大鼠脑缺血再灌注诱导自体神经干细胞原位增殖的研究

目的研究缺血性脑损伤对内源性神经干细胞增殖、迁移的影响。方法参照Pulsinelli-Brierley法制作短暂性全脑缺血动物模型,全脑缺血10min后再灌注,采用SABC免疫组化染色显示5'-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)阳性细胞和神经巢蛋白(Nestin)阳性细胞,光镜下观察并统计分析脑缺血损伤后内源性神经干细胞增殖、迁移的变化过程。结果脑缺血再灌流24h后,海马、齿状回和室管膜下区的BrdU阳性细胞和Nestin阳性细胞增多,7～10d达到高峰,术后20d仍有表达;在室管膜下区,BrdU阳性细胞和Nestin阳性细胞有向皮质、海马迁移的现象。结论①成年大鼠全脑缺血后7～10d,内源性神经干细胞的增殖达到高峰。②增殖的内源性神经干细胞存在由增殖区向靶区迁移的现象。     

神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤实验研究

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞移植治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的可行性。方法孕龄8~10d的大鼠神经干细胞在体外扩增后,用免疫组织化学方法分别检测神经干细胞及其分化后代的特异性标志蛋白nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。分别于缺血后不同时间窗将神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠模型的缺血半暗带和梗塞中心,移植4w后比较不同移植部位神经干细胞存活、增殖和迁移的差异。结果从胎鼠中成功培养出悬浮生长的可表达nestin的神经球,其在含血清条件下可分化为表达GFAP的胶质细胞和表达NSE的神经元。神经干细胞移植4w后可见所有移植动物的细胞都存活,梗塞中心移植的细胞存活、增殖水平明显低于半暗带移植的细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠梗塞中心和半暗带均可长期存活,其增殖能力与移植部位密切相关。     

雌激素对大鼠脑缺血再灌注神经干细胞内源性激活的实验研究

目的探讨雌激素对脑缺血再灌注神经干细胞(neural stem cell,NSC)内源性激活的作用.方法将44只雄性大鼠随机分成假手术组、对照组和实验组.采用传统的线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,实验组大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇,对照组腹腔注射生理盐水,通过免疫组织化学技术标记大鼠海马齿状回颗粒下层(subgranular zone,SGZ)、侧脑室室下层(subventricular zone,SVZ)以及梗死皮质周边区在缺血再灌注3、7、11、18 d的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)阳性细胞,并采用HPIAS图像分析系统进行分析.结果正常成年大鼠脑组织SGZ和SVZ存在少量Brdu阳性细胞,对照组脑缺血再灌注3 d SGZ、SVZ和梗死皮质周边Brdu阳性细胞的数量开始增多,7 d达到高峰,11d后开始减少,18 d进一步下降.实验组与对照组相比,在各个时间点均能显著提高BrdU阳性细胞的数量(P＜0.01),而且增殖可以持续11d.结论脑缺血再灌注可激活脑内NSC的增殖,雌激素可以促进脑缺血再灌注多个区域NSC的增殖.     

脑缺血后内源性激活神经干细胞的机制研究

1 脑缺血后内源性神经干细胞的自身激活 近年来研究表明,脑缺血后自身的神经干细胞有大量的增殖分化[1,2],说明神经干细胞可能参与脑缺血的病理生理过程.Zhang等通过建立沙鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型,观察缺血再灌注后不同时期的室管膜下层(SVZ)、海马颗粒细胞层(DG)、嗅球以及梗死灶周边皮质的神经干细胞增殖、分化情况,发现7 d后在梗死同侧脑SVZ出现神经干细胞增殖高峰,14 d达最高,而DG区则无增殖,且14 d后远离梗死区的嗅球有大量的神经干细胞增殖,但28 d后,标记Brdu阳性细胞大量减少,说明脑缺血只引起短暂的神经干细胞的增殖,Zhang认为是脑缺血损伤的应急保护反应[3].     

自体神经干细胞原位激活与缺血性脑损伤

缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的常见病和多发病,已经成为当今第三大致死疾病及首位致残原因犤1犦。其病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应,虽然对其机制的了解越来越深入,但有效的治疗手段仍然缺乏。对于大多数脑缺血患者,神经元死亡不可避免,是治疗难以取得满意效果的主要原因。近年来,已经从胚胎及成年的脑组织分离出具有自我更新、能够分化成神经元和神经胶质细胞的神经干细胞(neuralstemcell,NSC)。因为NSC能促进神经元再生及损伤脑组织恢复,许多学者开始研究NSC移植对脑缺血的治疗作用,并取得了一定进展,但由于免疫排斥及技…     

脑缺血再灌流诱导内源性神经干细胞的增殖、分化

目的 观察脑缺血再灌注后内源性神经干细胞的分布、增殖和分化.方法 阻塞大鼠大脑中动脉2h不同时间的再灌流制成局灶性脑缺血模型,免疫组化单标、双标观察神经干细胞的增殖、分布、分化.结果 正常组和假手术组,多数脑室室管膜细胞Brdu免疫反应阳性,脑实质内有零星散在Brdu阳性细胞.再灌流1d,室管膜及室管膜下层的Brdu阳性细胞显著增多;再灌流3～10d,视前区梗死区周边区、缺血纹状体和额顶皮质的Brdu阳性细胞显著增加.再灌流3d,Brdu阳性细胞出现于海马齿状回的颗粒下层,并随再灌流时间延长,阳性细胞数量增多.免疫组化双标显示再灌流3d视前区有很少量的Brdu/GFAP双阳性细胞,随后增多.再灌流10d内,未检查到Brdu/NF双标阳性细胞.结论 成年哺乳动物的室管膜、脑实质有少量神经干细胞,脑缺血后室管膜、齿状回颗粒下层出现大量的神经干细胞增殖,这些增殖神经干细胞向缺血区迁移、分化,试图补偿丢失的细胞,重塑受损的神经组织.     

神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的实验研究

目的探讨胎鼠皮质培养的神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的可行性及疗效。方法取孕龄15d Sprague-Dawley(SD)胎鼠皮质细胞培养为神经干细胞;用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型;将24只健康SD大鼠分为假手术组、缺血对照组、缺血移植组,在移植后2周、4周依据Garcia的18分评分法对各组大鼠的神经功能进行评分;行脑灌注固定取材,免疫组化染色观察移植后神经干细胞的分化、迁移和整合情况。结果用胎鼠皮质培养的细胞nestin表达阳性;缺血移植组大鼠的神经功能评分明显高于缺血对照组(P<0.05);缺血移植组免疫组织化学染色能够检测到存活的BrdU阳性细胞,移植后4周时可见移植细胞向周围迁移、分化、参与血管形成,并可见梗死区边缘微血管明显增生;缺血移植组大鼠脑GFAP阳性细胞数较缺血对照组明显增多(P<0.05)。结论分离、培养胎鼠皮质细胞Nestin表达阳性,即是大鼠的神经干细胞;移植体外培养的神经干细胞能在脑缺血大鼠脑内存活、迁移、分化,并且对脑梗死大鼠的神经功能修复起到了积极作用。     

大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织STAT3变化的免疫组织化学研究

目的 探讨信号转导和转录激活子（ＳＴＡＴ）３在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的表达及其与缺血性神经细胞损伤的关系方法 用ＡＢＣ免疫组化方法观察大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织中的ＳＴＡＴ３蛋白免疫反应阳性细胞分布。结果 正常和假手术大鼠脑内以及脑缺血后的非缺血半球脑组织中未发现有ＳＴＡＴ３免疫反应阳性细胞,脑缺血再灌注损伤后１２小时在栓塞侧梗死区可见少量ＳＴＡＴ３免疫阳性细胞,２４小时后阳性细胞显著增多达高峰,在缺血侧纹状体和缺血皮质周边区表达最明显,１周后梗死周边区少数神经细胞仍有阳性表达。差异有显著意义（Ｐ〈０．０１）。结论 ＳＴＡＴ３活化及超量表达可能介导了缺血神经细胞信号转导过程,并参与了脑缺血神经细胞损伤与修复的病理生理过程。     

雌激素抑制脑缺血再灌注损伤后炎症反应

目的：探讨雌激素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后炎症反应的影响。方法：大鼠分3组：对照组、双侧卵巢切除（OVX）组、OVX＋17β－E2组（200μg/kg，皮下注射每周1次，共4周）。4周后线检地建立右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）1h,2h再灌注0，1，3，6，22，70h模型。在HE染色缺血半球选取10个高倍视野计算脑组织内浸润的中性粒细胞均数，免疫组化检测核转录因子－κB（NF－κB）表达。结果：外源性雌激素替代可以对抗OVX引起的NF－κB过分表达，减少脑实质内中性粒细胞浸润，减轻局部炎症反应。结论：雌激素能抑制脑缺血再灌注损伤后炎症反应。     

缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤神经保护作用的研究

目的探讨大鼠脑缺血后处理对缺血再灌注损伤后神经元的保护作用。方法健康雄性SD大鼠30只,随机分为假手术组(SO组)、缺血再灌注对照组(MCAO组)、缺血后处理组(IPOC组)3组。采用线栓法制备大鼠MCAO模型及IPOC模型,分别用TTC染色法计算脑梗死体积、流式细胞术和ELISA法观察,对于大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡率及血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量的影响。结果 (1)大鼠脑缺血再灌注后24h,IPOC组较MCAO组梗死体积明显减小(P<0.05);(2)MCAO组大鼠脑缺血再灌注24h细胞凋亡发生率及血清中NSE的含量较SO组显著增加(P<0.01);(3)IPOC组神经元凋亡发生率及血清NSE较MCAO组显著降低(P<0.05或0.01)。结论大鼠脑缺血后处理对缺血再灌注神经元损伤有保护作用。     

脂肪来源神经干细胞移植局灶性脑缺血模型大鼠的血管新生

背景：脂肪组织来源的神经干细胞移植可改善脑缺血大鼠神经功能,但其机制尚不明确。 目的：观察人脂肪组织来源神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后血管新生的影响。 方法：体外培养脂肪基质细胞,诱导分化为神经干细胞。60只健康雄性SD大鼠分为4组：正常组6只,假手术组6只,缺血对照组24只,移植治疗组24只。后两组线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注模型,又分为缺血2 h再灌注7,14,21,28 d组,每个时点各6只。假手术组不闭塞大脑中动脉。造模成功后24 h,移植治疗组经尾静脉移植人脂肪组织来源神经干细胞悬液,细胞浓度为2×109 L-1;缺血对照组经尾静脉注射生理盐水。免疫组织化学法进行微血管密度计数,观察脑缺血区血管增生情况。 结果与结论：免疫组织化学结果显示,与缺血对照组比较,移植治疗组缺血2 h再灌注7,14,21,28 d的微血管密度值均显著高于缺血对照组,差异有显著性意义(P < 0.05~0.01)。提示脂肪组织来源的神经干细胞移植可促进脑缺血区新生血管的形成。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注DNA损伤原位检测

目的 研究大鼠大脑中动脉缺血再灌注时，DNA损伤随再灌注时程在各脑区的动态分布情况。方法 用线栓闭合大鼠大脑中动脉30min，然后分别再灌注30min、1h、2h、4h、6h、12h、24h和48h。采用原位PANG（DNA聚合酶I介导的生物素标记的dATP缺口平移)及原位TUENL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP末端标记)分别检测DNA损伤的单链断裂(SSBs)及双链断裂(DSBs)，分别观察SSBs细胞和DSBs细胞在大鼠前囟水平冠状切面的脑组织切片各区域的分布。结果 DNA单链断裂和双链断裂都首先发生在尾壳核(CPU)，而且在再灌注的各时间点，分布在尾壳核和梨状皮质(PI)的PANT或TUNEL阳性细胞数量显著多于分布在额叶皮质(FR)及顶叶皮质(PA)的数量(P＜0．05)。DNA单链断裂比双链断裂发生要早。结论 尾壳核和梨状皮质是受缺血影响的中心区域，额叶和顶叶皮质是受缺血影响相对较轻的区域，可能是缺血半影区。     

局灶性缺血再灌注鼠脑血小板活化因子受体基因的表达

目的　探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后血小板活化因子 (PAF)受体基因的表达变化规律及其机制。方法　应用RT PCR技术检测大脑中动脉 (MCA)线栓闭塞再通后不同时相MCA供血区皮质PAF受体基因的表达 ,同时用放免法测定对应PAF值。结果　单纯缺血 90min时 ,缺血区皮质PAF受体mRNA含量并无显著变化 ,密度比值为 0 92± 0 13;再灌注 6h明显降低 (0 77± 0 0 8) ,48h最低 (0 5 4± 0 10 ) ,随后逐渐回升 ;再灌注第 6天时与假手术对照组比较无显著差异。对应时相缺血区皮质PAF值 (pg/g) ,单纯缺血组为 2 80 2± 374,再灌注 12h最高峰 ,2 4h降至对照组水平 (75 2±16 3)。结论　脑缺血再灌注可致PAF受体基因表达异常 ,推测与内源性PAF水平升高有关。     

骨髓基质细胞源神经干细胞对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及相关蛋白表达的动态影响

目的探讨骨髓基质细胞源神经干细胞对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。方法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。32只健康Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组、缺血对照组、缺血骨髓基质细胞移植组和缺血骨髓基质细胞源神经干细胞移植组。分别在移植后7d和14d行脑灌注固定取材,应用免疫组化染色及原位细胞凋亡检测脑组织Bcl-2、Bax蛋白表达及凋亡细胞数。结果缺血移植组各时点的凋亡细胞数均少于缺血对照组(P<0.01),缺血移植14d组凋亡细胞数明显少于缺血移植7d组(P<0.01),骨髓基质细胞源神经干细胞移植组凋亡细胞明显少于骨髓基质细胞移植组(P<0.05)。缺血移植组Bcl-2表达显著高于缺血对照组(P<0.01)。缺血移植组Bax蛋白表达明显低于缺血对照组(P<0.01)。结论骨髓基质细胞源神经干细胞可能通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

rTMS促进大鼠局灶性脑缺血海马内源性神经干细胞分化的研究

目的探讨重复经颅磁刺激（rTMS）对局灶性脑缺血大鼠海马内源性神经干细胞分化的影响。方法线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型,随机分为脑缺血自然恢复组和rTMS治疗组,用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察缺血14d、28d后各组大鼠海马中5-溴脱氧尿核苷（BrdU）与神经元特异核蛋白（NeuN）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）共同标记的阳性细胞,并在高倍荧光显微镜下对双标阳性细胞计数。结果脑缺血后14d、28d,rTMS治疗组大鼠海马BrdU／NeuN双标阳性细胞数量分别为17．12±2．91、23．20±5．97,较相应自然恢复组12．96±2．79、15．92±2．52明显增加,两组同一时间点组间比较有统计学差异（P〈0．01）。而脑缺血后14d、28d,rTMS治疗组大鼠海马BrdU／GFAP双标阳性细胞数量分别为30．48±4．58、36．48±4．90,较相应自然恢复组37．44±3．58、43．60±5．96减少,两者相比有统计学差异（P〈0．05）。结论局灶性脑缺血大鼠海马增殖的内源性神经干细胞,可分化为神经元或神经胶质细胞,而rTMS可促进海马内源性神经干细胞向神经元的分化。     

神经干细胞移植治疗大鼠创伤性脑外伤的实验研究

目的 将神经干细胞(NSCs)移植于大鼠创伤性脑损伤部位,观察NSCs对创伤性脑损伤的治疗作用.方法 首先进行NSCs的体外培养,同时采用5-2-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记,脑外伤模型采用自由落体撞击大鼠左侧大脑皮质运动感觉区来制作,脑外伤后24h内移植NSCs,分别于脑外伤前、脑外伤后1、2、3周时行神经运动行为学评分(NMFE)和免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷酯(GalC)蛋白表达和TUNEL原位杂交染色,经计算机图像分析系统处理.结果 大鼠自由落体撞击伤后,右下肢神经运动功能障碍明显.神经运动行为学评分在第1周时,实验组与对照组无明显差异,而在第2、3周时,实验组的评分明显低于对照组,有统计学意义(P＜0.05).第2、3周时实验组NSE、GFAP和GalC染色阳性细胞数要多于对照组,nestin染色在第1周时表达最高,而后逐渐下降.BrdU阳性细胞在损伤灶中心区最多,在损伤灶的远隔部位也有少许发现,而TUNEL染色则对照组明显比NSCs组高,有统计学意义(P＜0.05).结论 脑外伤移植NSCs可以在损伤区存活、增殖及分化,并在损伤的远隔部位有少许NSCs迁移、分化.NSCs移植有利于大鼠脑自由落体撞击伤后期的功能恢复.     

立体定向移植神经干细胞治疗局灶性大鼠脑缺血损伤的研究

目的观察大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠脑室内的迁移和分化。方法实验于2003年5月~2004年10月在哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心完成。孕龄8~10d Wistar大鼠仔鼠神经干细胞体外扩增后用免疫组织化学的方法分别检测神经干细胞及其分化后代的特异性标志蛋白-巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达,健康Wistar大鼠大脑中动脉闭塞后40只随机分成A、B、C、D四组,A组为梗塞后24小时脑室内移植神经干细胞组,B组为梗塞后24小时梗塞中心移植神经干细胞组,C组为梗塞后4周脑室内移植神经干细胞组,D组为梗塞后4周梗塞中心移植神经干细胞组,各实验组均有仅移植生理盐水的空白对照。比较神经干细胞不同移植部位和不同移植时间神经干细胞存活、增殖和迁移的差异。结果实验大鼠40只均进入结果分析。从胎鼠中成功培养出悬浮生长的可表达巢蛋白的神经球,含血清条件下可分化为表达胶质纤维酸性蛋白的胶质细胞和神经元特异性烯醇化酶的神经元,移植后可见移植细胞存活至少8周以上,A组可见移植细胞大量存活,穿过室管膜向脑组织迁移,特别是向缺血周边区迁移;B组细胞主要聚集在梗塞中心移植区域,也有大量细胞存活,充填梗塞区,少量细胞可穿过胼胝体向健侧迁移;C组仅见少量Brdu阳性细胞存活,但细胞增殖分裂较A组不明显,且存活细胞主要仍在移植部位;D组存活移植细胞也较B组明显减少。结论大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠脑室内可长期存活并广泛迁移,不同移植部位不影响细胞存活,脑室内移植细胞向脑缺血区域迁移,缺血后24小时移植较缺血后4周移植其迁移趋向性更强。     

大鼠胚胎脑皮层神经干细胞的分离和培养

目的探讨分离、培养、纯化大鼠胚胎神经干细胞(neuralstem cell,NSCs)的最佳条件,以获得充足的神经干细胞来源,用于中枢神经系统疾病的治疗.方法分离孕13～15 d胎鼠大脑皮层,在无血清含神经生长因子N2培养液中培养,利用有限稀释法单克隆培养和改良法连续传代纯化并扩增NSCs,免疫组织化学法对NSCs及分化细胞进行鉴定.结果可以通过体外培养获得大量神经源性干细胞,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能.结论NSCs的存活和分裂依赖于神经生长因子和N2添加剂的浓度,胚胎脑组织和神经球分离方法影响NSCs的形成速度和数量.掌握NSCs的体外纯化培养和鉴定手段可为进一步研究NSCs生物学特性及神经系统损伤的治疗提供新方法.