骨片吸收陷窝光镜计数法定量测定破骨细胞功能

目的 研究定量检测体外培养破骨细胞（ＯＣ）骨吸收功能。方法 应用改良Ｆｅｎｔｏｎ等的方法，由１ｄ龄ＳＤ大鼠四肢长骨分离ＯＣ并中于牛皮质骨骨片上连续培养，超声去除细胞后，骨片经１％甲苯胺蓝色３～４ｍｉｎ光镜下对整片吸收陷窝观察并计数，根据骨片上陷窝的数目定量ＯＣ的骨吸收功能。结果 骨片吸收陷窝经甲苯胺蓝染色后光镜下可清晰识别，并为扫描电镜（ＳＥＭ）所证实，甲苯胺蓝染色－光镜观察技术对骨片吸收陷窝计数     

氟对兔体外破骨细胞性骨吸收影响的研究

目的:探讨不同剂量氟化钠 (Na F)对兔体外破骨细胞功能的影响。方法:从新生兔四肢长骨中分离破骨细胞 ,采用体外培养破骨细胞的方法 ,用倒置相差显微镜和计算机图像分析技术 ,测量在含有不同浓度 (1.0 0×10 - 7～ 1.0 0× 10 - 4m ol/ L )的 Na F培养液中骨吸收陷窝数和表面积。结果:染氟 1.0 0× 10 - 6 、1.0 0× 10 - 5和 1.0 0×10 - 4m ol/ L 组骨片上骨吸收陷窝数量和表面积与对照组比较均减少 (P <0 .0 1) ,而且骨吸收陷窝数及表面积随氟浓度的增加而减少。 结论 :氟对体外培养的破骨细胞有直接的损伤作用。     

骨片吸收陷窝光镜计数法定量测定破骨细胞功能

目的研究定量检测体外培养破骨细胞（ＯＣ）骨吸收功能。方法应用改良Ｆｅｎｔｏｎ等的方法，由１ｄ龄ＳＤ大鼠四肢长骨分离ＯＣ并接种于牛皮质骨骨片上连续培养，超声去除细胞后，骨片经１％甲苯胺蓝染色３～４ｍｉｎ，光镜下对整片吸收陷窝观察并计数。根据骨片上陷窝的数目定量ＯＣ的骨吸收功能。结果骨片吸收陷窝经甲苯胺蓝染色后光镜下可清晰识别，并为扫描电镜（ＳＥＭ）所证实。甲苯胺蓝染色—光镜观察技术对骨片吸收陷窝计数结果同ＳＥＭ计数结果基本一致（ｒ＝０．９９６７，Ｐ＜０．０５）。结论骨片吸收陷窝光镜计量法评价体外培养破骨细胞骨吸收能力简便、快速、可靠，可用于骨质疏松症病理生理和开发新药的研究     

体外培养破骨细胞功能的定量评定

目的 建立适用于体外药理学研究的破骨细胞骨吸收功能的定量评定方法。方法 机械分离法获得破骨细胞,接种于象牙薄片底物上,分别于培养１ｄ、３ｄ、５ｄ、７ｄ取出象牙薄片各４张,采用光镜和扫描电镜观察骨陷窝数量的变化;对随机拍摄的陷窝照片进行计算机形态计量分析,测算陷窝的面积和浓度。结果 骨吸收陷窝计数光镜法和扫描电镜法具有良好的相关性,ｒ＝０．９９９８,Ｐ〈０．００１。随着培养时间的延长,陷窝数量逐渐增     

组织块法与传统破骨细胞培养方法对骨吸收功能的比较研究

目的：比较组织块法与传统破骨细胞培养方法对破骨细胞骨吸收功能的影响。方法：用组织块法与传统破骨细胞培养方法进行破骨细胞培养,抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色鉴定破骨细胞,超声去除骨片上细胞后,骨片经1%甲苯胺蓝染色,光镜下观察骨片上吸收陷窝。根据骨片上陷窝数目、面积以及深度定量比较两组破骨细胞骨吸收功能。结果：吸收陷窝经甲苯胺蓝染色后光镜下可清晰识别,组织块法在骨片上的吸收陷窝数目比传统法明显少,而且骨片上陷窝面积及深度也比传统法小而浅（P〈0.05）。结论：组织块法培养的破骨细胞无论从数量上还是从功能上均没有传统法培养的好。数量大的成骨细胞对共培养破骨细胞骨吸收功能起到负面作用。     

成骨细胞在破骨细胞性骨吸收中的调节作用

骨组织中含有3种固有的细胞成分,分别是成骨细胞(Osteoblast,OB)、破骨细胞(Osteoclast,OC)和骨细胞(Osteocyte)。它们与骨组织的生成和成熟过程密切相关,其中OB和OC是骨重建中维持骨量的两种主要细胞。本文就成骨细胞在破骨细胞性骨吸收中的调节作用,综述如下。     

补肾方治疗的骨质疏松症模型大鼠血清对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的：观察经过补肾方治疗的切卵模型大鼠血清对外培养破骨细胞骨吸收功能的影响。方法：取10月龄SD雌性大鼠40只,其中30只切除双侧卵巢造成骨质疏松症模型,10只仅切除少量脂肪而不损及卵巢,3个月成模后开始治疗,随机分为补肾方、倍美力和正常饮食对照组3组,每组10只。治疗3个月分离血清,用于细胞培养实验。自1d龄SD大鼠四肢长骨分离破骨细胞,接种于象牙薄片底物上,以骨吸收陷窝数量变化为指标,观察各组血清的作用效果。结果：与假切卵组比较,切卵组陷窝数量增加了74．1％,而补肾方和倍美力组的陷窝数量分别下降了65．7％和59．3％,与假切卵组之间的差异非常显著（P＜0．01）。结论：补肾方具有明显的抑制破骨细胞活性的作用。     

国产因卡磷酸钠对体外破骨细胞性骨吸收的作用

目的 研究国产因卡磷酸钠（ICD）对破骨细胞性骨吸收的作用。方法 采用破骨细胞与骨片的体外共培养法和显微摄片、显微光密度仪扫描及计算机图像分析技术。结果 ICD（0．5,5与50μmol/L）使体外破骨细胞性骨吸收陷窝数目呈剂量依赖性减少,中等浓度（5μmol/L）的抑制作用明显高于阳性对照药帕屈磷酸钠（APD）,两药均可使吸收陷窝表面积明显降低,而且ICD作用更明显。结论 ICD具有较强的直接抑制破骨细胞性骨吸收的作用,对骨质疏松症可能有一定的治疗作用。     

体外破骨细胞性骨吸收陷窝的动态观察

动态观察破骨细胞的功能及药物的作用。采用体外破骨细胞培养法、显微摄影、显微光密度仪及图像分析等技术。结果表明，破骨细胞具有不规则的移行性，在一定时间范围内，随着培养时间的延长，破骨细胞性骨吸收陷窝不断增多与增大，并呈不规则形状。国产帕屈磷酸钠（ＡＰＤ）可直接抑制骨吸收陷窝的数目及表面积。提示动态观察体外破骨细胞性骨吸收陷窝形态变化的方法是一种直观、简便、稳定和能反映药物作用的方法。     

白细胞介素1刺激破骨细胞性骨吸收作用的实验研究

目的：了解白细胞介素1β（IL－1β）在破骨细胞性骨吸收中的刺激作用及其相应的作用机制。方法：分别将新生大鼠破骨细胞单独以及和成骨细胞联合接种于预置象牙片的培养板中。24h后培养液中加入不同浓度的IL－1β。继续培养48h,然后取出象牙片,超声处理后行甲苯胺蓝染色,光镜下观察骨吸收陷窝的数目并计算其部面积。结果：IL－1β能够明显增加坡骨细胞和成骨细胞联合培养组象牙片上吸收陷窝的数目和面前,且刺激作用呈剂量依赖性,但对单独培养的破骨细胞无明显刺激作用。结论：IL－1β的刺激骨吸收作用由成骨细胞所介导,而非直接作用于破骨细胞。     

WT161抑制小鼠破骨细胞分化及骨吸收的研究

目的 研究WT161对破骨细胞分化及骨吸收功能的作用及机制。方法 取8周龄雄性C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage,BMM）进行原代培养,通过CCK-8细胞毒性试验探究不同浓度WT161对BMM增殖的作用;通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察各浓度WT161对破骨细胞分化的影响;通过骨吸收试验探究各浓度WT161对破骨细胞骨吸收功能的作用;通过蛋白质印迹试验检测WT161对核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）p65、p-NF-κB p65及活化T细胞核因子（nuclear factor-activated T cell 1,NFATc1）信号通路的影响。结果 CCK-8结果显示当WT161浓度>0.63μmol/L时,WT161对BMM具有显著的抑制增殖作用;诱导破骨细胞分化时,WT161抑制BMM分化为破骨细胞,破骨细胞数目及铺展率明显减少;骨吸收试验显示WT161可显著抑制破骨细胞骨吸收功能;蛋白质印迹试验结果表明,WT161抑制NF-κB p65的磷酸化及下游NFATc1的表达。结论 WT161通过抑制NF-κB及下游的NFATc1信号通路从而抑制破骨细胞的分化及骨吸收功能。     

葛根素调控骨代谢的体外实验研究

目的：探讨中药葛根对骨形成和骨吸收的调控作用。方法：鼠颅盖骨机械法体外分离培养获得成骨细胞（osteoblast，OB）；新生兔长干骨机械分离法获得破骨细胞（osteoclast，OC）。实验组培养液为10％（体积分数）胎牛血清 αMEM培养液 不同（质量）浓度的葛根素，对照组不加葛根素。分别用四甲基偶氮唑盐（MTT）和碱性磷酸酶（ALP）法检测OB的增殖和分化状态；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察OC形态变化，图像分析体外骨吸收陷窝面积，原子分光光度计法测定OC培养液上清液中Ca^2 含量。结果：中药葛根素对大鼠OB的增殖无明显的刺激作用，但能够促进OB合成分泌ALP。同时，造成体外培养的OC空泡性变，骨吸收陷窝面积减少和培养液上清液中Ca^2 含量的下降。结论：葛根通过抑制骨吸收，刺激骨形成来调控骨代谢，其中抑制骨吸收的效果较强。     

仙茅酚苷类成分促进成骨细胞骨形成和抑制破骨细胞骨吸收

目的 以新生大鼠颅盖骨成骨细胞和由骨髓单核细胞诱导的破骨细胞为模型,观察仙茅代表性酚苷类成分仙茅苷、仙茅素A、苔黑酚葡萄糖苷和苔黑酚龙胆二糖苷的抗骨质疏松作用.方法 MTT法测定成骨细胞的增殖;磷酸苯二钠法测定成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)的活性;茜素红染色观察成骨细胞骨矿化结节的形成;TRAP染色测定破骨细胞的数目;罗丹明-鬼笔环肽染色和激光共聚焦显微镜观察成骨细胞细胞骨架和破骨细胞肌动蛋白环的结构和形态;将破骨细胞与骨片共同培养,计算机图像处理测定破骨细胞在骨片上形成的骨吸收陷窝的面积.结果 仙茅苷在10-9和10-8 mol/L的浓度下可促进成骨细胞的增殖(P＜0.05),10-7～10-5 mol/L浓度时抑制破骨细胞TRAP的活性(P＜0.05).仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷和苔黑酚龙胆二糖苷可减少破骨细胞的数目,抑制破骨细胞的形成(P＜0.05).仙茅苷在10-10mol/L,仙茅素A、苔黑酚葡萄糖苷和苔黑酚龙胆二糖苷在10-9 mol/L浓度时均可增加成骨细胞ALP的活性和骨矿化结节的形成(P＜0.01),在一定程度上使1,25-二羟维生素D3损伤的成骨细胞细胞骨架的结构得以恢复;减少破骨细胞在骨片上形成的骨吸收陷窝面积,破坏破骨细胞伪足和F-actin的结构.结论 仙茅酚苷类成分仙茅苷、仙茅素A、苔黑酚葡萄糖苷和苔黑酚龙胆二糖苷均可促进成骨细胞的骨形成,抑制破骨细胞的骨吸收,具有显著的抗骨质疏松作用.     

锌离子对牙各矿化成份破骨细胞性吸收的体外调控

目的:研究锌离子对破骨细胞体外吸收牙片功能的影响.方法:体外分离、培养新生乳兔破骨细胞,与玻片和灭活牙片共同培养,加入不同浓度锌离子.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定玻片上的破骨细胞,显微摄影分析破骨细胞吸收造成的牙片上的吸收陷窝,原子吸收分光光度法测定溶出的钙,并将实验组与对照组上清液钙离子浓度的比值定义为骨吸收指数,以评价破骨细胞的功能.结果:体外成功分离培养出多核的、TRAP(+)的破骨细胞.破骨细胞吸收牙片时,首先在接近牙根牙骨质或牙本质部位开始形成吸收陷窝,这与这些部位的矿化程度相对较低有关;破骨细胞在牙片上形成的吸收陷窝与骨片相比,吸收陷窝数量较少,体积较小,多为正圆形;吸收深度较浅,常为大面积的浅吸收.用原子吸收分光光度法测定不同浓度的锌离子对溶出的钙和骨吸收指数的影响,初步结果表明,培养第3天,1×10^-4～1×10^-14 mol/L锌离子刺激破骨细胞吸收牙片,其中1×10^-8 mol/L,1×10^-10 mol/L和1×10^-14 mol/L锌离子能够显著刺激吸收(P＜0.05);但是到了培养第7天,各浓度组除了对照组和1×10-14 mol/L锌离子还进一步有吸收外,其余浓度锌离子组的上清液钙离子浓度与自身第3天相比都有降低,但与同时期的对照组相比差异无统计学意义.在培养末期(第7天)1×10^-4～1×10^-7 mol/L,1×10^-9 mol/L,1×10^-12 mol/L和1×10^-13 mol/L浓度组的骨吸收指数小于1,而1×10^-8 mol/L,1×10^-10 mol/L,1×10^-11 mol/L和1×10^-14 mol/L浓度组骨吸收指数都大于1.结论:锌离子对破骨细胞吸收功能的作用与浓度和时程有关.     

橄榄苦苷对破骨细胞的分化以及骨吸收功能的影响

目的 探讨橄榄苦苷(oleuropein)对破骨细胞分化成熟以及骨吸收功能的影响及其可能机制.方法 把不同浓度的橄榄苦苷(12.5、25、50 μmol/L)分别加入由核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)诱导的体外破骨细胞培养体系中,用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resist ant acid phosphatase,TRAP)染色方法观察呈TRAP阳性的多核细胞;RAW264.7细胞也用RANKL诱导,用流式细胞仪分析橄榄苦苷对破骨细胞凋亡的影响;在扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)下观察骨吸收陷窝,并用图像分析软件统计其面积.采用Western blot法检测橄榄苦苷对破骨细胞特异性蛋白组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、激活T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATC1)及相关信号通路蛋白表达的影响.结果 TRAP染色结果显示,橄榄苦苷能显著抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成,且呈浓度依赖性(P＜0.05);橄榄苦苷能下调破骨细胞特异性蛋白CTSK的蛋白表达水平(P＜0.05);橄榄苦苷对破骨细胞的凋亡无明显影响(P＞0.05);橄榄苦苷能显著减少骨吸收陷窝的面积(P＜0.05);橄榄苦苷能够下调NFATC1及磷酸化p38(p-p38)的表达(P＜0.05).结论 橄榄苦苷可以抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化以及破骨细胞的骨吸收功能,可能和橄榄苦苷能够下调p38/MAPK信号通路有关.     

In vitro and in vivo effects of puerarin on promotion of osteoblast bone formation

Objective:To assess the effect of puerarin,a natural flavonoid found in Chinese Pueraria Lobata (Wild.) Ohwi,on promotion of new bone formation.Methods:Osteoblasts isolated from calvarial of newborn rats were cultured in vitro in the presence of puerarin at various concentrations.The viability of osteoblasts and alkaline phosphotase activity and mineral node formation were determined.In addition,osteoblasts seeded in theβ-tricaclium phosphate scalfolds as bone substitute were implanted in rat dorsal muscles.Half of the recipient rats received intramuscular injection of puerarin at 10 mg/(kg·d) for 7 days.Osteogenesis was analyzed by examining the histology after 4 weeks of implantation.Results:The viability of osteoblasts treated with puerarin at either 40 or 80μmol/L was significantly higher than that of the control(P<0.05 and P<0.01, respectively).Alkaline phosphatase and mineral modules were significantly increased in osteoblasts cultured with puerarin at 40 or 80 mol/L when compared with that of the untreated cells.The puerarin-treated rats had a higher rate of bone formation in the osteoblast implants than the control rats(6.35%vs.1.32%,respectively, P<0.05).Conclusion:Puerarin was able to affect osteoblast proliferation and differentiation,and promote the new bone formation in osteoblast implants.     

熊果酸体外抑制血管形成的研究

目的：探讨熊果酸在体外对血管形成的抑制作用。方法：用ＭＴＴ法、细胞迁移及小管形成实验观察熊果酸对体外培养的血管内皮细胞（ＶＥＣ）增殖、迁移和小管形成能力的影响。结果：熊果酸质量浓度为６２．５～５００μｇ／ｍｌ时,对ＶＥＣ增殖呈剂量依赖性抑制;质量浓度为１２５μｇ／ｍｌ时,对ＶＥＣ迁移及小管形成均有抑制作用（Ｐ〈０．０５）;质量浓度为５００μｇ／ｍｌ时,对ＶＥＣ迁移及小管形成均有较强的抑制作用（Ｐ〈０．０１）。结论：熊果酸在体外具有抑制血管形成的作用。     

Inhibitory effects of high glucose/insulin environment on osteoclast formation and resorption in vitro

Patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) exhibit hyperglycemia and hyperinsulinemia and increased risk of fracture at early stage, but they were found to have normal or even enhanced bone mineral density (BMD). This study was aimed to examine the molecular mechanisms governing changes in bone structure and integrity under both hyperglycemic and hyperinsulinemic conditions. Monocytes were isolated from the bone marrow of the C57BL/6 mice, induced to differentiate into osteoclasts by receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and exposed to high glucose (33.6 mmol/L), high insulin (1 μmol/L), or a combination of high glucose/high insulin (33.6 mmol/L glucose and 1 μmol/L insulin). Cells cultured in α-MEM alone served as control. After four days of incubation, the cells were harvested and stained for tartrate resistant acid phosphatase (TRAP). Osteoclast-related genes including RANK, cathepsin K and TRAP were determined by using real-time PCR. The resorptive activity of osteoclasts was measured by using a pit formation assay. Osteoclasts that were derived from monocytes were of multinucleated nature and positive for TRAP, a characteristic marker of osteoclasts. Cell counting showed that the number of osteoclasts was much less in high glucose and high glucose/high insulin groups than in normal glucose and high insulin groups. The expression levels of RANK and cathepsin K were significantly decreased in high glucose, high insulin and high glucose/high insulin groups as compared with normal glucose group, and the TRAP activity was substantially inhibited in high glucose environment. The pit formation assay revealed that the resorptive activity of osteoclasts was obviously decreased in high glucose group and high glucose/high insulin group as compared with normal group. It was concluded that osteoclastogenesis is suppressed under hyperglycemic and hyperinsulinemic conditions, suggesting a disruption of the bone metabolism in diabetic patients.