台湾海峡异尖线虫病病原线虫幼虫的rDNA序列分析

目的分析台湾海峡异尖线虫病潜在病原线虫的rDNA序列,为建立病原分子生物学鉴别提供依据。方法剖检台湾海峡常见鱼类的寄生线虫幼虫,镜检分类。提取虫体DNA、用通用引物对rDNA进行PCR扩增、克隆、双向测序及BLAST比对。结果获得6条来自6种线虫幼虫的rDNA序列,其中的3种在GenBank数据库中没有发现匹配的序列;证实在台湾海峡分布的灰海鳗对盲囊线虫成虫和疑似其第三期幼虫实属同种;构建了基于ITS-2的序列间内部相似性程度关系树。结论异尖线虫病原幼虫所具有的分子生物学鉴别信息位点主要集中在ITS-2间隔区。     

简单异尖线虫环介导等温扩增(LAMP)鉴定方法的建立和应用

目的 建立快速鉴定简单异尖线虫的环介导等温扩增方法(LAMP). 方法 根据简单异尖线虫ITS保守区域的基因序列设计特异性引物进行LAMP扩增,对反应体系中dNTPs、Mg2+、Betaine和2对引物的浓度,以及反应温度、反应时间等进行优化;在优化后的体系下,将10倍比稀释的简单异尖线虫ITS序列重组质粒进行灵敏性试验;用典型异尖线虫、对盲囊线虫、针蛔线虫对该方法进行特异性试验;并用7份简单异尖线虫样品进行验证. 结果 LAMP的最佳反应体系为0.8 mmoL/L dNTPs、10 mmol/L Mg2+、0.8 mmoL/L Betaine、0.2μmol/L外引物、1.6μmoL/L内引物、8 U Bst DNA聚合酶大片段以及适量的模板,反应温度为62℃,反应时间为60 min;检测简单异尖线虫的灵敏度达到10拷贝/μl,且对典型异尖线虫、对盲囊线虫、针蛔线虫无交叉反应;7份简单异尖线虫样品经LAMP验证均为阳性.结论 LAMP方法灵敏性高、特异性强,并且操作简便、成本低,是鉴定简单异尖线虫的有效手段.     

SYBR Green荧光PCR检测美洲钩虫方法的建立

目的建立荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法。方法提取虫体基因组DNA、根据GenBank中美洲钩虫ITS 2序列设计特异引物,PCR扩增ITS 2序列、克隆、测序和比对。常规PCR检验引物特异性。将ITS 2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做灵敏性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,实验重复性良好。结论成功构建了SYBR Green I荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法,可用于快速、准确、定量检测美洲钩虫。     

黄海和渤海经济鱼类感染内弯宫脂线虫的调查

目的 调查我国黄海、渤海经济鱼类感染异尖科内弯宫脂线虫（Hysterothylacium aduncum）状况。方法 购买石岛渔港销售的鱼类93种941尾，分别解剖收集消化道内线虫，标本经乳酚酸透明，光镜下观察鉴定，同时用扫描电镜观察其超微结构。 结果 调查的93种鱼类中，有14种感染内弯宫脂线虫，占15.1%（14/93），其中感染率较高的为鮟鱇（Lophius litulon， 66.7%）、鳕鱼（Gadus macrocephalus， 47.5%）、马鲅（Scomberomorus niphonius，33.3%）等，首次发现内弯宫脂线虫可在软骨鱼史氏鳐（Raja smirnovi）体内寄生。此外不同宿主体内感染的内弯宫脂线虫形态特征有较大差异，如侧翼宽度以及肠盲囊的长度等有所不同。 结论 黄渤海经济鱼类感染内弯宫脂线虫的情况比较严重，不同宿主鱼类体内感染的内弯宫脂线虫可能是由不同虫体组成的复合体。     

三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR与ELISA检测弓形虫的比较

目的 选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529 bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为real-timePCR检测的靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。方法 将529 bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆、测序构建标准品;将构建的3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR。结果 529 bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数(R²)均为0.998,并且扩增效率均为96.724%,扩增片段的Tm值分别为 86.5±0.5 ℃ 、78.8±0.5 ℃、83.1±0.5 ℃;构建的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR特异性试验表明,529 bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值分别是86.2 ℃、78.9 ℃和83.3 ℃,阴性对照无扩增曲线;敏感性试验表明,529 bp、ITS-1和B1序列最低检出限分别为 173copies/μL、123copies/μL、和135 copies/μL;Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.13%;ELISA检测猪弓形虫IgG抗体的阳性率41.72%,ELISA与荧光定量PCR检测核酸阳性符合率为53.44%(P＜0.01)。结论 建立弓形虫三重SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测技术具有高特异性和敏感性,可为临床弓形虫的诊断提供科学依据     

东台市市售海鱼中异尖线虫感染调查

目的　掌握东台市市售海鱼中异尖线虫感染现状,为评估人群异尖线虫感染风险提供依据。方法　于2018年采集东台市海域捕捞且在当地销售的未经加工的新鲜海鱼,称重后解剖检测异尖线虫（含包囊）。计算海鱼异尖线虫感染率和感染度,分析异尖线虫感染海鱼质量和异尖线虫感染度间的相关性。结果　采集的5种海鱼中有4种（带鱼、马鲛鱼、鲐鱼、小黄鱼）检出异尖线虫。累计采集的149尾海鱼样本中,78尾感染异尖线虫,总感染率为52.35%,带鱼、马鲛鱼、墨鱼、鲐鱼、小黄鱼感染率分别为100.00%（28/28）、30.00%（9/30）、0（0/30）、53.33%（16/30）、80.65%（25/31）。共检出异尖线虫1 049条,总感染强度为13.45条/尾。Spearman秩相关检验显示,带鱼质量与异尖线虫感染度成正相关（rs = 0.38,P = 0.047）;其他鱼类质量和异尖线虫感染度无相关性。结论　东台市近海海域鱼类存在较高异尖线虫感染率,应进一步加大宣传教育力度,倡导市民养成健康安全的饮食习惯。     

福建省闽东渔场海鱼异尖线虫感染调查

目的 了解福建省闽东渔场海洋鱼类异尖线虫感染情况,为制定异尖线虫病控制策略、保障食品安全提供依据。方法 2021年9—12月在福建省闽东渔场沿海蕉城区、福鼎市、霞浦县随机收集海鱼样本,解剖获取鱼腹腔内容物,在体视显微镜下挑取寄生虫,并在镜下根据异尖线虫形态特征鉴定虫种,计算异尖线虫感染率和感染度。结果 共解剖海鱼24种177尾,其中16种73尾海鱼检出异尖线虫,鱼种检出率为66.7%、海鱼总感染率为41.2%;感染度为1～148条/尾,平均感染度为14.3条/尾。异尖线虫感染率较高的鱼种为鳓鱼(5/5)、鮸鱼(3/3)、包公鱼(2/2)、马鲛鱼(12/13)、带鱼(19/23)、白姑鱼(6/11)、海鲫鱼(14/27),平均感染度依次为9.2、2.7、4.5、10.9、39.2、4.5、2.1条/尾。检出的异尖线虫幼虫经鉴定为异尖线虫属和宫脂线虫属。结论 福建省闽东渔场海洋鱼类异尖线虫感染率较高,应加强饮食健康宣传,防止人群异尖线虫病发生。     

简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与表达

目的克隆简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因(AsCP)全长,研究其表达特性。方法根据GenBank中简单异尖线虫表达序列标签L-样半胱氨酸蛋白酶基因的部分信息,设计特异引物,用cDNA末端快速扩增技术扩增3′端部分,获得基因全长序列。根据基因全长序列设计引物,以简单异尖线虫总RNA为模板,RT-PCR扩增AsCP基因编码序列,产物经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆至表达载体pET32а(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3)株,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达效果经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。结果3′端扩增片段大小为1211bp,拼接完整后基因全长1462bp,编码411个氨基酸,与秀丽隐杆线虫的L-半胱氨酸蛋白酶相似性达36.4%;重组载体pET32a(+)-AsCP经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后有一条约1150bp的条带,测序结果显示重组载体构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为Mr60000(含6个组氨酸的标签),与目的蛋白相符。用不同浓度的IPTG诱导对表达量的影响很小,1mmol/LIPTG诱导2h后表达量达到最高水平。结论成功克隆并表达了L-样半胱氨酸蛋白酶。     

异尖线虫分子分类方法概述

异尖线虫传统的分类主要基于形态学方法,但该方法在种属鉴定上较困难.多种分子生物学方法,如多重PCR、PCR-限制性片段长度多态性、PCR-单链构象多态性、DNA序列分析等,应用于异尖线虫分类鉴定,具有快速、准确和特异性高等优点.该文综述了这些技术的基本原理、影响因素及其在异尖线虫分类中的应用.     

上海市市售海鱼异尖线虫幼虫感染情况调查

为了解上海市市售海鱼异尖线虫幼虫感染情况,2022年在上海市农贸市场、超市和海鲜市场中采集自东海海域捕捞的新鲜海鱼,解剖后分别在内脏和鱼肉中查找疑似异尖线虫的虫体,分别置于光学显微镜和扫描电子显微镜下进行观察,分析海鱼的异尖线虫感染情况。共采集海鱼16种338尾,从6种116尾体内检出异尖线虫1 065条,总感染率为34.3%(116/338),平均感染度为9.2条/尾。其中鮟鱇鱼的感染率最高（11/12）,小黄鱼的感染度最高（13.0条/尾）。海鱼异尖线虫感染率从春季到冬季逐渐升高,冬季的感染率和感染度最高,分别为51.1%(46/90)和12.3条/尾。异尖线虫寄生的主要部位是海鱼的肠道和腹腔,分别占检出异尖线虫总数的54.6%(582/1 065)和40.7%(433/1 065)。本研究结果提示,上海市市售海鱼存在异尖线虫幼虫感染,感染率较高的鱼种有鮟鱇鱼、小黄鱼等常见食用海鱼。     

山东部分水产品异尖线虫感染调查

对山东省部分水产品异尖线虫的感染情况进行了调查,海水鱼类感染率达57.93%,有壳类、软体类、深海鱼及淡水鱼类尚未检出异尖线虫感染。     

江苏省沿海地区高危人群异尖线虫感染风险调查

目的了解江苏省沿海地区高危人群异尖线虫感染风险,为制定江苏省异尖线虫病预防控制措施提供基础数据。方法 2018年选择江苏省沿海地区南通市如东县、连云港市海州区和盐城市东台市作为调查点,对从事海鱼捕捞、鲜活海鱼销售、喜食鲜活海鱼者等3类异尖线虫感染高危人群开展异尖线虫病防治知行信调查,检测血清特异性异尖线虫Ig G抗体,并对上述人群血清Ig G抗体阳性的影响因素进行logistic回归分析。采集当地鲜活海鱼样本,检测异尖线虫幼虫感染情况,计算感染率和感染度。结果本次调查3类高危人群625人,其中男性349人(占55.8%)。问卷调查显示,听说过异尖线虫病的有81人(13.0%);3类人群对异尖线虫病防治知识知晓率普遍较低,生食或半生食海鱼者占21.6%,5.8%的调查对象选择吃未煮熟的海鱼;3.2%食用海鱼后出现恶心、呕吐、腹泻等症状;5.1%出现全身过敏症状,65.6%砧板切生熟食不分。血清学检测结果显示,调查人群血清异尖线虫特异性Ig G抗体阳性率为7.0%。Logistic回归分析显示,受教育程度[OR=0.687,95%CI(0.478, 0.987)]和是否存在全身过敏症状[OR=4.641,95%CI(1.411,15.268)]是调查人群血清学Ig G抗体阳性的影响因素。累计调查海鱼494条,异尖线虫幼虫感染率为64.0%,感染度为8.1条/鱼,其中带鱼和青占鱼感染率较高。结论江苏省沿海地区高危人群异尖线虫病防治知识知晓率较低,且存在生食或半生食、砧板切生熟食不分等高危行为;该地区海鱼异尖线虫感染率高。后续应进一步加强异尖线虫病健康教育和健康促进工作。     

异尖线虫过敏原研究进展

异尖线虫（Anisakis spp．）幼虫是重要的人兽共患寄生虫病病原体,呈世界性分布,为我国禁止入境的二类寄生虫。引起异尖线虫病的主要病原体为简单异尖线虫复合种A．simplex complex,包括3个姊妹种（简单异尖线虫A．sireplex s．s．;派氏异尖线虫A．pegreffii和简单异尖线虫C型A．compleax C）。已有的研究报道显示,日本的异尖线虫病主要是由简单异尖线虫引起的;     

2021年烟台市近海海鱼异尖线虫感染率及居民异尖线虫病防治知识知晓率调查

目的 了解2021年山东省烟台市近海海鱼异尖线虫感染率和当地居民异尖线虫病相关知识知晓情况,为制定异尖线虫病防控措施提供参考依据。方法 2021年11月,于山东省烟台市顺鑫港口购买海鱼,检测海鱼异尖线虫感染情况,并分析不同鱼种、不同部位异尖线虫感染率。采用Spearman秩相关分析海鱼体长和体质量与异尖线虫感染度间的相关性,对当地居民饮食习惯和异尖线虫病防治知识知晓率进行问卷调查。结果 共解剖海鱼20种201尾,其中11种77尾检出异尖线虫,鱼种异尖线虫感染检出率为55.00%(11/20)、海鱼总感染率为38.31%(77/201);异尖线虫感染阳性海鱼中累计检出异尖线虫3 468条,平均感染度为45.04条/尾。Spearman秩相关结果显示,鮟鱇鱼体长(r_s=0.74,P <0.05)和体质量(r_s=0.79,P <0.01)与异尖线虫感染度呈正相关,比目鱼体长与感染度呈正相关(r_s=0.68,P <0.05),其他种类海鱼体长、体质量与异尖线虫感染度均无相关性。问卷调查结果显示,53.38%男性...     

TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法 针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR 为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果 构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103~107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论 本研究建立了TaqMan探针FQ-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。     

花鲈感染简单异尖线虫及扫描电镜观察

目的简单异尖线虫(Anisakis simplex)是一类寄生于海水鱼类及哺乳类动物,可引起人类异尖线虫病(anisaki-osis)的食源性人兽共患寄生虫。作者从浙江宁波患病花鲈(Latealabrax japonicus)体内检出简单异尖线虫,检出率为100%(11/11)。患病鲈鱼体表无异常症状,解剖鱼体在肝脏、胃壁、肠壁、肠系膜等部位均有简单异尖线虫寄生,线虫盘成螺旋状包于包囊内,病鱼感染线虫强度为20～30条/尾。感染严重病鱼出现胃穿孔、胃壁出血、肝脏具白色结节等病症。光学显微镜观察线虫虫体为长圆筒形,两端较细,肌质食道,腺体的胃位于食管后面,黑色不透明,和肠连接处有一斜的分界线。扫描电镜观察虫体体表具致密环纹,前端钝圆,具1个钻齿和4个钝角状乳突,排泄口位于腹侧两个乳突之间,尾部短而圆,末端具一明显尾突。     

荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针,以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900HT)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果几乎为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0~2.1%之间,证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本,结果与套式PCR检测结果有密切相关性,但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。     

南海,渤海鱼类简单异尖线虫幼虫感染的调查

目的：为了解我国南海、渤海各种鱼类中人体异尖线虫病的主要致病原——简单异尖线虫幼虫的感染状况而进行本调查。方法：取南海８８个鱼种３８９尾、渤海２０个鱼种４７１尾，分别测定体长及体重后解剖鱼体进行检查。检获的虫体清洁后用７０％酒精固定，用甘油酒精透明，在显微镜下鉴定。结果：南海部分检获幼虫的鱼种占被检鱼种数的６０．２％（５３／８８），阳性鱼种检得幼虫者占阳性鱼种的５３．６％（１４２／２６５），占所检鱼总尾数的３６．５％（１４２／３８９）；渤海部分检出幼虫的１１个鱼种占所检鱼种的５５％（１１／２０），阳性鱼种总检鱼数３７８尾中，检得幼虫者占阳性鱼种５０．５％（１９１／３７８），占所检鱼总尾数的４０．５％（１９１／４７１）。结论：两个海域中鱼类简单异尖线虫幼虫的感染率都相当高，因此凡生食本文所列的阳性海鱼时，不应疏忽对异尖线虫病的预防。以上在流行病学和食品卫生方面均有重要意义。     

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。     

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。