异体表皮细胞和成纤维细胞库的建立

目的 寻找表皮细胞和成纤维细胞体外培养、鉴定、冻存与复苏的可行方法.方法 酶消化法分离表皮细胞和成纤维细胞,分别进行原代、传代培养,并对细胞进行冻存与复苏.表皮细胞进行广谱角蛋白-异硫氰酸荧光素(PAN-FITC)免疫荧光染色,成纤维细胞行波形蛋白-FITC免疫荧光染色.结果 表皮细胞呈克降样增长,以后细胞逐渐互相融合.PAN-FITC染色均为阳性.成纤维细胞的体外生长活力强,波形蛋白-FITC染色呈阳性.结论 酶消化法是表皮细胞和成纤维细胞体外培养的重要方法,本实验为构建组织工程皮肤奠定了基础.     

茶多酚对原代培养的大鼠皮肤角朊细胞和成纤维细胞生长的 …

目的 探讨茶我酚对原代培养的皮肤角朊细胞和成纤维细胞生长作用的影响。方法 利用原代２的两种主要的皮肤细胞－－角朊细胞和成纤维细胞,采用丙酮酸比色法、ＴＢＡ比色法和ＤＴＮＢ（双硫代对硝基苯甲酸）法测定细胞２的上清液胞浆酶（ＬＤＨ）释放情况,脂质氧化产物（ＭＤＡ）、谷胱甘这氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）,并测定培养细胞的生长情况,对茶多酚在皮肤中可能起到的作用进行评价。结果 在加入茶多酚后不同时间地多数发现     

衰老真皮成纤维细胞胶原基因调控研究

目的 针对衰老真皮成纤维细胞胶原基因表达减少的特点，应用胎儿皮肤源性活性蛋白（ＳＣＦ）进行调控，以增加胶原基因的表达。方法 应用真皮成纤维细胞增养、胶原基因ｍＲＮＡ裂隙杂交和图像分析技术，观察胎儿皮肤源性活性蛋白对真皮胶原基因的调控作用。结果 以Ａｃｔｉｎ作为对照，ＳＣＦ对老年人成纤维细胞胶原基因有明显的调控作用，可以使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达增加，处理后，Ⅰ型胶原基因表达增加１５０％，Ⅲ型胶原基因增     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

皮肤成纤维细胞培养的体会

国内已有一些科研单位开展了皮肤成纤维细胞的培养技术〔１〕，因其在核型分析中稳定性好，并能够表达其来源个体的基因组中与代谢有关的绝大多数基因，利用理化方法予以检测。此外皮肤组织取材方便、安全，易为患者接受，可以动态观察，细胞株可储存备用，故有着重要的实...     

自体成纤维细胞注射移植对衰老模型鼠皮肤结构的影响

目的:探讨自体成纤维细胞注射移植对衰老模型鼠皮肤结构的影响.方法:切取大鼠背部全层皮肤培养成纤维细胞,同时给大鼠注射定量的D-半乳糖促使其衰老即建立衰老模型,最后在衰老模型上注射移植培养的自体成纤维细胞,用显微镜观察鼠皮肤组织切片,图像分析仪计算胶原面积比值和测量真皮及皮下组织的厚度,并对所得数据进行统计学分析.结果:移植的成纤维细胞存活;细胞注射1个月时,实验组和对照组的胶原面积比值和真皮厚度相比差异无统计学意义(P＞0.05),2个月时,实验组和对照组的胶原面积比值和真皮厚度相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论:移植的自体成纤维细胞能够存活并分泌胶原细胞,增加皮肤厚度,使皮肤外观丰满.     

表皮生长因子对角膜成纤维细胞生长的影响

目的　研究表皮生长因子 (EpidermalGrowthFactor,EGF)对角膜成纤维细胞生长的影响。方法　通过含不同浓度EGF的培养基培养角膜成纤维细胞 ,分别于 2 4、48和 72h用 0 .5 %台盼蓝法对每组进行细胞活力的测定。结果　 0 .1、1.0mg/L的EGF在细胞培养 48、72h后对细胞生长有一定的促进作用 (P <0 .0 5 ) ,但在 2 4h时对细胞生长无明显影响 (P >0 .0 5 )。浓度为 0 .0 1mg/L的EGF对角膜成纤维细胞生长无明显影响 (P >0 .0 5 )。结论　一定浓度的EGF对角膜成纤维细胞的生长具有促进作用     

人表皮细胞在牛胶原膜粘附、生长及分化的研究

目的在牛胶原膜中植入胎儿表皮细胞和成纤维细胞，构建人工复合皮替代物，以研究细胞的粘附、生长、分化及真表皮间的相互作用。方法(1)酶消化法培养胎儿表皮细胞和成纤维细胞；(2)制备人工复合皮，接种表皮细胞后于不同时间通过HE染色和扫描电镜观察细胞的形态和数量变化；(3)透射电镜观察该复合皮中细胞的结构；(4)裸鼠移植试验验证该复合皮的作用。结果(1)该人工复合皮具有一定的弹性，可出现较明显的细胞增殖，未见人工复合皮收缩现象。(2)HE染色和扫描电镜下可见随培养时间的延长，成纤维细胞和表皮细胞逐渐增多，表皮细胞可发生分化。并逐渐分层。(3)透射电镜下见成纤维细胞和表皮细胞功能活跃。(4)裸鼠移植试验证实该人工皮可起到覆盖创面防止感染的作用。结论该人工复合皮基本具备了正常皮肤的结构和功能，可作为移植物覆盖全层皮肤损伤。     

增生性瘢痕成纤维细胞生长特性的研究

目的：研究增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长特性的差异。方法：应用消化法建立成纤维细胞系，在倒置相差显微镜下观察细胞形态，应用细胞计数方法绘制细胞生长曲线，测定细胞生长速度。结果：增生性瘢痕成纤维细胞比正常皮肤成纤维细胞胞体大，形态不规则。前者细胞倍增时间约为6d，后者细胞倍增时间为3d。细胞融合后前者细胞数为后者的56％。结论：增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞是两种不同基因表现型的细胞。     

表皮细胞和成纤维细胞在异种无细胞真皮上的生长和增殖

及时封密创面是烧伤治疗的关键,但大面积深度烧伤患者常存在自体皮源不足的问题.近年来,组织工程技术的应用为提供充足的皮源带来了希望,如在胶原-GAG(氨基葡聚糖)膜及PGA/PGL(聚羟基乙酸/聚乳酸)网上种植表皮细胞和(或)成纤维细胞,经体外培养后可形成复合皮,并初步用于烧伤创面的修复.本研究观察了表皮细胞和成纤维细胞种植于无细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)上的生长和增殖情况,为进一步移植试验奠定基础.     

TGF—β1对小鼠表皮细胞生长动力学影响的研究

目的探讨离体培养条件下TGF-β1对小鼠表皮细胞生长动力学的影响。方法分离培养c-57小鼠表皮细胞,以每孔5×10^4细胞接种于96孔板,培养72h后,（1）加入不同浓度的TGF—β1,观察其对表皮细胞生长的抑制作用;（2）加入不同浓度抑制剂SB431542,30min后加入10μg／mL TGF-β1,观察其对TGF—β1的拮抗作用。以XTT法测定细胞增殖曲线。以Brdu标记,用DAKO-Brdurd单克隆抗体共孵育,用荧光标记免抗鼠二抗显色,用PI衬染,流式细胞仪分析,计算不同细胞周期比率和细胞周期时间。结果TGF-β1可抑制小鼠表皮细胞的增殖,并有浓度依赖性,且作用时间越长,抑制作用越显著。SB431542能拮抗TGF-β1对表皮细胞的抑制作用,且当10-5mol／L时拮抗作用最强。流式细胞仪分析显示,用10μg,mLTGF-β1作用52h后,G0/G1期细胞百分率显著增加（从47％增加到78％）,Brdu阳性百分率下降95％,Brdu阳性细胞的下降与S期细胞下降平行。结论培养条件下TGF-β1可以使小鼠表皮细胞生长停止于G0／G1期,具有抑制细胞增殖的作用。SB431542可以拮抗TGF-β1对小鼠表皮细胞生长的抑制作用。     

增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较

【目的】探讨增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异以及EGF、PDGF和bFGF对其的影响。【方法】测定细胞生长曲线;应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。【结果】增生性瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢;胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。EGF、PDGF和bFGF均对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用。EGF和bFGF可减少增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白合成,PDGF可以使两种成纤维细胞的胶原蛋白合成增加。【结论】增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞,它具有自己特殊的生物学特性。EGF、PDGF和bFGF在增生性瘢痕的形成过程中可能具有重要作用。     

皮肤皮纤维细胞收缩功能的研究

利用细胞培养技术，观察人体皮肤成纤维细胞收缩功能与年龄的关系，结果显示，在儿童期随年龄增长，成纤维细胞收缩功能增强；成年人成纤维细胞收缩功能均较儿童强，但与年龄变化无关。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染人表皮细胞的免疫细胞化学研究

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体(pEGFP-C3-bFGF)转染体外培养的人表皮细胞后细胞表型的变化. 方法:通过脂质体(Lipofectamine TM2000)转染法,将pEGFP-C3-bFGF转染至人表皮细胞系(HEKa细胞)中,36h后采用免疫细胞化学染色法检测分析β1整联蛋白、CK19、CK14及CK10在表皮细胞中表达的变化,同时以pEGFP-C3质粒转染的表皮细胞作为对照. 结果:实验组细胞中CK19、CK14的表达增强, 而CK10作为终末分化细胞的标志表达减弱. 结论:pEGFP-C3-bFGF转染后,分化成熟的表皮细胞向幼稚型细胞方向发生去分化,为探讨 bFGF调控表皮细胞去分化的分子机制提供实验参考.     

KGF在成纤维细胞促进表皮细胞增殖中的作用

目的  研究成纤维细胞产生的角质细胞生长因子（KGF）对表皮细胞增殖的影响。方法  自包皮分离培养成纤维细胞和表皮细胞,采用逆转录-聚合酶链反应法(RT PCR)、酶联免疫吸附法(ELISA)、MTT法和免疫荧光等方法分别检测成纤维细胞KGF基因的转录水平、培养液中KGF的浓度、成纤维细胞培养液对表皮细胞增殖的促进作用。结果  RT-PCR结果显示,成纤维细胞中KGF转录水平显著,ELISA法可检测到成纤维细胞培养液中存在较高水平的KGF,细胞计数结果和MTT结果表明,含有KGF的成纤维细胞培养液能够促进表皮细胞增殖,保持表皮细胞的活性,免疫荧光观察到KGF与表皮细胞表面的特异性受体结合。结论  成纤维细胞能够合成和分泌较高水平的KGF,成为其促进表皮细胞增殖的重要因素。     

雪旺氏细胞和成纤维细胞体外培养的实验研究

目的：本实验通过雪旺氏细胞（Ｓｃ）和成纤维细胞（Ｆｂ）不同培养方法的研究来获得不同比例共存的雪旺氏细胞和成纤维细胞。方法。分散培养（１）差速贴壁法。（２）阿糖胞苷自理法。观察（１）相差显微镜，（２）Ｓ－１００免疫细胞化学染色。（３）细胞计数。结果：被Ｓ－１００染色染上雪旺氏细胞在相差显微镜下观察到的活体雪旺氏细胞的开矿是一致的，细胞呈梭形，经差速壁法和阿糖包苷处理后３天雪旺氏细胞所占比例为９５％，     

生长因子在人肌腱细胞和皮肤成纤维细胞中的表达差异

目的对几种重要的生长因子在正常人体皮肤、肌腱中的表达差异进行研究.方法体外培养人肌腱细胞和人皮肤成纤维细胞,观察细胞的形态特点;用基因芯片、免疫组化、免疫细胞化学、RT-PCR的方法对肌腱细胞和成纤维细胞的几种生长因子进行检测及比较.结果所测生长因子中除转化生长因子-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)、类胰岛素生长因子-结合蛋白3(IGFBP3)外,其余在肌腱细胞和成纤维细胞中的表达均无明显的差异.结论人成纤维细胞与人肌腱细胞的生长因子表达基本相似,通过对皮肤成纤维细胞的某些特性的改造,可以使其成为构建组织工程化肌腱的种子细胞.     

IL-13对正常人表皮成纤维细胞产生炎症因子作用的实验研究

目的探讨白介素-13（IL-13）对正常人表皮成纤维细胞（NHDF）产生炎症因子的影响。方法使用不同浓度IL-13（0.1、1、10ng/ml）刺激体外培养的NHDF,应用ELISA方法检测IL-13刺激NHDF24h后,白介素-6（IL-6）,白介素-8（IL-8）,巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）的蛋白表达水平。结果0.1ng/mlIL-13刺激下,IL-6、MCP-1和Eotaxin的蛋白表达水平分别为（727.33±39.88）pg/ml、（414.67±13.01）pg/ml、（124.67±8.67）pg/ml;1ng/mlIL-13刺激下,分别为（1222.50±49.95）pg/ml、（705.33±25.15）pg/ml、（205.33±16.59）pg/ml;10ng/mlIL-13刺激下,分别为（1502.83±5.31）pg/ml、（1329.17±56.08）pg/ml、（457.50±15.32）pg/ml,均明显高于对照组[（283.50±15.86）pg/ml、（205.17±3.76）pg/ml、（13.50±5.01）pg/ml,P〈0.05或0.01],并具有浓度依赖性。IL-8蛋白表达水平与对照组无显著性差异（P〉0.05）。结论IL-13可刺激NHDF产生IL-6、MCP-1和Eotaxin,这些炎症因子的大量表达可能参与了IL-13在皮肤组织纤维化过程中的病理性作用。     

自体皮肤组织培养的实验研究

本研究应用不同来源皮肤组织进行表皮细胞培养获得成功，其结果证明：应用组织块培养成功率高，接种后２４小时后细胞开始生长，２－３周表皮细胞融合连片，表皮细胞层达５－６层，可用于临床，同时还发现，应用胶原做底层，表皮细胞生长快，融合连片快，在表皮细胞生长的同时成纤维细胞也生长，且生长速度快，阻碍表皮细胞的生长，用０．２５％胰蛋白酶与０．１％ＥＤＴＡ２：１混合液去除成纤维细胞效果较好，是细胞培养获得成功的     

敦煌养颜膏对衰老皮肤成纤维细胞含量的影响

目的 研究敦煌养颜膏对老龄大鼠皮肤成纤维细胞含量的影响,了解其延缓皮肤衰老的作用机理.方法 本实验将实验动物分为4组,每组10只.其中30只为SPF级SD雌性自然衰老老龄大鼠,随机分为药物治疗组、阳性对照组和模型对照组3组;另取SPF级SD雌性青龄大鼠10只,作为正常对照组.将前3组大鼠背部脱毛后分别涂抹敦煌养颜膏、维生素E胶丸和敦煌养颜膏基质,连续涂抹30天后将全部大鼠颈椎脱臼处死,取背部受试皮肤,消化后测定OD值,评价敦煌养颜膏延缓皮肤衰老的作用.结果 与模型对照组比较,其余各组的成纤维细胞含量均有显著性差异(P<0.01);药物治疗组与阳性对照组比较,成纤维细胞含量也有显著性差异(P<0.05);药物治疗组与正常对照组比较,成纤维细胞含量基本接近,无显著性差异(P>0.05).结论 敦煌养颜膏能明显提高老龄大鼠皮肤中成纤维细胞的含量,提高其分泌胶原蛋白和弹性蛋白的能力,从而改善皮肤衰老症状,恢复皮肤弹性与活力,达到延缓皮肤衰老的目的 .