、侵袭、迁移能力（P<0.05）。Starbase软件预测显示lncRNA ZNF674-AS1与性别决定区 Y 框蛋白 9（SOX9）基因有结合位点,双荧光素酶报告基因实验结果显示,SOX9基因是lncRNA ZNF674-AS1靶基因。上调U87细胞lncRNA ZNF674-AS1表达的同时沉默SOX9基因表达,明显增强U87细胞增殖、侵袭和迁移能力（P<0.05）。结论 胶质瘤lncRNA ZNF674-AS1呈低表达,可能通过靶向下调SOX9基因表达,促进胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移。     

PIAS3过表达抑制人脑胶质瘤U251细胞生长

目的 探讨PIAS3 过表达对人脑胶质瘤U251 细胞生长的作用及其可能的机制.方法 通过实时荧光定量PCR 检测PIAS3 在正常脑细胞和脑胶质瘤U251 细胞中的表达情况.转染PIAS3 过表达载体,提高U251 细胞中PIAS3 表达水平,通过噻唑蓝(MTT)试验检测细胞增殖情况.Western Blot 验证PIAS3 表达与增殖相关基因PI3K 及Akt 间关系.结果 PIAS3 在正常脑组织中相对高表达,而在人脑胶质瘤U251 细胞中表达明显下降(P ＜0.01).体外转染PIAS3 过表达载体能明显抑制U251 细胞生长,并且有效抑制PI3K 活性及p-Akt 表达,但对总的Akt 无明显影响.结论 胶质瘤U251 细胞中异常低表达的PIAS3 发挥着重要的增殖促进作用,过表达PIAS3 可通过抑制PI3K/Akt 通路有效抑制U251 细胞增殖.     

替莫唑胺通过TFRC抑制U87胶质瘤细胞增殖和侵袭

目的 探讨转铁蛋白受体（TFRC）在替莫唑胺抑制U87胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用。方法 体外培养U87胶质瘤细胞,加入50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L替莫唑胺作用;构建control siRNA、siTFRC转染U87细胞沉默TFRC表达,构建pcDNA3.1空载体、pcDNA3.1/TFRC转染U87细胞过表达TFRC;利用CCK-8方法检测U87细胞增殖;利用Transwell小室实验检测U87细胞侵袭能力;实时荧光定量PCR和免疫印迹法检查U87细胞TFRC mRNA和蛋白表达。结果 与空白组相比,替莫唑胺处理后,U87细胞的增殖和侵袭能力显著下降（P<0.05）,TFRC mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,当替莫唑胺浓度为200 μmol/L时,对U87细胞的抑制能力最强（P<0.05）。当利用pcDNA3.1/TFRC过表达U87细胞TFRC处理后,替莫唑胺对U87细胞增殖和侵袭的抑制能力显著下降（P<0.05）;而当利用siTFRC沉默U87细胞TFRC表达后,替莫唑胺对U87细胞增殖和侵袭的抑制能力显著增强（P<0.05）。结论 替莫唑胺可能通过抑制TFRC的表达而抑制U87胶质瘤细胞的增殖和侵袭。     

下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养U87细胞,转染pEGFP-BAG3-shRNA质粒构建BAG3低表达胶质瘤U87细胞株（低表达组）,转染pEGFP-shRNA对照质粒为对照组;利用RT-PCR和免疫印迹法鉴定;利用CCK8和EdU检测U87细胞增殖,利用流式细胞术检测U87细胞凋亡。结果 与对照组相比,RT-PCR和免疫印迹法检测结果显示低表达组BAG3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）,低表达组24、48、72 h细胞增殖水平均明显降低（P<0.05）,低表达组细胞凋亡率明显增高（P<0.05）。结论 下调胶质瘤U87细胞BAG3表达显著抑制其增殖、促进其凋亡。     

miR-23c靶向调控MTDH抑制胶质瘤U87细胞增殖迁移与侵袭

目的探讨miR-23c对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响及初步机制。方法将miR-23c mimics转染于U87细胞中,用miR-无关序列转染于U87细胞做为Control组,采用MTT法、细胞划痕、Transwell侵袭实验观察miR-23 c对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响;采用生物信息学软件分析miR-23c潜在的靶基因;采用Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测miR-23c对靶基因的调控作用;在转染miR-23c mimics的基础上同时转染MTDH质粒,通过MTT法、细胞划痕、transwell侵袭实验观察转染MTDH对miR-23c抑制U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 MTT实验显示,miR-23 c组U87细胞的OD值为(0. 668±0. 032),明显低于Control组的(1. 031±0. 060)(P 0. 01);细胞划痕实验显示,miR-23c组细胞划痕愈合率(0. 35±0. 02)明显低于对照组的(0. 59±0. 03)(P 0. 01); Transwell侵袭实验显示,miR-23 c组U87细胞穿过基质胶的细胞数(153. 2±8. 30)明显低于与对照组的(348. 4±12. 12)(P 0. 01); Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测表明MTDH是miR-23 c直接调控的靶基因; MTT实验显示,miR-23 c+MTDH组U87细胞的OD值为(1. 025±0. 059),明显高于miR-23 c组的(0. 672±0. 024)(P 0. 01);细胞划痕实验显示,miR-23 c+MTDH组细胞划痕愈合率为(0. 45±0. 04),明显高于miR-23 c组的(0. 31±0. 03)(P 0. 05); Transwell侵袭实验显示,miR-23c+MTDH组U87细胞穿过基质胶的细胞数(260. 9±10. 23),明显高于miR-23c组的(148. 4±9. 4)(P 0. 01)。结论上调miR-23 c能明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与其下调MTDH表达有关。     

miR-23c靶向调控MTDH抑制胶质瘤U87细胞增殖迁移与侵袭

目的 探讨miR-23c对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响及初步机制。方法 将miR-23c mimics转染于U87细胞中,用miR-无关序列转染于U87细胞做为Control组,采用MTT法、细胞划痕、Transwell侵袭实验观察miR-23c对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响;采用生物信息学软件分析miR-23c潜在的靶基因;采用Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测miR-23c对靶基因的调控作用;在转染miR-23c mimics的基础上同时转染MTDH质粒,通过MTT法、细胞划痕、transwell侵袭实验观察转染MTDH对miR-23c抑制U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 MTT实验显示,miR-23c组U87细胞的OD值为（0.668±0.032）,明显低于Control组的（1.031±0.060）（P<0.01）;细胞划痕实验显示,miR-23c组细胞划痕愈合率（0.35±0.02）明显低于对照组的（0.59±0.03）（P<0.01）;Transwell侵袭实验显示,miR-23c组U87细胞穿过基质胶的细胞数（153.2±8.30）明显低于与对照组的（348.4±12.12）（P<0.01）;Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测表明MTDH是miR-23c直接调控的靶基因;MTT实验显示,miR-23c+MTDH组U87细胞的OD值为（1.025±0.059）,明显高于miR-23c组的（0.672±0.024）（P<0.01）;细胞划痕实验显示,miR-23c+MTDH组细胞划痕愈合率为（0.45±0.04）,明显高于miR-23c组的（0.31±0.03）（P<0.05）;Transwell侵袭实验显示,miR-23c+MTDH组U87细胞穿过基质胶的细胞数（260.9±10.23）,明显高于miR-23c组的（148.4±9.4）（P<0.01）。结论 上调miR-23c能明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与其下调MTDH表达有关。     

MiR-181c对人脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的作用

目的观察miR-181c对人脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响,进一步探讨miR-181c的生物学功能。方法化学合成miR-181c,脂质体转染U251细胞。应用cck-8法和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡。结果miR-181c上调后对U251细胞具有抑制作用,且呈明显的剂量依赖性,而对照组无明显抑制作用。结论化学合成的miR-181c在人脑胶质瘤细胞增殖和凋亡过程中发挥重要作用,可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

MicroRNA-134靶向下调Nanog影响胶质瘤细胞增殖和凋亡研究

目的 探讨微小RNA-134(microRNA-134,miR-134)靶向下调Nanog基因对胶质瘤细胞增殖和凋亡水平的影响.方法 建立稳定表达miR-134的胶质瘤细胞株,通过逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)法分别检测细胞中Nanog的mRNA和蛋白水平改变;四唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖水平改变;流式细胞术和透射电镜检测细胞凋亡变化.结果 建立稳定表达miR-134的胶质瘤细胞株;miR-134高表达的胶质瘤细胞中Nanog的mRNA和蛋白表达水平显著下调;miR-134高表达的胶质瘤细胞增殖水平下降、细胞凋亡增加.结论 胶质瘤细胞中miR-134高表达可下调靶基因Nanog的mRNA和蛋白水平,从而抑制胶质瘤细胞增殖,并诱导细胞凋亡增加.