Yeast One-hybrid System Used to Identify the Binding Proteins for Rat Glutathione S-transferase P Enhancer I

INTRODUCTIONRat glutathione S-transferase P (GST-P) which is absent from the normal hepatocytes,is specifically induced at an early stage of chemical hepatocarcinogenesis[1-4]. It appearsto be a reliable marker for hepatocellular carcinogenesis in rat[5].…     

应用酵母单杂交体系筛选与大鼠谷胱甘肽S—转移酶P增？…

目的 探讨谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ－Ｐ）基因表达调控机制的多样性及其与化学致癌的关系,筛选与大鼠ＧＳＴ－Ｐ增强子元件ＧＰＥⅠ相互作用的调控因子。方法 采用酵母单杂交体系重申选与ＧＰＥⅠ核心序列相互作用的转录激活因子,应用ＤＮＡ序列测定及计算机分析等手段对所测的ＤＮＡ序列进行分析。结果 共获得两个阳性克隆ｐＹＧＰＥ１和ｐＹＧＰＥ２。ＤＮＡ测序分析表明：ｐＹＧＰＥ１的插入片段与大鼠原癌基因ｃ－ｊｕｎ     

大鼠谷胱甘肽S-转移酶P1基因顺式调控元件的搜寻

目的搜寻大鼠谷胱甘肽Ｓ－转移酶Ｐ１基因（ｒａｔｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓ－ｆｅｒａｓｅＰ１，ｒＧＳＴＰ１）上游３．０ｋｂ区域内顺式调控元件。方法采用高灵敏度的荧光素酶报告基因载体，以外切酶Ⅲ（ＥｘｏⅢ）、Ｓ１核酸酶对上述３．０ｋｂ片段进行删切后造成缺失，将所获得的一系列缺失质粒分别转染ＨｅＬａ细胞，测定转染细胞裂解液荧光素酶活性。结果当删切从－２．９ｋｂ进展至－２．３ｋｂ时，荧光素酶活性降低６７％（Ｐ＜０．０５），－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ区域能以不依赖于位置、方向性的方式增强基因表达强度，从－１．８ｋｂ缺失到－１．３ｋｂ时，荧光素酶活性升高４倍（Ｐ＜０．０５）。结论ｒＧＳＴＰ１基因上游在－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ及－１．８ｋｂ～－１．３ｋｂ区域内分别存在增强子元件和负调控序列。     

三氯化镧对大鼠肝癌细胞株CBRH-7919细胞生长的影响

目的：研究三氯化镧(LaCl₃)对大鼠肝癌细胞生长的影响。 方法：以体外培养大鼠肝癌细胞株CBRH-7919为研究对象,给予LaCl₃(0.01、0.10及1.00 mmol•L^-1)培养不同时间(1、3和5 d)后,观察CBRH-7919细胞生长、集落形成及细胞学变化。同时,运用流式细胞术检测CBRH-7919细胞周期变化。 结果：0.10 mmol•L^-1 LaCl₃组培养3 d,对CBRH-7919生长具有明显的抑制作用（P<0.01）,随着LaCl₃剂量增加和培养时间延长,对该细胞生长的抑制作用明显增强（P<0.01）;0.1、1.00 mmol•L^-1 LaCl₃组的集落形成抑制率同对照组相比,差异均有显著性（P<0.01）。CBRH-7919细胞经LaCl₃作用后,G₀/G₁期细胞百分数增加,0.01、0.10和1.00 mmol•L^-1 LaCl₃组与对照组相比,差异均有显著性（P<0.01）;S期细胞百分数减少,0.10、1.00 mmol•L^-1 LaCl₃组与对照组相比,差异均有显著性（P<0.05）。 结论：LaCl₃对CBRH-7919细胞生长具有明显的抑制作用。     

山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖抑制及诱导凋亡作用

[目的]观察山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响.[方法]选用CBRH7919肝癌细胞株,传代培养24 h后,加入不同浓度山奈酚处理,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡形态,彗星电泳技术和流式细胞术检测药物对细胞DNA的作用.[结果]山奈酚体外能抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖,以6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L浓度的山奈酚处理细胞72 h,对CBRH7919细胞的增殖抑制率显著升高,呈明显的剂量效应关系.用50、100μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞24、48、72、96 h,对细胞的增殖抑制作用显著增强,呈明显的时间效应关系,即药物作用时间越长,抑制作用越强.DAPI染色显示不同浓度山奈酚组的细胞均有明显的细胞凋亡特征.彗星电泳显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h后,细胞后面均呈现长度不等的拖尾,平均光密度值较空白对照组显著降低(P<0.01),彗星尾距较空白对照组显著增加(P<0.01),且两者改变与药物浓度相关.流式细胞仪检测结果显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期被阻滞于S期,不同浓度山奈酚组凋亡率较空白对照组均明显增高.[结论]山奈酚可能通过抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖及诱导其凋亡而产生抗肿瘤作用.     

吴茱萸碱对大鼠肝癌细胞缝隙连接细胞通讯功能及连接蛋白表达的影响

目的探讨吴莱萸碱抗肿瘤的作用机制。方法用终浓度为0．1,0．2,0．3μmol／L的吴茱萸碱作用于CBRH7919细胞,同时设不加吴茱萸碱的空白对照组。采用划痕标记染料示踪技术检测各组细胞缝隙连接细胞通讯（gap junctional intercellular communication,GJIC）功能;异硫氰酸荧光素间接免疫荧光法检测连接蛋白（connexin,Cx）26、Cx32表达的变化。结果与空白对照组相比,吴莱萸碱各浓度组CBRH7919细胞Cx26、Cx32表达显著增加,GJIC功能增强,并呈一定的剂量效应依赖关系。结论吴茱萸碱上调CBRH7919细胞Cx26和Cx32的表达及促进CBRH7919细胞的GJIC功能,可能是其抗肿瘤的机制之一。     

六味地黄丸调控肝癌CBRH7919细胞Cx43表达的体外研究

【目的】探讨六味地黄丸对大鼠肝癌CBRH7919细胞缝隙连接蛋白(Cx)43表达的影响。【方法】应用血清药理学方法制备六味地黄丸含药血清,分别采用蛋白免疫印迹(Western blot)法、异硫氰酸荧光素(FITC)标记间接免疫荧光染色—激光共聚焦显微镜技术、流式细胞术检测不同剂量(体积分数0%、2.5%、5%、10%)六味地黄丸含药血清组CBRH7919细胞Cx43蛋白的表达,采用实时定量逆转录—聚合酶链反应(RT-q PCR)检测各组肝癌细胞Cx43 m RNA的表达。【结果】与对照组(0%六味地黄丸含药血清)比较,体积分数为2.5%、5%、10%的六味地黄丸含药血清均能明显提高肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白及m RNA表达水平。【结论】六味地黄丸可能是通过促进肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白及m RNA的表达,改变Cx43膜定位,改善细胞间缝隙连接通讯功能,从而发挥抑制肝癌的作用。     

逆转录病毒转染法建立耐药性大鼠CRBH-7919细胞系

目的:建立高效、稳定的大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系.方法:利用逆转录病毒转染法将带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR转入到大鼠CRBH-7919细胞中,MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的存活率;免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-GP)表达,RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量,PCR检测mdr1基因转移到细胞内的基因片段.结果:转基因的细胞系对阿霉素、丝裂霉素的耐药性分别提高 9和7.9倍,免疫组化见转基因细胞系P-GP表达增加,RT-PCR示细胞内mdr1 mRNA的表达量增加,PCR表明转基因细胞内扩增出mdr1片段.结论:利用逆转录病毒转染法成功建立了大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系,该细胞系具有耐药强度高、耐药性稳定等特点.     

胰岛素、环磷酸腺苷和皮质激素对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子的顺反式调节

目的观察体外环磷酸腺苷(cAMP)、皮质激素(DEX)和胰岛素对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)550 bp启动子片段的顺反式作用.方法将重组的pGL2-PEPCK-Luc荧光素酶表达质粒通过脂质体转染法与内对照质粒pSV-β-Galactosidase共同转染大鼠肝肿瘤细胞系CBRH7919,通过荧光素酶报告系统观察胰岛素、cAMP和DEX对PEPCK启动子的调控作用.结果cAMP和DEX对PEPCK具有明显兴奋作用,两者同时刺激具有叠加效应.生理浓度下,胰岛素对基础状态及cAMP和DEX激活的PEPCK启动子均有明显的抑制作用,并且呈剂量依赖性.结论550 bp(-600- 69)PEPCK调控序列在肝细胞内具有较完善的正负反馈调节机制,可以作为糖尿病基因治疗的候选基因.     

Anticancer Drug Resistance of HeLa Cells Transfected With Rat Glutathione S-transferase pi Gene

Objective To establish a cytologic expressing system of rat glutathione S-transferase pi (GST-pi) cDNA for detecting the resistance of HeLa cells to anticancer drugs. Methods The assessment was made with various anticancer drugs (adriamycin, mitomycin, cisplatinum and vincristine) that showed different cytotoxicities in transfectant HeLa cells with pSV-GT containing rat GST-pi cDNA (HeLa/pSV-GT) or control pSV-neo (HeLa/pSV-neo). Expression levels of GST-pi mRNA in HeLa/pSV-GT and HeLa/pSV-neo were measured by in situ hybridization using Digoxin-labelled cDNA probe. Results HeLa/pSV-GT expressed significantly high degree of GST-pi mRNA, whereas both HeLa/pSV-neo and HeLa cells had very low expression. Cytotoxicities of HeLa/pSV-GT and HeLa/pSV-neo with 4 anticancer drugs were measured by MTT assay. Drug concentrations for yielding 50% inhibition (IC50) in HeLa/pSV-GT by adriamycin, mitomycin and cisplatinum were 70.13μg/mL, 10.95μg/mL and 16.52μg/mE respectively. In contrast, IC50 in HeLa/pSV-neo was 10.34μg/mL, 7.48μg/mL and 13.70μg/mE respectively. The cytotoxicities of vincristine on both HeLa/pSV-GT and HeLa/pSV-neo were not significantly different. Conclusions Our findings suggest that HeLa/pSV-GT containing rat GST-pi cDNA is resistant to some anticancer drugs due to overexpression of GST-pi. Also, HeLa/pSV-GT cell line could serve as a useful cytogenetic model for further research.     

角质细胞生长因子对大鼠肝癌细胞CBRH-7919增殖的影响

目的 研究角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)对大鼠肝癌细胞CBRH-7919增殖的影响.方法 MTT法检测不同浓度的重组人角质细胞生长因子(K102)对CBRH-7919细胞增殖的影响;免疫细胞化学技术检测角质细胞生长因子受体(keratinocyte growth factor receptor, KGFR)在CBRH-7919细胞中的表达.结果 KGFR在CBRH-7919细胞的胞膜和胞质中均有表达,MTT实验显示K102对CBRH-7919细胞增殖作用与对照组相比无统计学差异(P＞0.05).结论 KGFR在CBRH-7919细胞的胞膜和胞质中存在表达,但K102对肝癌细胞CBRH-7919的增殖无明显作用.     

三氯化镧对CBRH-7919细胞Cyclin D_1基因表达的影响

目的:研究三氯化镧对大鼠肝癌细胞CyclinD1基因表达的影响,探讨三氯化镧抑制肝癌细胞生长的机制。方法:以体外培养大鼠肝癌细胞株CBRH-7919为研究对象,给予0.01、0.1、1.0mmol/LLaCl3,培养3、5、7d后,运用流式细胞术检测CBRH-7919的细胞周期时相变化。采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学技术检测CyclinD1的基因表达。结果:0.1、1.0mmol/LLaCl3组培养3、5、7d后,G0/G1期细胞百分数均有显著性增加;CyclinD1的转录和蛋白表达均显著减弱。结论:LaCl3可通过下调CyclinD1的转录和蛋白表达,使肿瘤细胞从G1期进入S期受阻,从而抑制CBRH-7919细胞的生长。     

Fudenine——一个新的与血糖调节相关的膜蛋白

目的：确定Fudenine是否为一个新的膜蛋白。方法：用绿色荧光蛋白（GFP）对Fudenine进行体内定位，以GFP（一种代谢稳定的蛋白）定位于细胞质中，作为对照, 将融合质粒Fudenine-GPF肯时转染CBRH7919和L－6TG两种细胞，48h后荧光显微镜下观察。结果：报告质粒GFP表达产物定位于胞质中，而融合质粒产物定位于细胞膜上。结论：Fudeinine是一种膜蛋白，它可能与其同源基因prominin和AC133的抗原有相似的功能，在血糖调控和信号转导等方面发挥作用。     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。     

顺铂耐药人宫颈癌HeLa细胞株的建立及其相关耐药微小RNA的表达情况

目的 建立顺铂耐药的人宫颈癌HeLa细胞株,观察其耐药相关微小RNA(miRNA)的表达情况.方法 采用小剂量诱导法建立对顺铂耐药的人宫颈癌细胞株(HeLa/顺铂细胞).比较HeLa细胞株和HeLa/顺铂细胞株的细胞倍增时间、半数抑制浓度(IC50)、耐药指数(RI)、相关耐药基因表达情况及其细胞培养液中肿瘤标志物水平,并分析两种细胞株间异常表达的miRNA表达情况.结果 HeLa/顺铂细胞倍增时间及IC50长于或大于HeLa细胞(均P<0.05),RI值为7.14.HeLa/顺铂细胞培养液癌胚抗原、糖蛋白抗原-125水平均高于HeLa细胞(P<0.05);HeLa顺铂细胞中肺耐药蛋白-1、多药耐药相关蛋白-1及谷胱甘肽S-π的mRNA相对表达量均高于HeLa细胞(P<0.05).HeLa/顺铂细胞miR-29a和miR-34a相对表达量高于HeLa细胞,而miR-99a、miR-92a、miR-155、miR-375、miR-195的相对表达量低于HeLa细胞(均P<0.05).结论 成功建立顺铂耐药HeLa细胞株,其相关耐药miRNA的表达与HeLa细胞株存在差异.     

三氯化镧对肝癌细胞P16和P21蛋白表达的影响

目的: 研究三氯化镧（LaCl₃）对大鼠肝癌细胞P16和P21蛋白表达的影响。法：实验分为4组,3个实验组：CBRH-7919细胞分别培养在含0.01、0.10和1.00 mmol•L-1 LaCl₃的DMEM培养液中;对照组：CBRH-7919培养在不含LaCl₃的DMEM培养液中。培养时间分别为1、3和5 d。观察细胞生长变化,运用流式细胞术检测细胞周期变化,采用免疫细胞化学方法检测与G₁期调控有关的P16和P21的变化情况。结果：与对照组比较,0.10和1.00 mmol•L-1LaCl₃组培养后3 和 5 d CBRH-7919细胞的生长抑制率均明显增加（P< 0.01）,G₀/G₁期细胞百分数显著增加（P< 0.01）,P16和P21阳性率明显增加（P< 0.01）。 结论：LaCl₃可通过上调P16和P21,使肿瘤细胞从G₁期进入S期受阻,从而抑制CBRH-7919细胞生长。     

人端粒结合因子在端粒酶阳性和阴性细胞中的定位与周期性表达的研究

目的:研究人端粒结合因子1(telomere repeat binding factor 1,TRF1)在端粒酶阳性和阴性细胞中的定位以及在细胞周期中的表达.方法:应用分子克隆技术扩增TRF1基因全长(TRF1FL)和N、C端缺失突变体(TRF1ΔNC)序列,并克隆入pEGFP-C2真核表达载体,表达绿色荧光(GFP)融合蛋白;将含目的基因质粒转染端粒酶阳性Hela细胞和端粒酶阴性WI38-2RA细胞,Western Blot验证目的蛋白分子量,荧光显微镜观察TRF1在间期细胞和染色体的定位;利用药物阻断HeLa细胞于不同周期,流式细胞仪检测细胞周期,半定量Western Blot检测TRF1在不同细胞周期中的表达.结果:TRF1FL、TRF1ΔNC序列长度分别为1.3 kb和0.9 kb;GFP融合TRF1FL、TRF1ΔNC分子量大小分别为80 kD和60 kD.TRF1FL在间期细胞胞核内呈点状表达,在染色体则表达于染色体未端,TRF1ΔNC在细胞核内呈弥散性表达;TRF1在端粒酶阴性细胞中与早幼粒细胞白血病小体(promyelocytic leukemia body,PML)共定位,在端粒阳性细胞中则没有共定位.TRF1在HeLa细胞中以M期表达量最高,G1/S表达最低,M期表达量是G1/S期的3.9倍(t=12.92,P<0.01).结论:TRF1在端粒酶阳性和阴性细胞中有不同的定位模式,在HeLa细胞中TRF1呈周期性表达.     

谷胱甘肽巯基转移酶pi参与肿瘤细胞耐药性的产生

目的建立携带大鼠谷胱甘肽巯基转移酶ｐｉ（ＧＳＴ－ｐｉ）ＣＤＮＡ的细胞表达体系。方法用磷酸钙沉淀法将重组质粒ｐＳＶ－ＧＴ和载体质粒ｐＳＶ－ｎｅｏ分别转染ＨｅＬａ细胞,Ｇ４１８筛选得两株转染阳性细胞ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ和ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ;采用细胞原位杂交法,以地高辛标记的ＧＳＴ－ｐｉ　ｃＤＮＡ为探针,检测两细胞株ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的表达水平;用ＭＴＴ法检测不同抗癌药物对细胞株的毒性作用。结果ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ表达明显升高,而ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ和ＨｅＬａ细胞的表达水平很低。阿霉素、丝裂霉素Ｃ和顺铂对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＩＣ５０分别为７０．１３、１０．９５和１６．５２ｕｇ／ｍｌ,对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ的ＩＣ５０分别为１０．３４、７．４８和１３．７０ｕｇ／ｍｌ,长春新碱对两细胞株的毒性无明显差别。结论ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ细胞具有较高的耐药性。ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的大量表达可能是产生多药耐药的原因,此细胞株可作为一个稳定的遗传学系统在ＧＳＴ－ｐｉ与肿瘤细胞耐药的研究中广泛应用。     

小鼠Alb e／p序列与肝癌细胞核蛋白之间的相互作用

目的：研究肝癌组织特异性基因治疗的机理。方法：从小鼠肝细胞、肝癌细胞和黑色素瘤细胞中分别提取核蛋白组分和胞浆蛋白，分别与小鼠白蛋白增强子／启动子（Ａｌｂｅ／ｐ）、白蛋白增强子（Ａｌｂｅ）和白蛋白启动子（Ａｌｂｐ）结合。结果：Ｂａｎｄ－Ｓｈｉｆｔ试验和竞争试验发现某些肝癌细胞核蛋白组分能与Ａｌｂｅ／ｐ特异结合，其中与Ａｌｂｅ和Ａｌｂｐ特异结合的核蛋白在不同的组分中，而肝癌细胞胞浆蛋白和黑色素瘤细胞核蛋白不能与Ａｌｂｅ／ｐ结合。结论：提示肝癌细胞核中能与Ａｌｂｅ和Ａｌｂｐ作用的核蛋白是应用Ａｌｂｅ／ｐ调控目的基因于肝癌细胞中特异表达的基础。