The intraspecific difference of the triose phosphate isomerase (tim) gene from Giardia lamblia

目的：探讨蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）磷酸丙糖异构酶基因种内差异。方法：提取虫体总DNA,对所有虫株磷酸丙糖异构酶（tim）基因部分片段进行PCR扩增。测定序列后,用简约法和NJ法构建系统树进行系统发育分析。结果：共有124个位点存在变异（占所有测定序列中的23％）,且大多数为发生在密码子的同义突变。两种构树方法所得二树的分枝结构相似,均将受试的16株蓝氏贾第虫分为明显的两组。结论：宿主及地理因素对蓝氏贾第虫群体的遗传多样性影响不大。在DNA分子进货水平上,自然选择的影响十分显。可将tim基因作为蓝氏贾第虫群体遗传结构一个十分有效的遗传标记。     

蓝氏贾第鞭毛虫承德株分子生物学研究

目的：探讨蓝氏贾第鞭毛虫大、小型包囊存在的原因。方法：用分子生物学技术对３株贾第虫（ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）进行ｔｉｍ基因扩增和序列测定。结果：经与ＧｅｎＢａｎｋ登记虫株比较和用ＤＮＡｓｔａｒ软件处理的结果表明,此３株贾第虫的基因型属２型（ＪＨ型）。结论：大、小型包裹在形态学上经过统计学处理显示有显著差异,但与基因型无关。     

人源性蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因的克隆及序列分析

目的克隆蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因,并应用生物信息学方法进行分析。方法根据蓝氏贾第鞭毛虫Elp3已知基因序列的特点设计引物,利用PCR技术扩增获得Elp3的核苷酸序列,连接到pET28a载体并测定序列。应用生物信息学方法分析Elp3基因的序列同源性与结构特征。结果扩增片段长度为1767bp,测序结果与蓝氏贾第鞭毛虫WB株(GL50830)同源性100%。可构建生物进化树,进行同源结构建模发现,71-362aa具有一个保守的S-腺甙基蛋氨酸区域,458-584aa具有组蛋白乙酰基转移酶区域。结论成功克隆了蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因,生物信息学分析发现,其在进化上与其它物种不属同一起源,具有SAM和HAT的结构和功能,这些发现为进一步研究其生物学功能提供了依据和线索。     

4株蓝氏贾第虫总细胞蛋白质等电聚焦电泳分析

用薄层等电聚焦电泳法，对分离自我国北京、四川、福建以及美国的４株蓝氏贾第虫总细胞蛋白质做了分析。结果表明，国内３株的带型基本一致，各带分布于标准ｐＩ３．６～８．３之间；美国１株的带型与国内３株的不同，多出２条区带，分别位于ｐＩ７．８和７．１处。提示中美虫株在蛋白质组成成分上存在差异，其原因可能系地理分隔所致。     

Establishment of a C57BL/6N mouse model of giardiasis

建立人源蓝氏贾第鞭毛虫C57BL/ 6N小鼠动物感染模型。方法　用分离自河北和江苏两地蓝氏贾第鞭毛虫感染者的包囊 (河北株 ,CD和徐州株 ,XZ)分别感染两组C57BL/6N小鼠 ,收集受染鼠粪便 ,用蔗糖梯度离心法分离纯化包囊 ,计算排囊数量 ,分析排囊规律 ;观察小肠病理组织学改变。结果　C57BL/ 6N小鼠对此 2株蓝氏贾第鞭毛虫具有很高的易感性 ,接受具有活力的 1× 1 0 4 个包囊 /只的 3 6只小鼠 ,均获得感染 ,其中呈间歇性排囊者为 3 2只 ( 88 9% ) ,连续性排囊者 4只 ( 1 1 1 % )。排囊潜伏期为接种后第3d ,高峰期为第 6d。 2小时所排粪便含包囊数最高可达 2 3× 1 0 7个 /g粪。小肠粘膜出现表面分泌物增加 ,间质充血、水肿 ,炎性细胞浸润 ,粘膜坏死脱落等病理变化。结论　C57BL/ 6N小鼠可作为建立蓝氏贾第鞭毛虫感染的良好动物模型     

蓝氏贾第鞭毛虫中国株组蛋白H2A基因的克隆与重组表达

目的 获取蓝氏贾第鞭毛虫中国株GlH2A基因及重组蛋白.方法 PCR扩增获取G1H2A基因,连接至pMD-19T并进行测序分析.连接至pET28a构建表达载体,并转化宿主菌E.coli BL21 (DE3),然后进行异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达.表达产物进行亲和层析纯化,再用Western blotting...     

蓝氏贾第鞭毛虫甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因的克隆、表达与纯化

目的 蓝氏贾第鞭毛虫（简称为贾第虫）甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因（GlMSR）,进行原核表达获得其重组蛋白。方法 依据GenBank中GlMSR序列设计引物,以贾第虫中国C2 克隆株基因组DNA 为模板,通过PCR扩增编码序列,将所得片段连接至质粒pET28a以构建原核表达载体pET28a-GlMSR,将pET28a-GlMSR导入大肠杆菌E.coli JM109并挑取阳性克隆进行基因测序和鉴定。用化学方法将经测序验证的重组质粒pET28a-GlMSR转化至E.coli BL21（DE3）。经异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白表达结果。收集沉淀中的重组表达产物,镍柱亲和层析纯化带组氨酸标签的重组蛋白,并通过免疫印迹鉴定纯化结果。结果 电泳结果显示在约624 bp处出现目的DNA条带,表明成功得到GlMSR编码序列;PCR 鉴定、酶切鉴定以及基因测序结果表明成功构建重组表达载体pET28a-GlMSR,经IPTG诱导后在沉淀中获得目的蛋白,目的蛋白分子量（Mr）约为25 000,与预期分子量（Mr）22 800基本相符。经Western blot分析显示该重组蛋白含有His6标签。结论 本研究克隆、表达了蓝氏贾第虫GlMSR基因,并纯化获得重组蛋白,为进一步探索该酶的功能奠定了基础。     

Opsonic requirements for the respiratory burst of neutrophils against Giardia lamblia trophozoites

BACKGROUND: Giardia lamblia is an important cause of parasitic diarrheal disease worldwide. Occasionally, polymorphonuclear neutrophils (PMNs) may participate as effector cells against Giardia lamblia. The present study was performed in order to examine the role of specific antibody and complement components in promoting the respiratory burst (RB) of PMNs against Giardia lamblia. METHODS: PMNs from human adult volunteers were incubated with Giardia trophozoites in the presence of non-immune (NS) or hyperimmune (HS) serum (anti-Giardia titer, >1:1024). Adherence was scored visually on coverslide after staining with Giemsa. The ability of Giardia to trigger the oxidative response of PMNs was measured by the anion superoxide (O2(-)) production using a cytochrome C reduction method and by the luminol amplified chemiluminescence (CL) assay. RESULTS: Incubation with NS or HS increased Giardia adherence to PMNs from 6.9 +/- 3.2% (basal adherence of Giardia incubated in buffer) to 39 +/- 18.6% (p <0.01) and 76 +/- 19.5% (p <0.001), respectively. In absence of serum, Giardia failed to trigger an oxidative response of PMNs. Opsonization with NS or HS increased the PMN O2(-) production from 3.9 +/- 0.92 nmol/2.5 x 10(6) PMNs/10 min to 9.04 +/- 1.68 (p <0.05) and 17.9 +/- 1.32 (p <0.001), respectively. A similar enhancement of the CL response was also observed. The inactivation of complement activity by heat as well as the elimination of specific antibodies by absorption produced a significant abrogation of the oxidative response but in the case of HS heat inactivation alone did not abolish the response. Similar findings (variable abrogation of the oxidative PMN response) were observed when PMNs were incubated with monoclonal antibodies directed against complement C3, C3b or the low-affinity Fc receptors (CR1, CR3 or FcRlo). CONCLUSIONS: These results show that complement components and specific antibodies influence in the Giardia-PMN interaction. Although components of complement can contribute to the RB of PMNs, specific antibodies are critical for an optimal oxidative PMN response.     

人源蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)病毒部分基因的克隆及序列分析

目的：从我国蓝氏贾第虫（Giardia lamblia)中寻找贾第虫病毒。方法 对人源贾第鞭毛虫北京株进行了体外纯培养，将其总核酸电泳，并用DNA酶和RNA酶处理。根据已发表的蓝氏贾第虫病毒基因序列合成一对引物并进行RT－PCR，将产物回收后连接到Pmd18-T载体上进行克隆并测序，通过BLAST对Gen Bank进行同源性搜索。在贾第虫总核酸电泳图谱上观察到一个分子量约7．0kb的片段。该核酸不能被DNA酶（100μg/ml）降解。但可被RNA酶（10μg/ml）降解。经RT－PCR扩增后得到1条预计856bp的片段，所得序列与蓝氏贾第虫病毒基因同源性为98％。结论 在我国人源贾第鞭毛虫北京株中发现贾第虫病毒，该病毒属于蓝氏贾第虫病毒。     

云南大理在校大学生3种肠道原虫分子流行病学调查

目的 了解云南大理在校大学生蓝氏贾第鞭毛虫、人芽囊原虫、毕氏微孢子虫的感染情况,为青少年肠道寄生原虫病的防治工作提供参考依据。方法 采集426份云南大理在校大学生粪便样本,提取DNA,根据设计的引物序列进行PCR扩增,通过测序和序列比对,确定其基因型并构建遗传进化树。应用软件SPSS 19.0进行统计学分析。结果 426份在校大学生粪便样本中PCR扩增出25份阳性样本,3种原虫感染率分别为：蓝氏贾第鞭毛虫4.23%（18/426）、人芽囊原虫1.41%（6/426）、毕氏微孢子虫0.23%（1/426）;蓝氏贾第鞭毛虫感染率在不同性别、民族之间差异均无统计学意义（P>0.05）,来自农村的学生感染率5.57%显著高于城镇学生0.83%（P<0.05）;人芽囊原虫感染率在不同性别之间差异无统计学意义（P>0.05）,少数民族感染率1.99%略高于汉族感染率0.57%,但不同民族、生源地之间差异均无统计学意义（P>0.05）。经鉴定蓝氏贾第鞭毛虫、人芽囊原虫、毕氏微孢子虫的基因型分别为AⅠ亚型、ST1型、EbpC型,且均为人兽共患基因型。结论 大理在校大学生存在蓝氏贾第鞭毛虫、人芽囊原虫、毕氏微孢子虫感染,具备潜在的传播风险。学校应加强对青少年学生的卫生宣传教育,培养学生养成良好卫生习惯,提高学生自我保健能力。     

应用氯化锶对小鼠卵母细胞孤雌活化的研究

根据弓形虫P30基因序列设计二对引物分别进行了PCR一次扩增和套式扩增，结果这两对引物在一次扩增和套式扩增中分别出现预期的扩增片段914bp,522bp和522bp；套式扩增出现的条带比一产供销扩增出现的条带亮度明显增强，提示套式扩增比一次扩增具有更高的敏感性，用外引物进行扩增后，最低可以检测到1pg的弓形虫DNA，说明所建立的反应体系具有高度的敏感性。用内引物对人工感染弓形虫的ICR小鼠血液，组织进行弓形虫DNA的检测，结果均扩增出522bp的扩增带。根据B1基因序列设计的弓物进行PCR一次扩增和半套式扩增。结果均出现预期的扩增片段619bp,362bp和362bp；用半套式扩增检测感染弓形虫形虫的ICR小鼠血液，组织时可扩增出522bp的619bp,362bp和362bp；用半套式扩增检测感染弓形虫的ICR小鼠血液，组织时可扩增出522bp的扩增带，半套式扩增比一次扩增更敏感。     

庚型肝炎病毒非结构基因（NS）5区部分序列的一级结构及其变异

测定庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构基因５（ＮＳ５）区部分基因序列。方法从３例献血员，２例肝硬化患者及１例非甲－戊型肝炎患者血清中通过逆转录－套式－聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长９９４ｂｐ的ｃＤＮＡ序列，ＰＣＲ产物纯化后以双脱氧末端终止法测定其序列。结果所分离的６株ＨＧＶＮＳ５区部分核苷酸序列与国外报道的３株（ＧＢＶ－Ｃ、ＰＮＦ２１６１、Ｒ１０２９１）比较，同源性为８７．２％～９３．９％；６株间同源性为９０．１％～９３．８％。根据所测得的６株ｃＤＮＡ序列推导出其编码的氨基酸序列，与国外发表的３株序列相比，同源性在９３．６％～９８．７％，６株之间为９３．６％～９８．４％。在此区内发现有１６个保守的脯氨酸残基及８个保守的半胱氨酸残基。结论从不同慢性肝脏疾病患者及献血员血清中分离出６株ＨＧＶ，其ＮＳ５区部分序列在核苷酸水平及氨基酸水平均较保守。可依赖此区序列设计诊断试剂     

污水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测的结果分析

目的调查深圳市污水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫污染情况。方法采用免疫磁分离姬姆萨染色法，对深圳市内3家污水处理厂处理后排出的污水，进行对病原虫的离心沉淀、淘洗、磁分离及染色鉴定。检测污水中的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫包囊的含量。结果3家污水处理厂中有2家在处理后的污水中检出隐孢子虫和贾第鞭毛虫。结论目前污水处理厂处理后的水仍可检出致病原虫，表明地面水存在水污染的危险性。     

饮用水中隐孢子虫与贾第氏鞭毛虫的检测

目的 对宝安区3个水厂的出厂水与水源水进行检测，以了解深圳市宝安区饮用水中隐孢子虫和贾第氏鞭毛虫的污染。方法参考美国EPA1623标准方法检测。结果出厂水未发现病原虫，水源水中检出病原虫。结论以该方法检测宝安区饮用水源水中存在隐孢子虫和贾第氐鞭毛虫的污染，应引起相关部门的关注。     

体外诱导蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的成囊和脱囊

目的 在体外诱导蓝氏贾第鞭毛虫C2株完成其生活周期。方法 通过提高改良TY-S-33培养基中的胆汁浓度至10mg／ml、pH至7．8来诱导成囊；体外诱导的包囊先经酸刺激，再用胰蛋白酶处理而诱导其脱囊。结果 体外成功诱导了蓝氏贾第鞭毛虫的成囊和脱囊。体外诱导的包囊呈椭圆形，光镜下观察有折光性，经诱导后，部分脱囊或完全脱囊成滋养体，形成的滋养体接近于梨形。结论 通过诱导，蓝贾第鞭毛虫C2株可在体外完成其生活史。     

控制性降压下失血对大鼠海马CA1区细胞凋亡的影响

目的：观察控制性降压下不同程度失血对大鼠海马CA1区细胞凋亡的影响。方法：36只SD大鼠随机分成对照组（C组）和控制性降压组（H组）,组内按失血量占全身血容量的百分比不同各分为3组:C1,H1组（10％组）;C2,H2组（20％组）;C3,H3组（30％组）。H组泵入硝普钠复合艾司洛尔控制性降压至平均动脉压50～55 mmHg,稳定10 min后维持此时泵速并开始放血,C 组泵注生理盐水,放血过程同H组,均60 min后复压。用免疫组织化学法检测存活24 h大鼠海马CA1区bcl-2和caspase-3蛋白表达,TUNEL法检测凋亡细胞。结果：Bcl-2和caspase-3的平均光密度值H3组高于C3组(P＜0.05), TUNEL检测的凋亡细胞H3组多于C3组(P＜0.05)。结论：控制性降压下大鼠失血30%可诱导海马CA1区细胞凋亡的发生     

四川荥经县艾伯特埃希菌的分离与鉴定

目的 按照自贡市疾病预防控制中心编制的艾伯特埃希菌的检测程序,对四川荥经县采集的鸡肠样品中艾伯特埃希菌的携带情况进行检测,了解该地区家禽中艾伯特埃希菌的携带情况及菌株特征。方法 采集荥经县农贸市场、棒棒鸡店铺、活鸡宰杀点的新鲜鸡肠样品163份,按照艾伯特埃希菌的检测程序对样品进行检测,鸡肠内容物经EC肉汤增菌后,PCR检测eae基因,eae阳性样品的增菌液接种于麦康凯琼脂,37 ℃,24 h培养后挑取不发酵乳糖、eae阳性的疑似菌株,使用多重PCR检测及多位点序列分析（MLST）对疑似菌株进行鉴定。结果 自贡市疾病预防控制中心编制的艾伯特埃希菌的检测程序可行有效,在荥经县共采集了新鲜的鸡肠样163份品,从3份样品中分离到3株疑似艾伯特埃希菌菌株,经多重PCR检测及多位点序列分析（MLST）鉴定,3株疑似菌株均为艾伯特埃希菌。本次采集的样品艾伯特埃希菌的检出率为1.84%（3/163）。结论 四川荥经县地区鸡肠中存在艾伯特埃希菌,分离到的菌株丰富了艾伯特埃希菌生物学特征、流行病特征研究的菌株数据库。     

细胞分裂周期素25A影响放射线照射后HEp-2细胞的G_2/M期阻滞及凋亡

目的:研究放射线照射后HEp-2细胞的G2/M期阻滞与细胞分裂周期素(CDC)25A表达的相关性及过表达CDC25A蛋白对细胞周期及凋亡的影响。方法:通过流式细胞仪和Western blot方法检测4Gy X线照射后在不同时间点细胞周期及CDC25A蛋白含量;经脂质体转染pEGFP-N1-CDC25A质粒的HEp-2细胞为CDC25A组,转染pEGFP-N1质粒的为空载对照组,通过实时荧光定量PCR法检测这两组细胞中CDC25A的mRNA含量以鉴定转染效率;通过流式细胞仪检测CDC25A组和空载对照组细胞经4Gy放射线照射后细胞周期和细胞凋亡率;通过MTT法检测两组细胞的存活曲线。结果:放射线照射后G2/M期在细胞周期中的比例与CDC25A蛋白含量成正相关;CDC25A组细胞的CDC25A mRNA含量为空载对照组的15倍;过表达CDC25A联合4Gy放射线照射可废除G1/S关卡阻滞,促进G2/M期聚集和提前进入有丝分裂,可导致细胞凋亡增加和细胞存活率降低。结论:CDC25A的含量与G2/M期的比例正相关,调控CDC25A的表达可影响放射线照射后肿瘤细胞的细胞周期和凋亡水平。     

人CDC2基因的克隆和原核表达及鉴定

目的：从人肝癌组织中克隆出人细胞分裂周期基因2（ CDC2）,并在大肠杆菌中表达CDC2蛋白。方法：从人肝癌组织中提取RNA,采用RT-PCR法扩增CDC2 cDNA,用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收RT-PCR产物,将RT-PCR产物插入pET28a(+)载体NdeⅠ和 XhoⅠ两酶切位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导表达人CDC2蛋白。结果：RT-PCR扩增出约894 bp的DNA片段,与GenBank中的CDC2基因序列完全一致。经限制性内切图谱和测序鉴定,成功构建了pET28a(+)/CDC2原核表达载体。SDS-PAGE分析结果显示人CDC2蛋白在大肠杆菌中得已表达。结论：从人肝癌组织中成功地扩增出CDC2基因,并在大肠杆菌中表达。     

HAX-1对MRL/lpr小鼠狼疮活动性影响的研究

目的 观察抗凋亡蛋白HAX-1对MRL/lpr狼疮鼠狼疮活动性的影响.方法 重组腺病毒AdHAX-1经腹腔注射MRL/lpr小鼠,每周2次,连续注射4周.分别在注射前、注射2周后及4周后检测小鼠血清中抗核抗体(ANA)、循环免疫复合物(CIC)、抗双链DNA抗体(抗dsDNA抗体)、抗组蛋白抗体和干扰素γ(IFN-γ)水平,并检测注射前及注射后外周血的白细胞计数及尿蛋白水平;经RNAi使HAX-1表达下调后,观察脾脏淋巴细胞的增殖以及IFN-γ的分泌水平.结果 HAX-1可使MRL/lpr小鼠的尿蛋白以及抗dsDNA抗体、ANA、抗组蛋白抗体、CIC明显升高,且产生IFN-γ水平升高,除抗组蛋白抗体及CIC外,其余指标与磷酸盐缓冲液对照组(PBS组)及对照腺病毒组(AdEGFP组)相比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).重组腺病毒组(AdHax-1组)小鼠肾小球内免疫复合物沉积强度明显较强且阳性肾小球数目较多,与对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).AdHax-1组肾小球的平均病变积分达1.50±0.34,与对照组(PBS组:0.67±0.14;AdEGFP组:0.81±0.26)比较差异均有统计学意义(均P＜0.01).pGenesil-HAX-1可使淋巴细胞的增殖率明显降低(P＜0.05),IFN-γ分泌水平明显下降(P＜0.01).结论 HAX-1是调节系统性红斑狼疮淋巴细胞凋亡的一个重要因素,重组AdHAX-1可使MRL/lpr小鼠狼疮样症状加重,下调HAX-1表达可使病情减轻.