反向遗传学技术及其应用

反向遗传学是直接从遗传物质入手来研究生命现象与规律的,其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。文章从拯救病毒和创造新型病毒、负股RNA病毒的研究、动植物基因功能的研究以及利用RNA干扰使基因沉默等方面,对反向遗传学技术的应用进行了评述,并对其前景进行了阐述。     

流感病毒诊断方法的研究进展

流行性感冒病毒属于正黏病毒科,是一类带包膜、分节段的单股负链RNA病毒,可分为甲、乙、丙三型.其中甲型和乙型流感病毒基因组均含有8个RNA片段,分别编码PB1,PB2,PA,HA,NA,NP,Ml,M2,NS1,NS2(NEP)共10种蛋白;     

反向遗传操作技术在流感病毒中的应用研究

反向遗传操作技术(reverse genetics, RG)是近年来比较热门的一门技术,该技术可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,然后通过拯救病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果,从而可以对病毒基因组表达调控机制、病毒致病的分子机理等进行研究.我们通过对近年来国外有关文献的回顾,希望能够正确看待病毒拯救技术的利弊,注意生物安全性,希望能够为防治可能发生的流感病毒流散和传播提供新的思路.     

流感病毒的分子生物学研究进展

流感病毒是分节段的负链RNA病毒,由RNA依赖的RNA聚合酶起始病毒的复制。流感病毒的特殊基因组结构和病毒蛋白的功能使其极易发生抗原转换和抗原漂移,这使得病毒能够逃避多种宿主的长效中和性免疫反应。本文从病毒结构、基因组及其编码蛋白质、病毒复制过程和病毒的易感宿主等几方面论述了流感病毒的分子生物学研究进展。     

动物RNA病毒反向遗传学操作技术研究进展

反向遗传学(Reverse genetics)就是通过人为地改变生物体或生物大分子的基因型,考察其表型或者生物学特性是否发生改变以及如何改变,从而揭示该基因与表型的关系.     

流感病毒反向遗传技术合成rH5/PR8融合病毒的生物学活性

目的 探讨用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合病毒株的生物学活性,对人工合成的融合流感病毒株进行全面、系统地研究,对其作为疫苗株的可行性、有效性提供科学依据,方法用流感病毒反向遗传技术合成rH5/PR8减毒病毒株,测定5代病毒与原代病毒HA基因序列,确认外来基因的遗传稳定性;用细胞实验确认其增殖性,用动物实验确认其致病性的强弱.结果 人工合成的rH5/PR8融合病毒株除HA外,均来自A/PR/8/34(PR8),HA来自H5N1型强致病性禽流感病毒,第1050碱基从G定点突变成C,导致344号氨基酸从精氨酸变为苏氨酸,并剪除第1054～1065碱基,致使第346～349的碱性氨基酸(RKKR)部位被去除.该病毒的增殖能力可以达到109 PFU/ml,外来基因HA5基因遗传稳定、不易变异,达到疫苗株的要求;鸡脑内即静脉接种活病毒实验证实病毒呈现弱毒性结论用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合病毒株有良好的增殖性及基因遗传稳定性,用基因剪切技术对HA的碱性氨基酸连续序列的敲除可以减低病毒的致病性.对鸡呈现弱毒性.     

流感病毒反向遗传技术合成rH5/PR8融合病毒的免疫学相关研究

目的 研究用流感病毒反向遗传技术合成的Rh5/PR8融合病毒株的免疫学特性,为人工合成的融合流感病毒株,作为疫苗株的免疫性、有效性、稳定性及可持续性提供科学数据.方法 用流感病毒反向遗传技术合成减毒Rh5/PR8融合病毒株,用动物实验确认此病毒株的免疫原性、免疫稳定性及免疫防御实验确认防御效果.结果 人工合成的Rh5/PR8融合病毒株除HA外,均来自A/PR/8/34(PR8),HA来自H5N1强致病性鸡流感病毒,剪除第346-349的碱性氨基酸(RKKR)部位.用灭活Rh5/PR8病毒免疫鸡后,平均抗体水平HI Titer达到29以上,持续达1个月之久;免疫原在一定条件下保存2个月及4个月后重复上述实验,抗体水平上升与立即免疫组相似,有效抗体水平可持续到免疫后7个月以上,表明Rh5/PR8病毒HA5抗原稳定,不易被降解;免疫防御实验表明:非免疫组鸡的死亡率达到60%左右,而免疫组无死亡,防御率达到100%,表明免疫防御有效.结论用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合减毒病毒Rh5/PR8株,外来基因HA5抗原性安定、免疫原性可靠,有效抗体持续时间长,免疫防御有效.     

猪在A型流感病毒种间传播的意义

流感病毒属正粘病毒科,为负链RNA病毒。根据其核蛋白和基质蛋白抗原性的不同,可分为A、B、C三种类型,其中A型是造成流行的主要病原。A型流感病毒是高传染性的呼吸系统的病原微生物,常见于人类、猪、马和其他一些哺乳动物以及多种家禽和野生鸟类。猪对于禽流感和人流感都是易感的,在禽、人、猪流感病毒的基因片段中的重组已经在猪体内发生了,并且一些新的重组猪流感病毒也传染到人类,当前的例子…显示猪能够从禽类传递新病毒到其他哺乳动物。从猪到人的重组病毒的建立和传播在世界的任何地方都能发生。因此,应重视猪对于A型流感病毒这种物种间的传播的影响。     

带TAP标签的流感病毒8质粒反向遗传包装系统的初步构建

目的构建带TAP标签流感病毒8质粒反向遗传包装系统，以期应用于流感病毒感染宿主细胞的蛋白分子机理的研究。方法两步RT—PCR方法扩增流感病毒8基因，人工合成TAP基因序列，并采用3次PCR的方法融合TAP基因和NP基因。将流感病毒8基因和NP—TAP基因克隆于反向遗传载体PIVVⅡ-1，阳性克隆用PCR和序列测定进行鉴定。结果经PCR和序列分析鉴定，筛选到了带TAP标签的流感病毒8质粒反向遗传阳性克隆。结论成功构建了带TAP标签的流感病毒8质粒反向遗传包装系统，为进一步研究流感病毒感染宿主细胞的蛋白分子机理奠定了基础。     

抗流感病毒药物的研究进展

流感是流感病毒引起的急性呼吸道传染病。由于抗原变异频繁,疫苗的预防效果不理想,所以,抗流感病毒药物研究显得更加重要。目前,离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂正式应用于临床,但有耐药性和部分不良反应;流感病毒吸附抑制剂、细胞-病毒膜融合抑制剂和反义寡核苷酸正处于实验室研究阶段,在体内外实验中有良好的抗病毒活性;RNA干扰在抗流感病毒方面具有诸多优势,已有实验证实小干扰RNA具有抑制流感病毒作用,可能成为新一代抗流感病毒药物。     

小RNA治疗流感病毒的研究进展

流感病毒引起的急性呼吸道传染病,一直以来严重影响人类健康。目前防治流感病毒的常规方法依然是疫苗和药物,但存在滞后性、耐药性等限制。由小RNA(s RNA)介导的RNA干扰(RNAi)提供了一种新型有效的抗病毒策略,已应用到SARS、HIV、RSV、HCV等多种病毒的临床试验。随着RNAi研究的深入,应用s RNA抗流感病毒的报道也逐渐增加。相对于传统的抗流感病毒药物,针对流感病毒基因保守区的特异性siRNAs和miRNAs具有更好的抗病毒效果,并避免耐药性的产生,具有较好的应用前景。     

流感病毒疫苗研究进展

流感是由流感病毒所引起的一种急性呼吸道传播疾病,可季节性地感染禽类、哺乳动物和人类。流感病毒又可分为A、B、C三种类型,其中以A型流感病毒的暴发最为频繁。甲型流感病毒属于正黏病毒科[1],其基因组共由8个独立的单链RNA片段组成,编码10种蛋白：血凝素蛋白（HA）;基质蛋白（M）分为M1和M2;神经氨酸酶（NA）;核壳蛋白（NP）;非结构蛋白（NS）包括NS1和NEP;PB1,PB2和PA三种聚合酶,每种多肽对于流感病毒都具有重要的生物学功能。甲型流感病毒根据其主要表面抗原HA和NA的抗原性的差异分为不同亚型,目前已发现了17种亚型的HA蛋白,和10种亚型的NA蛋白[2]。具有高度传染性,经常在短期内突然暴发并迅速蔓延,造成不同程度的流行。早在1580年,流感暴发就首次为人类所详尽记载,近年来流感病毒的暴发也越来越频繁,如2009年暴发于美洲的H1N1甲型流感和在香港引起恐慌的H3N2流感,以及2013年在我国长江流域暴发的H7N9禽流感。     

强迫症的表观遗传学研究进展

强迫症是一种致残率较高的精神疾病,其病因尚未明确.研究表明,强迫症的发生发展是基因与环境共同作用的结果.表观遗传学为解释环境因素对个体遗传的作用提供了途径及机制.目前已有报道,强迫症患者与健康人群之间存在DNA甲基化差异,而DNA甲基化水平可能与治疗效果存在密切关联.此外,研究发现强迫症患者微RNA表达丰度较健康对照上...     

反向斑点杂交检测甲/乙型流感病毒及其基因分型的方法研究

目的 建立一种特异、灵敏的检测甲/乙型流感病毒并对其进行基因分型的反向斑点杂交方法.方法 应用生物软件针对甲/乙型流感病毒的膜蛋白(Matrix Protein)基因和血凝素(Hemagglutinin,HA)基因的保守区域设计引物及探针,通过优化PCR和杂交的反应条件.建立检测甲/乙型流感病毒并对其进行基因分型的反向斑点杂交方法.验证方法的特异性和敏感性,并与直接免疫荧光法分别对相同的临床咽拭子标本进行检测,比较两者的检测结果,以评价该方法的临床应用价值.结果 该方法对甲/乙型流感病毒的检测具有特异性,对呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒A型、副流感病毒3型、鼻病毒和腺病毒3型均无交叉反应,检测灵敏度为102～103 copies/μL.在111例发热门诊病人的咽试子标本中.免疫荧光检测出3例甲型流感病毒、0例乙型流感病毒,阳性率为2.7%;反向斑点杂交检测出3例甲型流感病毒,其中1例H1、2例H3、0例H5、0例H9,4例乙型流感病毒,阳性率为6.3%.结论 初步应用结果表明,本研究建立的检测甲/乙型流感病毒并对其进行基因分型的反向斑点杂交方法具有特异、灵敏的特点,为该方法的后续临床应用奠定基础.     

胃癌遗传学及表遗传学研究进展

胃癌是病死率较高的恶性肿瘤之一,其发生与发展是多种因素交互作用的结果,包括环境、饮食、遗传、幽门螺杆菌感染、慢性炎症浸润、癌前病变等。随着对胃癌研究的不断深入．目前研究的焦点主要集中在遗传学及表观遗传学改变,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA的改变、基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等。本文就遗传学及表遗传学改变在胃癌的诊断、预后预测及治疗等方面的研究进展做一综述。     

系统性硬化症的表观遗传学研究进展

系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)是一类病因不明的自身免疫性疾病,以血管病变、炎症和皮肤及各器 官广泛纤维化为主要特征。纤维化是SSc的标志,也是导致其高病死率的主要原因。近年来,SSc的表观遗传学(DNA 甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA)得到了深入的研究,其中以DNA甲基化和微小RNA(microRNA,miRNA)的研究最 为广泛。DNA甲基化异常可影响SSc的血管内皮细胞、CD4+T细胞和成纤维细胞的功能。血清中的miRNAs与自身抗 体、SSc疾病活动度和并发症密切相关,成纤维细胞中的miRNAs可直接影响成纤维细胞的活化。     

冠心病猝死的遗传学研究进展

冠心病是威胁人类健康的重要疾病,猝死作为冠心病最严重的类型,具有发病突然、救治成功率低等特点。目前无有效手段对冠心病猝死实施精准预测。随着遗传学研究的不断深入,冠心病猝死的遗传背景 被不断揭示,越来越多的遗传位点被证实与冠心病猝死相关,使得猝死的早期识别成为可能。本文从冠心病猝死的基因多态性、相关RNA和表观遗传学三方面,对冠心病猝死的遗传学研究进展做一综述,旨在从微观层面加强对冠心病猝死的认识。     

流感病毒研究进展

流感病毒分为甲型(国外称为A型)、乙型(国外称为B型)和丙型(国外称为C型)。其中甲型流感病毒于1933年由Smith等[1]人通过雪貂培养分离,因其变异及进化速度快、抗原多变、感染性和致病性强、传播速度快而成为造成人类季节性流感和历史上大流感的主要病毒,也是病毒研究者的主要研究对     

汉坦病毒糖蛋白及其在细胞融合中的作用的研究进展

汉坦病毒（Hantavirus,HV）属于布尼亚病毒科分节段负链RNA病毒,基因组根据大小将其分为L、M、S。分别编码病毒RNA依赖的RNA多聚酶、     

利用反向遗传学原理构建B、E型肉毒神经毒素基因型特异性靶片段

目的 利用反向遗传学原理构建B、E型肉毒神经毒素(BoNT)基因型特异性靶片段质粒、菌株.方法 自GenBank获取BoNT基因序列,利用DNAMAN、Lasergene、VectorNTI等多种生物信息学分析软件和BLAST等网上数据分析平台进行综合分析,以锚定BoNT/B与BoNT/E基因中的型特异性靶片段,分别设计合成5条和10条DNA短链,经重叠PCR扩增获得完整的靶片段,纯化后连接到pMD 18-T载体上,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,质粒提取后进行酶切和测序鉴定.结果 分析了全球已报道的60条BoNT基因序列(A、B、E、F型),于BoNT/B与BoNT/E基因中,分别锚定了215 bp和360bp的靶片段,并设计合成其特异的检测引物对,经酶切、测序确证,成功合成具有型特异性的BoNT/B与BoNT/E靶片段.结论 获得含有型特异性BoNT/B与BoNT/E靶片段的重组质粒pMD18-T-BoNT/B,pMD18-T-BoNT/E及其菌株.